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1、分子诊断室工程引见内 容1.HBV-DNA荧光定量荧光定量PCR2.流式根本运用流式根本运用3.染色体核型分析染色体核型分析HBV DNA荧光定量PCRPCR技术简介1985年美国年美国PE-cetus公司的人类遗传研讨室公司的人类遗传研讨室mullis等人发明了具有划时代意义的等人发明了具有划时代意义的PCR技术，技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。成为现实。1988年年PE-cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCR热循环仪，热循环仪，从而使从而使PCR技术的自动化成为现实。技术的自动化成为现实。Mullis出因其杰出的
2、奉献与寡核苷酸基因定点诱变出因其杰出的奉献与寡核苷酸基因定点诱变的发明者的发明者Michael分享了分享了1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 随着随着PCR技术的日臻成熟技术的日臻成熟2019年出现荧光基因探年出现荧光基因探针杂交定量针杂交定量PCR方法方法PCR根本原理z类似DNA的体内复制，以单链DNA为模板，利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补链的过程。DNA 合成的必备要素合成的必备要素DNA Polymerase dNTPs single-stranded template primer定量定量PCRPCR概念概念z以外参或内参为规范，经过
3、对以外参或内参为规范，经过对PCRPCR终产物的分析或终产物的分析或PCRPCR过程的监过程的监测，对测，对PCRPCR起始模板量的定量起始模板量的定量常规常规PCRPCR与定量与定量PCRPCR的比较的比较实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理z指在指在PCR反响体系中参与反响体系中参与荧光基光基团,利用利用荧光信号光信号的的积累累实时监测PCR进程，最后程，最后经过规范曲范曲线对未知模板未知模板进展定量分析。展定量分析。zCtcycle threshold)值定定义：每个反响管的：每个反响管的荧光信号到达光信号到达设定的定的阈值时所所阅历的循的循环数。数。z荧光光阈值threshol
4、d)的缺省的缺省设置是置是3-15个循个循环的的荧光信号的光信号的规范偏向的范偏向的10倍，即：倍，即：z threshold=10SD cycle0-15CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系z每个模板的每个模板的CtCt值与该模板的起始拷贝数的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，对数存在线性关系，起始模板数越多，CtCt值越小，利用知起始拷贝数的规范品作出值越小，利用知起始拷贝数的规范品作出规范曲线，只需获得未知样品的规范曲线，只需获得未知样品的CtCt值，即值，即可从规范曲线上计算出该样品的起始拷贝可从规范曲线上计算出该样品的起始拷贝数。数。荧光定量的规范曲线
5、荧光定量的规范曲线 规范曲线未知标本Crossing Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target38荧光检测方式z1SYBR Green I 染料z2水解探针Taqman z3杂交探针Hybridization Probesz4分子信标molecular beacon)z 发夹引物sunrise primer)z 蝎状引物scorpion primer)z 复合探针complex probes)探探针的的5端端标志一个志一个荧光基光基团，3标志另一个志另一个荧光基光基团。5端端荧光基光基团吸收能量后将吸收能量后将能
6、量能量转移移给临近的近的3端端荧光光淬淬灭基基团FRET，正常，正常情况下情况下检测不到不到该探探针5端端荧光基光基团发出的出的荧光信号。光信号。Taqman探针原理当当溶溶液液中中模模板板变变性性后后低低温温退退火火时时，引引物物与与探探针针同同时时与与模模板板结结合合。在在引引物物的的介介导导下下，Taq酶酶沿沿模模板板向向前前合合成成子子链链，当当延延伸伸至至探探针针结结合合处处，发发生生链链的的置置换；换；Taqman探针原理Taqman探针原理Taq酶的的53外外切切酶活活性性将将探探针5端端衔接接的的荧光光基基团从从探探针上上切切割割下下来来，游游离离于于反反响响体体系系中中，从从
7、而而脱脱离离3端端荧光光淬淬灭基基团的的屏屏蔽蔽，发出出荧光光，荧光光信信号号与与PCR产物物的的数数量量成成比比例例。因因此此根根据据PCR反反响响液液的的荧光光强度度即即可可计算出初始模板的数量。算出初始模板的数量。定量定量PCR在乙肝检测中意义在乙肝检测中意义z1. 1. 判别疾病的严重程度和传染性判别疾病的严重程度和传染性z2. PCR2. PCR结果与血清免疫学结果的综合评价结果与血清免疫学结果的综合评价z3. 3. 察看抗病毒药物疗效，指点药物用量察看抗病毒药物疗效，指点药物用量z4. 4. 献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断z5. 5. 预测
