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1、厌氧菌的培养方法厌氧菌的培养方法 祁红兵1n物理方法包括遮断空气法、煮沸法、真空法、空气置换法、气体喷射法或转管法等n化学方法包括焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险粉法等 n生物学方法包括与需氧菌共生好氧法、燕麦发芽法等 n混合法包括厌氧罐（袋）法、厌氧手套箱法或厌氧室法、空气置换铁丝绒法、空气置换钯粒法等。 21 液体培养基的厌氧培养法液体培养基的厌氧培养法n培养基煮沸：驱气后置流水中急速冷却 n添加还原剂： 0.030.05L-盐酸半胱氨酸 0.010.02硫乙醇钠 0.51葡萄糖 0.1抗坏血酸 其它还原剂 n添加琼脂 32 固体培养基的厌氧培养法固体培养基的厌氧培养法n厌氧罐法 n简易厌氧
2、罐和厌氧袋法 n钢丝绒法 n焦性没食子酸法n抽气换气厌氧培养法 n生物好氧厌氧培养法 n转管技术和气体喷射培养法 n厌氧手套箱法 （又称厌氧室法） 42.1 Gas-pak法5 原理气体发生袋： 柠檬酸和碳酸氢钠 H2O CO2 硼氢化钠 H2O H2 触媒 ： 钯粒 H2O 厌氧罐中的O2 厌氧指示剂 111116 厌氧指示剂 n亚甲基兰 指示剂n卢卡斯固体厌氧指示剂 n布鲁氏指示剂 7 亚甲基兰 指示剂n6葡萄糖水溶液 2n0.1N氢氧化钠水溶液 0.1n0.05亚甲基兰水溶液 0.2 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色 8卢卡斯固体厌氧指示剂 n2硼砂溶液 5毫升n9硫乙醇酸 1毫升n酚红溶液
3、 0.10.2毫升n0.02美兰溶液 10毫升n琼脂 1 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色9 布鲁氏指示剂 n60羟甲基氨基甲酯 1n4葡萄糖 1n0.02美蓝 1 厌氧 无色 残存有氧气 蓝色10Gas-Pak罐的使用操作程序 n平皿培养基装入平皿架中置厌氧罐内；n打开内盖居中金属网袋，装入触媒钯粒；n打开锡箔纸袋，取出厌氧指示剂片；n剪开气体发生袋一角，注入10毫升水，迅速紧闭罐盖，置培养箱中培养。n约经510分钟后，放入厌氧指示剂片。112.2.1 简易厌氧罐 干燥器容内径（厘米） 容器1 容器2 容器3 容积（毫升） 硼氢钠 氯化钴 0.2克 柠檬酸0.6克 15cm（约2150毫升） 或
4、 和 0.6克 钯粒1.5克 碳酸氢钠0.7克18cm（约3500毫升） 硼氢钠 氯化钴0.33克 柠檬酸1克 或 和 1克 钯粒2克 碳酸氢钠1.15克122.2.2 厌氧袋法 聚碳酸酯（复合塑料膜）制厌氧袋 n产气袋n厌氧指示剂n触媒 131415162.2.3 保险粉的厌氧罐培养法 n二亚硫酸钠（Na2S2O4） 碳酸氢钠 无水硫酸钠 n不用触媒172.3 钢丝绒法 酸性硫酸铜溶液 钢(铁)丝绒 铜和铁的络合物 O2 厌氧指示剂 18n酸性硫酸铜溶液： 将自来水1升加硫酸铜60g，吐温-80 20ml，加热溶解后，又加入2N的硫酸90ml，最后加水至6升 ；n方法： 取56g钢丝绒/ L
5、，于11.5升酸性硫酸铜溶液浸泡3060s，钢丝绒变成红铜色，挤净液体置铝质或玻璃容器中，放入厌氧罐内。随后将厌氧指示剂放入，密封厌氧罐，14h后可达厌氧状态 192.4 焦性没食子酸法 焦性末食子酸粉末，NaHCO3或NaOH溶液 无菌玻片 已接种细菌的平板倒扣在上面 融化的白蜡封边202.5 抽气换气厌氧培养法 n玻璃干燥罐 n混合气钢瓶: 10二氧化碳、10的氢气、80的氮气 n三通阀n触媒:钯粒 / 浸泡钢丝绒 / 氯化钴 n厌氧指示剂211：厌氧培养罐 2：混合气体（CO2：H2：N2=1：1：8）钢瓶3：压力表 4：三通阀 5：缓冲瓶 6：真空泵222.6 生物好氧厌氧培养法 n疱
6、肉培养基: 牛肉渣 0.5g 牛肉浸液 7ml 液面上加盖34mm厚的融化凡士林，灭菌。n生物好氧厌氧培养方法 232.7 转管技术和气体喷射培养法 360钢瓶进气 铜柱 除氧气体 （亮黄色）微量O2 H2源 CuO （黑色） 接种或移植242.8厌氧手套箱法n又称厌氧室法25263 厌氧培养方法的选择厌氧培养方法的选择n亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技术、气体喷射培养法 n厌氧手套箱培养法 用于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正常菌群）的研究工作 n厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养方法 不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检验工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。 2
7、74 厌氧菌的保存厌氧菌的保存4.1继代保存： 以GAM半固体流动培养基和TEP半固体培养基作传代培养保存。用毛细吸管吸菌进行继代培养，使用白金接种环移菌接种，可以避免有的菌在操作中接触空气或氧化物而死亡。数周作一次继代培养。新分离的的菌种，在几个月内，每34星期传代一次。被保存的菌种，放室温下暗处。最好是不同菌用不同培养基保存。 28 4.2 冷冻保存： 20脱脂牛奶0.5ml分注在带螺旋塞的玻璃瓶中，经110、15分钟高压灭菌，冷却后，先用毛细吸管取半固体高层培养基2448h生长茂盛部位的厌氧菌液0.5ml，加入玻璃瓶中，直接置于80冰库中保存。 厌氧菌较理想的保存方法是液氮保存法。厌氧菌较理想的保存方法是液氮保存法。将将108以上浓菌液置脱纤维羊血、脱纤维兔血以上浓菌液置脱纤维羊血、脱纤维兔血或羊血牛奶各半的分散剂中，先在干冰中预或羊血牛奶各半的分散剂中，先在干冰中预冻，然后连容器一起放入液氮罐中。冻，然后连容器一起放入液氮罐中。29 谢谢30
