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1、2010年版年版中国药典中国药典微生物微生物检验技术检验技术崔学文崔学文四川省食品药品检验所四川省食品药品检验所2010年年3月月中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学主要内容主要内容l一、一、药品微生物检验现状药品微生物检验现状l二、二、中国药典中国药典20102010年版微生物检验增修订年版微生物检验增修订 内容简介内容简介l三、三、微生物检查方法验证试验微生物检查方法验证试验中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学(一一)药品微生物检验现状药品微生物检验现状中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学药品质量标准【性状】【鉴别】【检查】无菌/微生物限度【含量测
2、定】药品微生物检验概况药品微生物检验概况中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学药品质量体系药品质量体系安全性安全性有效性有效性药品质量体系构成与相互关系可控性可控性中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学药品中污染的微生物通过微生物体及其分泌代谢产物导致机体过敏、中毒、感染等，严重的可以直接导致菌血症危及生命。此外，某些药品中污染微生物通过代谢活动改变药物组成、破坏有效成份而造成疗效改变或丧失。药品微生物检验概况药品微生物检验概况中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学所以，世界各国高度重视药品微生物检查，无菌/微生物限度检查均为各国药典中的重要内容。药品微生物
3、检验概况药品微生物检验概况中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学我国的微生物检验l无菌检查始于1953年新中国第一部药典（版）l微生物限度检查始于1972年 由来：1972年日商在进口我国的中成药中发现污染了大量细菌，同时还检出大肠杆菌，向我方提出交涉，引起我国政府的高度重视，于是我国开始了微生物限度检查工作，接着三部组织联合调查京津沪的中药厂，国务院为此发了73121号文件，要求加强管理提高中成药的质量药品微生物检验概况药品微生物检验概况中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学在中央和各地政府有关部门的关怀和重视下，经过我国药品微生物检验工作者几十年来的艰苦奋斗，我国药
4、品微生物检验工作不断发展，标准不断完善，逐步建立起了符合我国国情的药品微生物检验标准体系。至2010版中国药典，我国药品无菌、微生物限度检查方法和标准在科学性、合理性以及与国际接轨方面均有了长足进展，使我国药品无菌和微生物限度检查步入了一个崭新的时期。药品微生物检验概况药品微生物检验概况中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学近近3 3年来发生的药害事件年来发生的药害事件时间事件结果2006年5月“齐二药”亮菌甲素及其全线产品调查170批产品无菌检查合格，证明与微生物污染无关2006年7月“欣弗事件”微生物污染2007年1月“克林霉素磷酸酯”及“阿奇霉素”扩大调查克林107批7批无菌
5、不合格；阿奇 90批3批无菌不格。取缔两个品种的热力灭菌大体积液体制剂生产。2007年4月注射用甲氨喋呤及时排除微生物污染2008年10月“刺五加事件”及全线产品调查微生物污染2008年11月“茵栀黄事件”与微生物污染无关?2009年“双黄连注射液”有无微生物污染？中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学技术落后、标准化程度低；重要性被忽视、事故频繁！标准进步与标准化滞后的矛盾药品微生物检验现状药品微生物检验现状中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学无菌检查现状无菌检查现状1 1、方法的修订与完善、方法的修订与完善2 2、技术现状与标准化、技术现状与标准化3 3、无菌检查
6、的几个问题、无菌检查的几个问题中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学 1 1、方法的修订与完善、方法的修订与完善2005年版无菌检查法主要方面与USP、BP的比较比较项目ChP2005USP29BP2002检验条件规定总体10000级、局部100级无具体规定无具体规定人员要求无具体规定正确培训和认可细菌检查培养基硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基真菌检查培养基改良马丁培养基大豆胰酪胨培养基 大豆胰酪胨培养基 培养基灵敏度检查与方法验证用菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、黑曲霉检验方法只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法性
7、状允许的样品均可采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除稀释剂与薄膜过滤冲洗液0.1蛋白胨水溶液；pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液供试品处理中的其他内容A、D、K0.1蛋白胨水溶液（ 0.1（聚乙氧基乙醇、0.1吐温-80）；十四烷酸异丙酯培养条件与时间14天（+2；3天）不少于14天（+不少于4天）14天（7天）结果判断与复试规定一次结果为准 (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基Fluid Thiogly
8、collate MediumFluid Thioglycollate Medium药典药典USP29USP29EP-2001EP-2001中国药典中国药典-2005-2005名称名称Fluid Thioglycollate MediumFluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基Fluid Thioglycollate MediumFluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基Fluid Thioglycollate MediumFluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸盐流体
9、培养基硫乙醇酸盐流体培养基目的目的培养需氧、厌氧和微需氧微生物培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧和微需氧微生物培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧微生物培养需氧、厌氧微生物培养条件培养条件1414天于天于30-35 C30-35 C配方配方Pancreatic Digest of Casein(Pancreatic Digest of Casein(胰酪蛋白胨胰酪蛋白胨).15.0 g).15.0 gYeast Extract(Yeast Extract(酵母浸出粉酵母浸出粉) .5.0 g) .5.0 gDextr
10、ose(Dextrose(葡萄糖葡萄糖).5.5 g).5.5 gSodium Chloride(Sodium Chloride(氯化钠氯化钠).2.5 g).2.5 gL-Cystine( L-L-Cystine( L-胱氨酸胱氨酸) .0.5 g) .0.5 gSodium Thioglycollate (Sodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠硫乙醇酸钠).0.5 g).0.5 gAgar( Agar( 琼脂琼脂).0.75 g).0.75 gResazurin( Resazurin( 刃天青刃天青) .1.0 mg) .1.0 mgl2005年版无菌检查培养基与USP、