8、病情、判别预后预测病情、判别预后z6. 6. 器官移植、母婴垂直传播器官移植、母婴垂直传播标本留取及检测步骤标本留取及检测步骤z标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本防止溶血和脂血。z检测步骤：1.反响液配制z 2.核酸提取 z 3.核酸扩增z结果分析：采用样点拟合法，由规范曲线得到病毒的拷贝或IU/ML。z1.1.分分区区操操作作：PCRPCR具具有有超超敏敏感感性性，因因此此在在检检测测过过程程中中应应分分区区操操作作，即即分分为为试试剂剂预预备备区区，样品处置区，样品处置区，PCRPCR扩增区。扩增区。z2.2.实实验验前前实实验验室室应应运运用用紫紫外外消消毒毒至至少少3030分分钟。钟
9、。z3.3.操操作作时时戴戴一一次次性性手手套套，加加样样头头要要求求及及时时改换，吸液时防止飞溅。改换，吸液时防止飞溅。本卷须知z4.4.每每天天实实验验前前，在在废废物物缸缸内内套套上上塑塑料料袋袋，参参与与半半缸缸含含有有效效氯氯1%1%次次氯氯酸酸钠钠液液，实实验验时时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。z5.5.一一切切试试剂剂实实验验前前充充分分融融化化，防防止止反反复复冻冻融。融。z6.6.每次每次PCRPCR反响均应设立阴阳性对照。反响均应设立阴阳性对照。本卷须知 流式根本运用 流式细胞术的概念流式细胞术的概念=流式细胞术流式细胞术Flow Cyto
10、metry, Flow Cytometry, 简称简称FCMFCM是一种可以快是一种可以快速、准确、客观，并且可以同时检测快速直线流动形状中速、准确、客观，并且可以同时检测快速直线流动形状中的单个微粒通常是细胞的多项特性，并加以定量的技的单个微粒通常是细胞的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选术，同时可以对特定群体加以分选=研讨对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微研讨对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等球等=研讨的微粒特性包括多种物理及生物学特征研讨的微粒特性包括多种物理及生物学特征流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞构造细胞构造细胞大小细胞大
11、小细胞颗粒度细胞颗粒度细胞外表面积细胞外表面积核浆比例核浆比例DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期RNARNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能细胞外表细胞外表/ /胞浆胞浆/ /核的核的特异性抗原特异性抗原细胞活性细胞活性细胞内细胞因子细胞内细胞因子酶活性酶活性激素结合位点激素结合位点细胞受体细胞受体散射光信号散射光信号Right Angle Light Detector Right Angle Light Detector Cell Complexity Cell ComplexitySSCSSCForward Light Detector Forward Light Det
12、ector Cell Surface Area Cell Surface Area FSC FSCIncident Incident Light Light SourceSource=前向角散射光前向角散射光FSC, Forward ScatterFSC, Forward Scatter=细胞相对大小及其外表积细胞相对大小及其外表积 =侧向角散射光侧向角散射光SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter=细胞颗粒度及细胞内细胞器的相细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性对复杂性外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图红细胞溶解后红细胞溶解后荧光信号荧光信号
13、z运用荧光标志的单克隆抗体染色，做多运用荧光标志的单克隆抗体染色，做多色分析色分析z荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量达含量数据分析数据分析=数据显示数据显示: : =直方图直方图 ( ( Histogram )Histogram )=二维点图二维点图(Dot (Dot Plot)Plot)=等高线图等高线图(Contour (Contour Plot)Plot)=密度图密度图 (Density) (Density)=三维图三维图3D Plot3D Plot流式的临床运用流式的临床运用=淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋
14、巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数网织红细胞计数=细胞移植的免疫形状监测细胞移植的免疫形状监测=干细胞计数干细胞计数=阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿=HLA-B27HLA-B27检查检查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病=HIVHIV免疫分型，免疫分型，CD4CD4绝对计数绝对计数淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析z运用经荧光素标志的特异单克隆抗体，进运用经荧光素标志的特异单克隆抗体，进展多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种展多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原白细胞分化抗原CDCD分子的表达，可以分子的表达，可以将淋巴细胞亚群区
15、分开，进展定性分析将淋巴细胞亚群区分开，进展定性分析z各淋巴细胞亚群的百分含量各淋巴细胞亚群的百分含量z淋巴细胞亚群的绝对计数，进展定量分析淋巴细胞亚群的绝对计数，进展定量分析z根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为zB B淋巴细胞淋巴细胞CD19+CD19+，与体液免疫有关，与体液免疫有关zT T淋巴细胞淋巴细胞CD3+CD3+，与细胞免疫有关，与细胞免疫有关z总总T T和总和总B B可以用来判别某些免疫缺陷和本身可以用来判别某些免疫缺陷和本身免疫性疾病免疫性疾病 zNKNK细胞细胞CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+，行使免疫监控功，行使免疫监控功能，可以介导对某
16、些肿瘤细胞和病毒感染细能，可以介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。胞的细胞毒性作用。y根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为yT T辅助辅助/ /诱导细胞诱导细胞CD3+CD4+CD3+CD4+，即，即 Th/Ti Th/TiyT T抑制抑制/ /细胞毒性细胞细胞毒性细胞CD3+CD8+CD3+CD8+, ,即即 Ts/Tc Ts/TcyTh/TsTh/Ts比值比值 可用于评价本身免疫失调、被疑可用于评价本身免疫失调、被疑心是免疫失调或知患有免疫缺陷的病人的免疫心是免疫失调或知患有免疫缺陷的病人的免疫形状形状临床意义z诊断原发性免疫缺陷病如
17、先天性无诊断原发性免疫缺陷病如先天性无 r 球蛋白血球蛋白血症或继发性免疫缺陷病如症或继发性免疫缺陷病如AIDSz造血干细胞移植后免疫重建造血干细胞移植后免疫重建6个月个月NK ；9个月个月T、B zTh/Ts ：机体免疫功能亢进：本身免疫性疾病，：机体免疫功能亢进：本身免疫性疾病，如如SLE、类风湿性关节炎等治疗有效恢复正常、类风湿性关节炎等治疗有效恢复正常zTh/Ts ：机体免疫功能低下：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等肿瘤等临床意义z移植后动态免疫监测：移植后动态免疫监测：z急排临床
18、病症出现前急排临床病症出现前1-51-5天，活化天，活化T T和和Th/TsTh/Ts继续继续 ，1.21.2预示急排；预示急排；zTh/TsTh/Ts继续继续 阐明能够感染，比值阐明能够感染，比值1.081.08，能够性，能够性大，大，0.20.2应停用免疫抑制剂；应停用免疫抑制剂；z实体肿瘤疗效和病人免疫形状察看实体肿瘤疗效和病人免疫形状察看z治疗前常伴治疗前常伴T T 、Th/TsTh/Ts ，放，放/ /化疗有效可恢复；化疗有效可恢复；z淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；后常较好；z探求疾病发病机理、进程和预后炎症、肿瘤探求疾
19、病发病机理、进程和预后炎症、肿瘤淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析先天性无先天性无 r 球蛋白血症球蛋白血症淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析HLA-B27 HLA-B27是是MHC I类抗原，在有核抗原，在有核细胞上广泛表达胞上广泛表达 HLA-B27的表达与的表达与强直性脊柱炎高度相关，超越直性脊柱炎高度相关，超越90%的的强直性脊柱炎患者直性脊柱炎患者HLA-B27阳性。阳性。其他，如其他，如Reiter s综和症阳性率和症阳性率70-90%，银屑病性关屑病性关节炎炎阳性率阳性率50-60%，葡萄膜炎阳性率，葡萄膜炎阳性率40-50%检测采用全血，无需分采用全血，无需分别淋巴
20、淋巴细胞，操作胞，操作简单，可以快速、，可以快速、灵敏、准确地分析灵敏、准确地分析HLA-B27。 结果果报告告检测的平均的平均荧光光强度，根据界度，根据界值断定，得到阴断定，得到阴性性/阳性阳性结果。果。实验的灵敏度的灵敏度为100%，特异性，特异性为97.5%。流式细胞仪的运用血液流式细胞仪的运用血液z 白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型z 造血干细胞计数造血干细胞计数z 阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿PNHPNH诊断诊断z 网织红细胞计数网织红细胞计数z 血小板分析血小板分析z血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达z血小板活化血小板活化z网织血小板分析网织血小板分析