11、BP的比较1中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学大豆胰酪胨培养基大豆胰酪胨培养基(TSB)(TSB)改良马丁培养基改良马丁培养基药典药典USP29EP-2001中国药典中国药典2005版版名称名称Tryptic Soy Broth (Soybean casein digest medium)Soybean casein digest medium)大豆胰酪胨培养基大豆胰酪胨培养基改良马丁培养基改良马丁培养基配方配方Pancreatic digest of Casein (胰酪蛋白胨胰酪蛋白胨) ).7.0gPapaic Digest of Soybean Meal.3.0gSol
12、dium Chloride.5.0gDibasic Potassium Phosphate.2.5gDextrose monohydrate.2.5g蛋白胨蛋白胨.5.0g酵母浸出粉酵母浸出粉.2.0g葡萄糖葡萄糖.20.0g磷酸氢二钾磷酸氢二钾.1.0g硫酸镁硫酸镁(MgSO4.7H2O).0.5g目的目的支持广泛微生物的生长支持广泛微生物的生长, ,包括需氧菌、兼性厌氧菌、真菌（主要包括需氧菌、兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌）是需氧菌）用于培养真菌用于培养真菌培养条件培养条件14天于天于30-35 C及及20-25 C14天于天于20-25 Cl2005年版无菌检查培养基与USP、BP的比
13、较2中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学中国药典无菌检查培养基差异造成的问题与对策问题：实验条件对号入座 漏检 结果判断对号入座 漏检对策：强调两个培养基条件的互补性，实验上 同等对待，结果判断上不要受误导，避 免漏检。 中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学 3 3、无菌检查的几个问题、无菌检查的几个问题1 1）、无菌检查的认识误区）、无菌检查的认识误区 如何正确认识无菌检查？如何正确认识无菌检查？2 2）、抗菌药物的无菌检查）、抗菌药物的无菌检查 如何去除抗菌活性？如何去除抗菌活性？3 3）、外用制剂及眼用制剂的无菌检查）、外用制剂及眼用制剂的无菌检查 如何去除基
14、质影响？如何去除基质影响？中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学1 1）、无菌检查的认识误区）、无菌检查的认识误区“欣弗事件”反映了我国一些企业在微生物控制方面存在的严重问题；而更为严重的是一些企业普遍存在的无菌检查认识误区。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学 为什么要做无菌检查？为什么要做无菌检查？1、有最后灭菌保证，中间不需要控制？2、我们现在生产条件很好，GMP，不用再强调终产品的检查？中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学为什么抗生素产品也要做无菌检查？为什么抗生素产品也要做无菌检查？1、抗生素抗菌谱的限制；2、污染微生物的亚致死、休眠状态。中国
15、药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学1、药典要求。2、抗生素产品的无菌检查欣弗的情况如此，那么有“天然抗生素”美誉的鱼腥草等中药注射剂情况又该如何？3、近年来频繁出现的中药注射剂不良反应问题有没有污染微生物的可能？为什么中药注射用产品无菌检查也要采用为什么中药注射用产品无菌检查也要采用薄膜过滤法？薄膜过滤法？中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学2 2）、抗菌药物的无菌检查）、抗菌药物的无菌检查抗菌类药物由于对微生物生长的抑制作用，怎样合理检验，一直争论较多。这其中关键的困惑来自于关于药品中受损、受抑制或处于静息状态微生物的基础研究的缺乏。肯定的一点是，应尽量去除药物对微
16、生物生长的影响。USP29每膜最多冲洗500ml；BP2002和JP14每膜冲洗不大于1000ml；中国药典2005年版以所有阳性对照菌生长为目标。 去除抗生素抗菌的活性，使得处于亚致死、休眠状态的污染微生物复苏、生长而得以检出。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学2 2）、抗菌药物的无菌检查）、抗菌药物的无菌检查主要解决措施：主要解决措施： 喹诺酮类以MnSO4溶液为中和剂；参见：加替沙星无菌检查方法的建立与标准操作探讨 ，马仕洪、刘鹏、戴翚，药物分析杂志，2007，27（6）：877880 -内酰胺类以-内酰胺酶为中和剂；参见：简化注射用头孢菌素无菌检查法的探讨，戴翚、刘鹏、
17、马仕洪，药物分析杂志，2007，27（2）：208211 氨糖类及其他抗生素改善冲洗条件。 每膜冲洗500ml以内基本都能解决问题。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学R R1 1R R2 2R R3 3H HH H环丙沙星环丙沙星CHCH2 2CHCH3 3CHCH3 3F F洛美沙星洛美沙星CHCH2 2CHCH3 3H HH H诺氟沙星诺氟沙星CHCH3 3OCHOCH3 3加替沙星加替沙星CHCH3 3CHFCHF3 3卡德沙星卡德沙星多价金属阳离子对喹诺酮类的络合作用多价金属阳离子对喹诺酮类的络合作用五种喹诺酮类抗生素的结构，并且由3、4位上的羰基与镁、猛等金属离子配位
18、生成稳定的六元环络合物，药物与金属离子的络合比为2：1中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学头孢类抗生素无菌检查头孢类抗生素无菌检查样品名冲洗量（ml）大肠铜绿生孢金葡枯草白念黑曲霉头孢拉定 50030030050040000头孢呋辛钠 50030030050040000头孢替安 40030030050030000头孢曲松钠 50030030040040000头孢哌酮钠 40040030040030000头孢哌酮钠舒巴坦钠 50040030040040000头孢匹罗500/500/几种头孢菌数无菌检查冲洗量l通过400ml稀释液的溶解，滤过，采用0.1%蛋白胨溶液冲洗（表7），阳性
19、对照菌均可正常生长。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学从方法学研究到常规分析 .常常规分析分析SOP 验证未生未生长 生生长假阴性的假阴性的结果果 ?阴性的阴性的结果？果？阳性阳性的的结果果 ?假阳性的假阳性的结果？果？方法学研究方法学研究 完全按照完全按照完全按照完全按照验证过验证过的方法的方法的方法的方法实实施施施施 / SOP/ SOP调查原因原因 环境境 无菌性无菌性 : 培养基培养基 / 缓冲液冲液 操作操作规范范 验证实验中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学实验操作的标准化验证试验的系统化制定标准的严谨化完备的实验室保障系统最终目标：一次检验即可得到准
20、确结果。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学微生物限度检查现状微生物限度检查现状1 1、方法和标准的修订与完善、方法和标准的修订与完善2 2、技术现状与标准化、技术现状与标准化3 3、微生物限度检查的几个问题、微生物限度检查的几个问题中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学 1 1、方法和标准的修订与完善、方法和标准的修订与完善中国药典2005版微生物限度检查法与英美药典比较比较项目ChP2005USP29BP2002检验条件规定总体10000级、局部100级无具体规定无具体规定计数测定方法平皿法、薄膜过滤法、MPN平皿法、MPN平皿法、薄膜过滤法、MPN控制大肠埃希菌
21、、大肠菌群、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌、梭菌、其他致病菌大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、金葡球菌、大肠菌群、肠道菌、肠杆菌科大肠埃希菌、沙门菌(10)、铜绿假单胞菌、金葡球菌；肠杆菌科及某些革兰阴性菌稀释液pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；pH6.8/7.6PBS；0.9%NaClpH7.2PBS；大豆酪蛋白消化培养基/乳糖肉汤培养基pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；乳糖肉汤/其他培养基培养条件与时间细菌数：营养琼脂，48hrs霉菌及酵母：玫瑰红钠琼脂，72hrs,57天需气菌总数：大豆酪蛋白消化物琼脂，4872hrs霉菌及酵母：沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂，57天需气菌总数：大
22、豆酪蛋白消化物琼脂，5天霉菌及酵母：含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂、大豆酪蛋白消化物琼脂，5天控制菌检查结果判断与复试规定一次检出为准不符合标准规定，取大于25g的样品复试一次检出为准计数结果判断与复试规定第一次结果超过规定标准，复试两次，三次结果平均报告不符合标准规定，取大于25g的样品复试测定结果在规定的限度标准5倍以内均为合格中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学样品10g或10ml+缓冲液至100ml总需氧菌TSA,35 ,48-72h真菌SDA(PDA),20-25 ,5-7d结果结果(cfu/ml or g) (cfu/ml or g) 取1ml样品液 USP、BP总需气菌/
23、霉菌及酵母菌计数流程总需气菌、霉菌及酵母菌计数总需气菌、霉菌及酵母菌计数中国药典中国药典: 玫瑰红钠玫瑰红钠琼脂琼脂, 酵母浸出粉胨酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂葡萄糖琼脂中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学对供试品的前处理和一些检验方法进行了完善；具有明显的中国特色，与国际差距显著。计数测定体系的差异： 难以操作，检验繁琐 需气菌总数=细菌数+霉菌及酵母菌？ 1000 1000 100参见：美英欧药典微生物限度标准的浅析，苏德模、胡昌勤、马越，中国药品标准，2005年第3期1 1、方法和标准的修订与完善、方法和标准的修订与完善中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学2 2、技
24、术现状与标准化、技术现状与标准化1 1）培养基）培养基 培养基质量标准。 固体培养基的灵敏度。 玫瑰红钠琼脂培养基的专属性玫瑰红钠琼脂培养基的专属性中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学玫瑰红钠琼脂培养基的专属性玫瑰红钠琼脂培养基的专属性当染菌较多时，玫瑰红钠琼脂培养基生长大量的细菌，给结果判断带来困难。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学玫瑰红钠琼脂培养基的专属性玫瑰红钠琼脂培养基的专属性以中检所玫瑰红钠琼脂培养基（批号：050428）与营养琼脂培养基（批号：050523）比较，加入50100cfu阳性菌在相同条件培养观察，见下表：大肠大肠铜绿铜绿金葡金葡枯草枯草营
25、养琼脂培养基营养琼脂培养基3535培养培养48hrs48hrs7575818191917979玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基3535培养培养48hrs48hrs575747470 00 0玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基2525培养培养72hrs72hrs454541410 00 0玫瑰红钠琼脂培养基专属性实验结果中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学2 2、技术现状与标准化、技术现状与标准化2 2）、自动化程度低，仍然依赖大量的人工）、自动化程度低，仍然依赖大量的人工以方法验证为基础，引入更为便捷的供试品前处理技术，规范供试品前处理有条件的地方可以考虑引入自动稀释、自动
26、接种、仪器判读结果等设备和技术3 3）、）、75mm75mm薄膜过滤器的研制薄膜过滤器的研制征对我国中成药品种多、情况复杂，开发研制的75mm薄膜过滤器在目前的验证工作中发挥了重要作用。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学75mm75mm滤器滤器图10 75mm滤器结构细部 中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学75mm75mm滤器滤器 （上）50mm薄膜上的大肠埃希菌菌落 （中）75mm薄膜上的金黄色葡萄球菌菌落 （下）75mm薄膜上的黑曲霉菌菌落37中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学3 3、微生物限度检查的几个问题、微生物限度检查的几个问题原料药的
27、微生物标准问题；药材原粉的界定问题；含豆豉、神曲等发酵成分的中成药制剂标准问题；纯化水微生物限度检查问题；中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学原料药的微生物标准问题原料药的微生物标准问题 原料药是药品生产过程中引入微生物污染的重要来源之一，虽然一些药品在生产过程或终产品阶段可以采取一些灭菌措施杀灭污染微生物，但可能因为由此引入的死菌体、毒素等无法消除而危害患者，而原料药过高的微生物荷载可能直接挑战一些灭菌措施的有效性，造成灭菌失败，使药品存在更大的安全隐患。所以世界各国药典(原料品种占规定微生物限度品种数:BP和EP近90%,USP约30%)均规定应对原料药进行微生物检查，以消除
28、或控制其对药品引入的微生物污染。(有最后灭菌保证，中间不需要控制？)中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学在严格执行药品GMP的前提下，国外药典更为重视 原料药的微生物检查，尤其是对一些非灭菌制剂，甚至仅仅对原料药有微生物限度控制要求，而对制剂没有强制要求。中国药典2005版参考了国外药典的这一发展趋势，对于化学药品的片剂、胶囊剂、颗粒剂等6个主要口服制剂在各论和制剂通则中均未做微生物限度检查的强制要求，仅在附录中做出通用性要求，但很多企业不清楚这一变化的背景和两个必要前提，即严格的原料药微生物控制和严格的GMP管理，从而放松了对这些产品的微生物控制，可能会存在潜在风险。(我们现在
29、生产条件很好，GMP，不用再强调终产品的检查？)原料药的微生物标准问题原料药的微生物标准问题中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学中国药典规定，对药品原辅料药的微生物检查参照相应用途的药品进行，即用于非灭菌制剂生产的原料药应按相应制剂的微生物限度标准进行微生物限度控制；而用于灭菌制剂的原料药一般应符合无菌要求。考虑到生产过程中污染微生物可能发生的变化，国外企业通常在生产上自觉执行比制剂要求更为严格的原料药微生物标准。原料药的微生物标准问题原料药的微生物标准问题中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学原料药的微生物标准问题原料药的微生物标准问题（1）重视不够 目前一些企业对
30、原料药微生物控制的重要性和意义认识不够，对源头上的问题解决不好，加之GMP执行流于形式，造成了频繁的药品微生物污染事故发生。（2）标准依据不清楚 目前中国药典绝大多数药品原辅料各论项下没有明确的微生物检查标准，而是需要根据实际用途去确定相应的控制标准。（3）抽样不正确 原料药微生物检查的抽样除了应参照相应的抽样原则，还应强调的一点是抽样的环境要求和无菌操作要求，不当的抽样方法不仅可以使得样本对总体没有代表意义、抽取的样本被污染，甚至可因抽样而污染原料。（4）方法不合理 对于原料药微生物检查方法验证应与药品制剂微生物检查方法验证同等重视，否则同样存在检验方法不合理、不科学，检验结果没有意义的问题
31、。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学纯化水问题纯化水问题USP31/Water for Pharmaceutical PurposeUSP31/Water for Pharmaceutical PurposeDrinking Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion Method Sample Volume-1.0mL minimun Maximun action levels are 500 cfu per mLPurified Water: Pour Plate Method or Membrane Filtraion M