21、流式细胞仪的运用肿瘤流式细胞仪的运用肿瘤z 细胞周期和倍体分析细胞周期和倍体分析z 肿瘤相关基因表达的研讨肿瘤相关基因表达的研讨z 抗肿瘤药物作用机制的研讨抗肿瘤药物作用机制的研讨z 放疗放疗/ /化疗疗效的研讨化疗疗效的研讨z 多药耐药基因的研讨多药耐药基因的研讨z 细胞凋亡的分析细胞凋亡的分析z凋亡细胞的分析凋亡细胞的分析z凋亡相关蛋白的分析凋亡相关蛋白的分析流式标本留取z 紫色盖试管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。 不能有凝块。z 单细胞悬液细胞数不少于106个。 染色体核型分析染色体核型分析根本概念z染色体核型：指一个物种所特有的染色体数目和每一条染染色体核型：指一个物种所特有的染色
22、体数目和每一条染色体的形状特征。色体的形状特征。-人类体细胞中共有人类体细胞中共有2323对染色体，对染色体，2222对常染色体，一对性染色体。对常染色体，一对性染色体。z核型分析：将待测细胞的核型进展染色体数目、形状特征核型分析：将待测细胞的核型进展染色体数目、形状特征分析的过程称核型分析。如正常女性核型：分析的过程称核型分析。如正常女性核型：46,XX 46,XX 正常正常男性核型：男性核型：4646，XYXY。z核型方式图：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其核型方式图：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形状等特征陈列起来的图像。特征绘制下来，再按长短、形状
23、等特征陈列起来的图像。染色体方式图人类23对染色体染色体编号(人X染色体)记述一特定带时，需求写明4个内容：染色体号，长短臂，区的号序和带的号序。这些内容按顺序写，不用间隔或加标点。假设某一带被再细分，在原带号数后加一小数点，编号原那么仍按从着丝粒往臂端序贯编号。如1p31.2代表一号染色体短臂3区1带第2亚带染色体标本常规制备染色体标本常规制备 z方法方法 ：中期染色体：中期染色体G带显色带显色z原理原理 ：采用秋水仙素处置培育的细胞，使：采用秋水仙素处置培育的细胞，使细胞停留在分裂中期，再用低渗液处置细细胞停留在分裂中期，再用低渗液处置细胞，使细胞胀大，以进展染色体制片。胞，使细胞胀大，以
24、进展染色体制片。G-带是标本片经过预处置后，用带是标本片经过预处置后，用Giemsa染色染色显示的带纹。显示的带纹。操作步骤z 细胞培育：胞培育： 细胞培育液胞培育液5mL含植物凝血含植物凝血素，加素，加 0.3mL肝素抗凝全血肝素抗凝全血37培育箱培育箱静置培育静置培育6872小小时。z 收收获细胞：胞： 终止培育前止培育前11.5小小时参与秋参与秋水仙素。水仙素。z 制片：低渗制片：低渗-预固定固定-固定固定-滴片滴片-枯燥老化枯燥老化z G-显带，图像分析：胰像分析：胰酶消化，消化， Giemsa染色，采集染色，采集图像，分析像，分析20-30个中期分裂相个中期分裂相核型描画z首先列出染
25、色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异常的染色体数目或形状。以下一致的命名符号：zA-G 染色体组的称号z1-22 染色体编号zX,Y 性染色体zdel 缺失zder 构造重排的染色体zdup 反复zinv 倒位zt 易位z+/- 在染色体符号前表示染色体添加或减少，在染色体符号后表示染色体多出或短少一部分检查顺应症及意义检查顺应症及意义z生殖功能妨碍z 在不孕症、多发性流产和畸胎等有生殖功能妨碍的妇夫中至少有7%10%是染色体异常的携带者。常见的有染色体构造异常如平衡易位和倒位以及数量异常如由于女性少一条X染色体呵斥的45，XO，或多一条Y染色体呵斥的47，XXY。平衡易位和倒位由于无基因
26、的丧失，携带者本身常并不发病，却可因其生殖细胞染色体异常而导致不孕症、流产和畸胎等生殖功能妨碍。性染色体数目异常除可呵斥不孕外，还常出现第二性征异常。 检查顺应症及意义检查顺应症及意义z第二性征异常者 z 如有原发性闭经、性发育不良，伴身体矮小、肘外翻、盾状胸和智力稍有低下,阴毛、腋毛少或缺如，后发际低，不育等，应思索能否有X染色体异常。常见的X染色体异常有特纳氏综合征和环形X染色体。特纳氏综合征患者比正常女性少一条X染色体，其染色体核型为：45，X0。环形X染色体患者由于某种缘由使X染色体两端同时出现断裂，并在断裂部位重接构成，环形染色体越小临床病症越重。早期发现这些异常并给予适当的治疗可使第二性征得到一定程度地改善，也能够获得生育才干。 检查顺应症及意义检查顺应症及意义z外生殖器两性畸形z 根据生殖器外观常难以正确决议性别的患者，经过性染色体的检查有助于做出明确诊断。 z先天性多发性畸形和智力低下的患儿z 染色体检查可发现有21-三体综合征等异常。z白血病及其它肿瘤患者z 如：慢性粒细胞白血病：Ph染色体是其标志染色体，由9号和22号染色体部份片段相互易位构成的。Ph染色体的出现为慢性粒细胞白血病确实诊目的，治疗过程中Ph染色体的出现或消逝，还可作为疗效和愈后的参考目的。46，XY，t(7:21) 47,XY,+2147,XXY46,XY,t(9;22)46，XY, r7