32、ethod Sample Volume-1.0mL minimun Maximun action levels are 100 cfu per mL Water for Injection: Membrane Filtraion Method Sample Volume-100mL minimun Maximun action levels are 10 cfu per 100mL 中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学Purified Water:POURPLATEORMEMBRANEFILTRATIONMETHOD1SampleVolume1.0mLminimum2Growth
33、MediumPlateCountAgar3IncubationTime48to72hoursminimumIncubationTemperature30to352Nevertheless,inaverylowtonilcountscenario,amaximumsamplevolumeofaround250to300mLisusuallyconsideredareasonablebalanceofsamplecollectingandprocessingeaseandincreasedstatisticalreliability.3AlsoknownasStandardMethodsAgar,
34、StandardMethodsPlateCountAgar,orTGYA,thismediumcontainstryptone(pancreaticdigestofcasein),glucoseandyeastextract.中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学纯化水问题纯化水问题2005版二部P3032010版二部P412 纯化水（纯化水（Purified WaterPurified Water） 【检查检查】微生物限度微生物限度 取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录XI J），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。 这一标准源于国外，在其需气菌培养基统一规定的
35、情况下简单易行。但我国引入后，造成企业大量的意见。在药典现有条件下实际采用2ml实验，1ml测定细菌数、1ml测定霉菌和酵母菌数，再加合起来作为一个检验结果。 主要问题还是培养基和检验体系的差异。主要问题还是培养基和检验体系的差异。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学(二) 中国药典2010年版微生物检验增修订内容简介中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学中中国国药药典典20201010年年版版框框架架( (卫卫) )中国药典中国药典20102010年版年版( (卫卫) )无菌检查法无菌检查法微生物限度检查法微生物限度检查法灭菌法抑菌效力检查法指导原则药品微生物检验替
36、代方法验证指导原则微生物限度检查法应用指导原则药品微生物实验室规范指导原则中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010版无菌检查法修订版无菌检查法修订2010年版中国药典一、二、三部的无菌检查法基本延续2005年版。2010年版中国药典三部逐渐向一、二部看齐。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010版无菌检查法修订版无菌检查法修订1、附录 103 页，附录XI H 无菌检查法 第 6 行，增加“防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出” 理由：因为有些实验人员对样品的处理和火焰上的操作直理由：因为有些实验人员对样品的处理和火焰上的操作直接影响供
37、试品中微生物的检出。接影响供试品中微生物的检出。 2、附录 103 页，附录XI H 无菌检查法 第 13 行，增加“无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训” 理由（理由（1） 无菌检查是高风险产品关乎用药安全的必检项目，为保无菌检查是高风险产品关乎用药安全的必检项目，为保证检验质量，必须有人员素质的保证。证检验质量，必须有人员素质的保证。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学而且，无菌检查是以一次检出不得复试的检验项目，实验人而且，无菌检查是以一次检出不得复试的检验项目，实验人员必须对实验结果具有微生物学的判断能力员必须对实验结果具有微生物学的判断能力:确定污染
38、来源确定污染来源,污染菌类别或定性及是否重试等。因此无菌检查人员必须具污染菌类别或定性及是否重试等。因此无菌检查人员必须具备微生物专业知识，经过无菌技术的培训，取得相应的上岗备微生物专业知识，经过无菌技术的培训，取得相应的上岗证。否则是不能胜任该岗位工作的证。否则是不能胜任该岗位工作的.理由（理由（2） 从全国药检系统特别是药品生产企业中的用人情况来看，从全国药检系统特别是药品生产企业中的用人情况来看，对从事无菌检查的岗位要求不明确，岗位上的人员也不被重对从事无菌检查的岗位要求不明确，岗位上的人员也不被重视，存在着不稳定、学历偏低、素质偏低的情况。药典中增视，存在着不稳定、学历偏低、素质偏低的
39、情况。药典中增加这条规定可以保持该岗位人员的价值和稳定性。加这条规定可以保持该岗位人员的价值和稳定性。理由（理由（3） 美国药典无菌检查法中也有人员的要求。美国药典无菌检查法中也有人员的要求。 中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010版无菌检查法修订版无菌检查法修订3、附录 103 页，培养基第 5 行，“三周”修订为“3周” 第 6 行，“一年”修订为“1年”4、附录 103 页，培养基第 7 行 ， 删 除“（用于培养好氧菌、厌氧菌）”倒第 6行，删除“（用于培养真菌）”理由：考虑所用培养基与理由：考虑所用培养基与USP/BP/EP不一致的问题，不一致的问题，避免
40、对号入座，减少漏检的机会，有利于提高污染避免对号入座，减少漏检的机会，有利于提高污染菌的检出率。菌的检出率。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010版无菌检查法修订版无菌检查法修订11、附录 104 页，薄膜过滤法左第1行，“将规定量”修订为“取每种培养基规定接种”左第1行，增加“总量”左倒第1行，“按”修订为“置”12、附录 105 页，直接接种法第4行，“铜绿假单胞菌”修订为“大肠埃希菌” 第6行修订为“其中1管接入每支培养基规定量的供试品量” 第7行，“按”修订为“置”中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学理由（理由（1） 根据根据5年来验证试验的经
41、验，发现作为革兰氏阴性杆年来验证试验的经验，发现作为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌对大部分抗生素不敏感，而大肠菌代表的铜绿假单胞菌对大部分抗生素不敏感，而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主的抗生素敏感性较好。埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主的抗生素敏感性较好。理由（理由（2） 但是，铜绿假单胞菌作为自然环境中存在的假单胞菌但是，铜绿假单胞菌作为自然环境中存在的假单胞菌族的代表也有其作为试验菌的必要性，无菌检查法必须族的代表也有其作为试验菌的必要性，无菌检查法必须保证其能被检出。所以采取了在培养基灵敏度试验中保保证其能被检出。所以采取了在培养基灵敏度试验中保留铜绿假单孢菌，而在验证试验用菌和阳性对照
42、用菌中留铜绿假单孢菌，而在验证试验用菌和阳性对照用菌中改用大肠埃希菌。改用大肠埃希菌。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010版无菌检查法修订版无菌检查法修订16、附录 105 页，阴性对照 左第4行，“如果容器”修订为“如果供试品容器” 左第5行，“向供试品容器内导入”修订为“向容器内导入”17、附录 105 页，薄膜过滤法 左第4行，增加“抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜” 左第11行，“每次冲洗量为100ml，且总冲洗量不宜过大，”修订为“每次冲洗量一般为100ml，且总冲洗量不宜过大不得超过1000ml，”理由：保证滤膜的完好性和微生物的存活理由：保证滤膜
43、的完好性和微生物的存活。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010年版微生物限度检查法修订年版微生物限度检查法修订2010年版中国药典微生物限度检查法 附录XIIIC（一部） 附录XIJ（二部）引入培养基适用性实验增加白色念珠菌检查法贴膏剂检查方法的改进限度标准表示方法改变中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010年版微生物限度检查法修订年版微生物限度检查法修订4、附录108页，新增：贴膏剂供试品 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将
44、其置于适宜体积并含有灭活剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供试液。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学理由：与国际接轨。理由：与国际接轨。BP2007、EP6.0、USP30及美国、欧洲和日本三方协调一及美国、欧洲和日本三方协调一致的药品微生物限度检测方法，均对透皮贴剂规定了检致的药品微生物限度检测方法，均对透皮贴剂规定了检测方法和限度标准。测方法和限度标准。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010年版微生物限度检查法修订年版微生物限度检查法修订5、附录108页，修订：离心沉淀法 取一定量供试液，500转/分
45、离心3分钟，取全部上清液混合。用于细菌细菌检查。理由：1、离心沉淀集菌法操作的不确定性较大不确定性较大，试验菌回收率的分布区间较宽。2、离心集菌法的实验结果复现性差结果复现性差，无法准确反应供试品受微生物污染的真实程度。3、原操作规程中仅规定转数和离心时间不能很好的评价离心不能很好的评价离心效果效果。（近年来更多的以相对离心力（RCF）评价离心过程中的受力情况 。其计算公式为：RCF=0.00001118RN2 ，N表示转速 ，R表示离心半径 ）中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学离心机Z200A3000转/分，20分钟LDZ4-1.23000转/分，20分钟RCF（g）1085
46、.51001.7大肠埃希菌回收率61%52%金黄色葡萄球回收率10%46%实验数据实验数据：取无菌10%葡糖糖溶液9ml置无菌离心管中（2管），分别加金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌菌液各1ml（5001500cfu/ml），按高速离心的条件试验，离心后，用无菌吸管从离心管上部小心吸出上清液（勿扰动底部溶液），留底部集菌液约2ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨溶液补充至原量，混匀，取此供试液1ml注入平皿中，按平皿计数法测定，计算回收率。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学 实验数据实验数据：取无菌生理盐水溶液9ml置无菌离心管中（2管），分别加白色念珠菌和枯草芽孢杆菌菌液各1ml（
47、5001500cfu/ml），混匀，按低速离心的条件试验，在离心管上部取样1ml，按平皿计数法测定，计算回收率离心机型号转速（rpm）时间(min)试验菌回收率（%）第1次第2次第3次平均DT5-6RCF(27g)500、39800141554045500、533302830500、36350186908687500、586868586中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010年版微生物限度检查法修订年版微生物限度检查法修订6、附录108页，增加：计数培养基的适用性检查计数培养基的适用性检查细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水
48、培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003中国药典卫生学检验培训版中国
49、药典微生物检验技术崔学20102010年版微生物限度检查法修订年版微生物限度检查法修订6、附录108页，增加：计数培养基的适用性检查计数培养基的适用性检查菌菌液液制制备备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养57天，加入35ml 含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用
50、适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学计数培养基适用性检查计数培养基适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035培养48hr，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50100
51、cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2025培养72hr，计数；取白色念珠菌50100cfu，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2025培养72hr，计数。同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。结果判定结果判定 被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养的适用性检查符合规定。 被检培养基菌落数被检培养基菌落数琼脂培养基回收率琼脂培养基回收率= *100% 对照培养基菌落数对照培养基菌落数中国药典卫生学检验培训
52、版中国药典微生物检验技术崔学20102010年版微生物限度检查法修订年版微生物限度检查法修订13、附录110页，增加：控制菌检查用培养基适用性检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。菌种菌种 对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50
53、094铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B） 64 941白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学控制菌检查培养基特性试验菌株大肠埃希菌胆盐乳糖培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌MUG培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌大肠菌群乳糖胆盐发酵培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵培养基促生长能力+指示能力大肠
54、埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌沙门菌营养肉汤促生长能力乙型付伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿培养基促生长能力乙型付伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力乙型付伤寒沙门菌铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌绿脓菌素测定用培养基促生长能力+指示能力铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基促生长能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂促生长能
55、力+指示能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂促生长能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌吐温80玉米琼脂培养物促生长能力+指示能力白色念珠菌中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学20102010年版微生物限度检查法修订年版微生物限度检查法修订16、附录111页，增加：白色念珠菌 取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少
56、于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养2448 小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选23个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。若平板上生长的菌落为绿色或翠绿
57、色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉米琼脂培养基上，培养2448小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。芽芽管管试试验验挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置3537、13h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学理由:白色念珠菌（Candida albicans），又称为白假丝酵母菌（Saccharomyces albicaus），属假丝酵母菌属（Saccharom yces） 。
58、白色念珠菌是条件致病菌，是医学全身性真菌感染病的重要组成之一，一旦感染，常可引起心内膜炎、肺炎、尿布疹、鹅口疮、阴道炎、脑膜炎及败血症等。 白色念珠菌广泛分布于土壤、水和空气中，目前国内的药品、食品标准均已把白色念珠菌作为微生物检验中酵母菌的代表菌，因此有些药品依据给药途径和剂型将白色念珠菌作为控制菌是非常必要的。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学(三三) 微生物检查方法验证试验微生物检查方法验证试验中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学无菌无菌/ /微生物限度检查理念微生物限度检查理念环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠
59、的结论结果判断中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学l充分重视微生物检查的重要性l充分重视微生物检查方法的合理性如何推进微生物检验技术的发展？ 方法验证中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学关于方法验证关于方法验证为什么验证?验证什么?怎么验证?何时验证？中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学关于方法验证关于方法验证中国药典2005版首次引入方法验证要求；中国药典2010版无菌检查法和微生物限度检查法延续了2005版方法验证要求；中国药典2010版微生物限度检查法应用指微生物限度检查法应用指导原则导原则（一部附录XVIII F、二部附录XIX P）第五条。中
60、国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学为什么验证?1、采用经过验证的方法，是分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循工作的基础。药品微生物检查作为整个药品质量体系中的一个环节，应与其他检验项目一样，对方法和条件进行考察，以保证结果的科学性，如鉴别、含量测定。2、验证的思想其实早已贯彻于微生物检测的诸多方面：无菌环境验证（尘埃离子、浮游菌、沉降菌检测）、灭菌器的验证、培养基灵敏度检测、阴性对照、阳性对照等等。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学为什么验证?3、2005版充分借鉴发达国家经验，将微生物检查方法的验证实验进行了更加系统化的规定和要求。验证实际上伴随着整个实验过程
61、，实验过程中的每一个环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。4、有了系统的方法验证，可以避免以往因为阳性菌选择不合理、方法不合理而造成的漏检、误判，以保证结果的科学可靠，这一点无论对于当前无菌检查的一次性报告，还是对于实验室认证认可、以及新的药品注册管理办法的要求都是相一致的。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学5、通过对同品种但不同批号或不同生产厂家的产品的微生物学验证试验比较，可以发现产品所用原料质量或工艺流程中是否存在污染抑菌物质的问题，具有药品质量控制的意义。 例：盐酸利多卡因注射液中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学要求执行验证的相关法规和
62、文件为了确保开展微生物学检验方法的验证，国食监注2005234号“关于颁布和执行中国药典2005年版有关事宜的通知”国药典发200598号“关于执行中国药典2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明”中检药2006862号“第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要”都作了说明和规定。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学验证什么？无菌、微生物限度检查的验证试验可概括描述为：在采用的检验方法和过程中，通过分别加入规定量的代表性微生物，以试验供试品是否在规定的检验量、在所采用的检验条件下无抑菌性，或已充分消除了抑菌性，并且所用方法
63、对微生物生长无不良影响，从而确认检验方法的有效性，保证检验结果的准确可靠。因此，整个实验过程中的每一个环节均应有合理的证明，保证其对结果判断没有影响。按样品的检验流程，验证的重点环节分布如下：中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学验证什么？需前处理不需前处理有抑菌作用无抑菌作用样品检查去除抑菌作用验证前处理方法对污染菌生长、检出的影响。验证抑菌活性去除的有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出的影响。可以通过验证实验判断 药品微生物检查方法验证的一般程序与环节中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学验证什么？需要验证的重点环节验证实际上伴随着整个实验过程，实验过程中的每一个
64、环节均应有合理的证明（验证），保证其对结果判断没有影响。前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应在验证范围内。已有标准规程（SOP）和充足实验证明的前处理方法可以直接采用，但出现疑问应进一步研究但出现疑问应进一步研究提高。提高。供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。供试品中抗菌活性的去除是当前验证工作的重点。尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学怎么验证？利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响，通过模拟实验对降低或消除效果加以检验。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技
65、术崔学稀释法薄膜法中和法离心法供试品前处理去除抗菌活性稀释溶解分散萃取离心供试品污染微生物检查验证中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学供试品中抗菌活性的去除稀释法稀释法降低供试品的相对浓度降低供试品的相对浓度薄膜法薄膜法利用体积差异分离利用体积差异分离中和法中和法利用化学（生物）专属性灭活利用化学（生物）专属性灭活离心法离心法利用沉降系数差异分离利用沉降系数差异分离 各方法组合运用，效果更佳！中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学抗菌活性去除效果的检验应根据供试品的特点，选择敏感菌株选择敏感菌株，对供试品抗菌活性去除效果加以检验，再按药典要求全面验证，提高效率。中国药
66、典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学选择敏感菌株选择敏感菌株查阅资料临床药物实验手册、文献资料、申 报资料中的药效学资料参考已经验证过的品种直接通过验证实验确定 中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学选择适宜的方法可靠、稳定、简便参考方法： 在样品许可的条件下 无菌：薄膜过滤，500ml/膜冲洗； 限度：薄膜过滤，300ml/膜冲洗。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学结果总结与报告综合分析实验中遇到的所有情况，最终形成一份详细、严谨、具有可操作性的验证报告。给出该品种的标准检验规程，规程中应明确样品前处理步骤、采用的具体方法，以及各方法操作的关键点，以供检验
67、参考。方法验证实验报告标准的技术文件。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学无菌检查方法验证的思路无菌检查方法验证的思路 验证体系：阴性对照、阳性对照、微生物挑战试验通过消除或抑制供试品中抗微生物物质的活性来检验微生物的方法，应通过验证，以确定所用检验方法测定结果的可信度中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学无菌检查方法验证的思路无菌检查方法验证的思路利用供试品与微生物的差异，降低或消除供试品的影响，通过模拟实验对降低或消除效果加以检验依据抗菌谱通过预实验确定敏感菌株（阳性对照菌） 通过敏感菌株确定冲洗量 通过方法验证验证该取样量以及冲洗量下敏感菌株生长情况 确定试验方
68、案进行检验中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学影响无菌检查方法验证结果的环节影响无菌检查方法验证结果的环节 供试液的制备冲洗条件中和剂的选择与加入敏感菌株的选择与加入标准化操作中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学影响无菌检查方法验证结果的环节影响无菌检查方法验证结果的环节供试液的制备供试液浓度过高增加了滤膜的初始吸附量，从而导致了后期冲洗体积的增大，因此将供试液浓度控制在一定范围之内有助于提高无菌检查方法的科学性中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学供试液的影响供试液的影响左奥硝唑注射液（水针） 规格：10mL：0.25g/支 生产企业 ： 衡阳恒生制药
69、有限公司注射用盐酸克林霉素（粉针） 规格： 0.3g/支 生产企业 ：北京四环科宝制药有限公司中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学左奥硝唑注射液（左奥硝唑注射液（ 10mL10mL：0.25g/0.25g/支）支）取样量及取样量及样品浓度样品浓度每张每张滤膜滤膜样品样品量量每张滤膜每张滤膜冲洗量冲洗量阳性对照菌阳性对照菌（生孢梭菌）（生孢梭菌） 生长情况生长情况每张滤膜通每张滤膜通过量过量10ml10支C：250mg/ml33ml800ml833ml1000ml1033ml10ml10支溶解于溶解于500ml 0.9NaCl溶液溶液C：4mg/ml200ml300ml500ml4
70、00ml600ml中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学注射用盐酸克林霉素（注射用盐酸克林霉素（ 0.3g/0.3g/支）支）取样量及取样量及样品浓度样品浓度每张滤每张滤膜样品膜样品量量每张滤膜每张滤膜冲洗量冲洗量阳性对照菌阳性对照菌( (金黄色葡萄球金黄色葡萄球菌菌) )生长情况生长情况每张滤膜通每张滤膜通过量过量0.3g15支每支溶解于每支溶解于5ml 0.9NaCl溶液溶液C：60mg/ml25ml800ml825ml1000ml1025ml0.3g15支全部溶解于全部溶解于500ml 0.9NaCl溶液溶液C：3mg/ml167ml400ml567ml500ml667ml中
71、国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学无菌三针单联管 -溶解稀释供试品中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学影响无菌检查方法验证结果的环节影响无菌检查方法验证结果的环节冲洗条件主要是冲洗体积对于无菌检查方法的影响，冲洗体积过大滤膜的截留能力会降低，导致无菌检查假阴性结果的出现建议冲洗量控制在1000ml/膜以内中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学冲洗量的影响性试验冲洗量的影响性试验指征菌：粘质沙雷（指征菌：粘质沙雷（Serratiamarcescens） 注：又称灵杆菌，一种产生鲜红色素的细菌，存在于空气和水中，可生长在动、植物性食品中。为细菌中最小者，约0
72、.5(0.51.0)微米。近球形短杆菌，但形态多样。革兰氏阴性，周身鞭毛,能运动。无荚膜，无芽胞，在普通琼脂平板上2530培养12天出现粘性、中心颗粒状、有恶臭的菌落。约半数菌株能产生红色的灵菌素(prodigiosin)。在室温条件下易促进色素的生成，因本菌小且有色素，常用于检定滤菌器的质量。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学操作步骤：操作步骤：1.1.湿润滤膜湿润滤膜2.2.加入适量指征菌加入适量指征菌3.3.用不同冲洗量对滤膜进行冲洗用不同冲洗量对滤膜进行冲洗4.4.平行进行阳性对照平行进行阳性对照5.5.取膜培养取膜培养6.6.计算回收率计算回收率冲洗量的影响性试验冲洗
73、量的影响性试验中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学冲洗量的影响性试验冲洗量的影响性试验冲洗量冲洗量持续冲洗持续冲洗CFUCFU及及回收率回收率分次冲洗分次冲洗(100ml/(100ml/次次)CFU)CFU及回收率及回收率阳性对照组阳性对照组CFUCFU400ml72cfu 8280cfu 9188cfu600ml66cfu 7575cfu 85800ml50cfu 5750cfu 5769cfu 781000ml33cfu 3833cfu 3862cfu 711200ml20cfu 2320cfu 2335cfu 4035cfu 40中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技
74、术崔学影响无菌检查方法验证结果的环节影响无菌检查方法验证结果的环节中和剂的选择与加入选择：对应的理化特性作为选择依据，如内酰胺酶、 MnSO4 ；应对微生物的生长无影响。加入：不同中和剂加入方式效果不一样。通过我们的经验，基本倾向于直接加入培养体系中。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学影响无菌检查方法验证结果的环节影响无菌检查方法验证结果的环节敏感菌株的选择与加入选择：根据抗菌谱和预试验（体外抑菌试验）加入：按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑滤器的有效性。而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌
75、时机与方式只要与对照一致即可。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学影响无菌检查方法验证结果的环节影响无菌检查方法验证结果的环节标准化操作供试液制备：通过比较发现，在检验条件下，0.9%氯化钠溶液对大多数的抗生素粉针比0.1蛋白胨溶液溶解能力强、溶解速度快。 冲洗方法：少量多次、充分震摇、冲洗体积的控制中和剂和阳性对照菌的加入方式中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学样品量以及供试液浓度的确定样品量以及供试液浓度的确定出厂检验量远远高于上市抽验量，样品量的增加是否会直接导致冲洗量的增加？冲洗只能让样品的吸附量降至最低值，即降至基础吸附量敏感菌的生长取决于培养体系中残留的
76、滤膜基础吸附量滤膜基础吸附量的多少取决于滤膜材质，和冲洗量无关中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学样品量与基础吸附量无关样品量与基础吸附量无关中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学样品量以及供试液浓度的确定样品量以及供试液浓度的确定个论化描述时规定供试液浓度，不同取样量参考规定浓度配制，所配供试液浓度不应高于规定值。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学微生物限度检查方法验证的思路微生物限度检查方法验证的思路选择敏感菌株 选择方法：同无菌验证 选择参考： 一般中药选择枯草和金葡； 一般抗生素根据抗菌谱选择。 原则原则:由易到难，由简到繁由易到难，由简到繁例
77、：黄芩苷 中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学黄芩苷：理学性质：几乎不溶于水查阅文献：周智兴傅颖媛黄芩苷对白色念珠菌细胞周期的黄芩苷对白色念珠菌细胞周期的影响影响结论：黄芩苷具有明显的抗白色念珠菌作用;黄芩苷能抑制白色念珠菌增殖验证试验：1：10供试液混悬，1ml影响菌落识别；0.2ml/皿，0.1ml/皿，白念回收率明显低于70%；1：50供试液，澄清，薄膜过滤，300ml/膜；中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学选选择择敏敏感感菌菌株株药物名称药物名称生产企业生产企业大肠大肠大肠大肠金葡金葡金葡金葡枯草枯草枯草枯草白念白念白念白念黑曲黑曲黑曲黑曲抗栓再造丸抗栓再
78、造丸辽宁华鑫药业有限公司辽宁华鑫药业有限公司100 100 100 100 45 45 45 45 46 46 46 46 100 100 100 100 95 95 95 95 更年安胶囊更年安胶囊福州金象中药药业有限公司福州金象中药药业有限公司87 87 87 87 95 95 95 95 41 41 41 41 100 100 100 100 91 91 91 91 清热安宫丸清热安宫丸江西国药药业有限公司江西国药药业有限公司88 88 88 88 14 14 14 14 15 15 15 15 100 100 100 100 92 92 92 92 通宣理肺丸通宣理肺丸广东阳江制药厂广
79、东阳江制药厂100 100 100 100 59 59 59 59 100100100100 100 100 100 100 100 100 100 100 肝德志胶囊肝德志胶囊四川省通阳制药厂四川省通阳制药厂93 93 93 93 64 64 64 64 41 41 41 41 100 100 100 100 100 100 100 100 宁心安神胶囊宁心安神胶囊广西南宁万士达制药厂广西南宁万士达制药厂100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 防癌胶囊防癌胶囊北京北卫药业有限公司北京北卫药业有限公司35
80、35 35 35 52 52 52 52 70707070100 100 100 100 81 81 81 81 肠胃舒胶囊肠胃舒胶囊北京北卫药业有限公司北京北卫药业有限公司73 73 73 73 22 22 22 22 47 47 47 47 100 100 100 100 86 86 86 86 骨络通酒骨络通酒北京北卫药业有限公司北京北卫药业有限公司100 100 100 100 7 7 7 7 61 61 61 61 100 100 100 100 92 92 92 92 消渴丸消渴丸北京北卫药业有限公司北京北卫药业有限公司93 93 93 93 1 1 1 1 67 67 67 67
81、 100 100 100 100 88 88 88 88 鼻渊丸鼻渊丸武汉中联药业集团公司武汉中联药业集团公司80 80 80 80 0 0 0 0 51 51 51 51 100 100 100 100 100 100 100 100 陀螺银屑胶囊陀螺银屑胶囊烟台中洲制药厂烟台中洲制药厂100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 冠心丹参胶囊冠心丹参胶囊内蒙古自治区包头制药厂内蒙古自治区包头制药厂89 89 89 89 0 0 0 0 0 0 0 0 100 100 100 100 100 100 100 1
82、00 龟龄集龟龄集山西广誉远园药业有限公司山西广誉远园药业有限公司100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 肚痛健胃整肠丸肚痛健胃整肠丸香港康恩堂制药厂香港康恩堂制药厂83 83 83 83 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 冠心丹参胶囊冠心丹参胶囊长春海王生物制药有限公司长春海王生物制药有限公司100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 糖尿乐胶囊糖尿乐胶囊哈尔滨
83、中药六厂有限公司哈尔滨中药六厂有限公司100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 降糖宁胶囊降糖宁胶囊通化茂祥制药有限公司通化茂祥制药有限公司100 100 100 100 7070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 温胃舒胶囊温胃舒胶囊江苏聚荣制药有限公司江苏聚荣制药有限公司707070707070707070707070100 100 100 100 100 100 100 100 中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学用药典规定的5个标准菌株
84、，对124个中药品种进行验证，研究表明：有一定抑菌作用和强抑菌作用的品种占总数的79%。 说明用在没有对方法进行验证之前，有近80%的中成药微生物限度检查的结果，不能真实反映样品中实际的污染情况。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学培养基稀释法:定义?取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。薄膜过滤法:供试液取样量?取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤；若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1ml进行试验。四硫磺酸亮绿培养基:配法?临用前，取上述培养
85、基，每10ml加入碘试液0.2ml和亮绿试液0.1ml，混匀。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学什么时候验证？什么时候验证？（1）当建立药品的微生物学检查方法时。即当申报新药时必须附有进行微生物学检查的方法学验证的资料。并在药品质量标准的【无菌】或【微生物限度】项下明确经验证试验确定的检验操作方法。 （2）产品的组分或原检验条件发生改时。考察这些改变对微生物生长的影响。 中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学验证以后怎么办？无菌检查：进行供试品无菌检查时，所采用的无菌检查：进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。检查方法和检验条件应与验证
86、的方法相同。l微生物限度：检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌酵母菌菌数的测定；供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。检验方法的各论化！中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学 再验证定期再验证定期再验证 考察验证结果的稳定性和及时发现影响微生物 生长的因素。 与产品的微生物学检查同时进行与产品的微生物学检查同时进行 阳性对照（无菌），敏感 菌回收（限度）中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学方法验证实验工作的完善和发展一方面以验证实验为手段和契机，充分完善和细化我国无菌和微生物限度检查方法，建立起完备的SOP体系。另一方面集中力量尽快完成我国数以千计的品种的检验方法的初步验证实验，并收集、整理、分析已有验证资料，指出各品种验证实验的发展方向。通过方法验证促进我国药品微生物检验工作全面发展。微生物限度检查法应用指导原则第五条。中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学验证实验信息交流平台验证实验信息交流平台中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学谢谢大家！中国药典卫生学检验培训版中国药典微生物检验技术崔学
