第二节 分子生物学技术 情境导入 PCR仪 PCR是聚合酶链式反应的缩写,用于 DNA 片段复制、扩增的生化技术,1983年由 Mullis 在美国创建并用于分子生物学 ,为此他于 1993年获得诺贝尔化学奖这项技术有效地解决了因为样品中 DNA 含量太低而难以对样品进行分析研究的问题,PCR技术的程序是什么? 课程目标 1.理解 PCR的原理,并能比较与细胞内DNA 复制的区别 2.了解 PCR技术操作过程及注意事项 3.能用 PCR仪扩增 DNA,并估算 DNA 含量 4.了解 PCR的应用 一二三一、使用 PCR仪的安全措施 1.严禁在 PCR仪运行的过程中打开池盖,否则会造成仪器的永久损坏2.仪器运行时,样品池及池盖内表面温度较高,要当心灼伤 3.仪器运行时,加热器内腔为高温、高电压环境,严禁触及 4.仪器运行过程中如果发出尖锐的刺刮声音,请立刻停止运行,检查是否有微量离心管断裂等故障 5.仪器运行过程中如果没有反应,请切断电源,进行检查 6.为保持样品池内部的清洁,可用蘸有体积分数为 95%的酒精棉签擦拭相关部位 7.仪器必须放置在 PCR实验室里,操作者在操作的时候必须遵循 PCR实验室的相关规定,做好穿防护服、戴防护手套等相关防护措施。
8.当仪器接通电源后,打开外壳或移走部件可能会造成人员伤害,因此,在进行任何调整、替换、保养或维修之前,请切断所有的电源 一二三二、多聚酶链式反应程序 向离心管中加入模板 DNA、引物和 4种脱氧核苷酸以及 Taq DNA 聚合酶 变性:在 94 ℃高温下,作为模板的双链 DNA 解旋成为单链 DNA 退火(复性):反应体系的温度降至 55 ℃(由引物复性温度决定),引物与单链 DNA 上的特定部位相互配对 延伸:反应体系的温度回升到 72 ℃左右(Taq DNA 聚合酶的最适反应温度),按照单链 DNA 上的脱氧核苷酸序列,4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则连接到引物之后,使引物链延伸,形成互补的 DNA 双链 探究思考 Taq DNA 聚合酶是从一种嗜热菌中分离出来的,到什么环境中寻找这种嗜热菌? 提示:这种嗜热菌生活在高温环境中 一二三三、目的 DNA 片段的体外扩增 1.具体反应过程包括变性、退火、延伸 2.微量离心管、取液器和缓冲液需经过高压灭菌后使用 3.每次移取一种试剂后,都要更换移液器上的枪头 4.进行目的 DNA 片段体外扩增时,待扩增的 DNA 片段 3'端的脱氧核苷酸序列要为已知,因为引物的序列是依据被扩增区域的 3'端边界 DNA 序列确定的,这样设计出的引物才能与相对应的模板链结合。
5.在 PCR 反应中,DNA 聚合酶从引物的 3'端开始延伸 DNA 链,所以DNA 的合成方向总是从子链的 5'端向 3'端延伸 6.DNA 在酸性条件下加热,其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂,生成嘌呤碱和脱氧核糖等,而脱氧核糖在酸性和加热条件下生成的物质与二苯胺试剂反应,生成蓝色的物质根据蓝色的深浅,可以粗略地比较扩增前和扩增后溶液中 DNA 的含量是否有变化 探究点一探究点二探究点三DNA 复制与体外扩增的比较 ●问题导引● 河南安阳“曹操墓”自发掘以来备受争议 ,为此,复旦大学进行 DNA 检测儿子能完整地继承父亲的 Y 染色体,男性有着与父系祖先相同的基因密码只要检测足够多的曹姓男子 DNA,课题组便可以找到曹姓家族应有的独特 “密码”,然后和“曹操墓”出土人骨 DNA 中的 Y 染色体对比验证这个过程中对采集的 DNA 样本如何扩增? 提示:应用 PCR技术 探究点一探究点二探究点三●名师精讲● PCR DNA 复制 细胞内 细胞外 ATP 提供能量 不需 ATP 提供能量 解旋酶、DNA 聚合酶 耐高温的 Taq DNA聚合酶 伴有转录,产生引物 无转录,需加入两种引物 边解旋边复制,半保留复制 体外迅速扩增 受生物体自身控制 30多次 不需要 需要人为控制 无 严格控制温度变化的温控设备 四种脱氧核苷酸 严格遵循碱基互补配对原则 DNA 为模板 都需要与模板相结合的引物 探究点一探究点二探究点三【例题 1】 PCR过程与细胞内的 DNA 复制过程相比,主要有两点不同,它们是( ) ①PCR过程需要的引物是人工合成的 DNA 单链 ②PCR过程不需要DNA 聚合酶 ③PCR过程中 DNA 的解旋不依靠解旋酶 ,而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中,DNA 不需要解旋,直接以双链 DNA 为模板进行复制 A.①④ B.①③ C.②③ D.②④ 解析:PCR过程与细胞内的 DNA 复制过程相比,主要有两点不同 :第一,PCR过程需要的引物不是 RNA,而是人工合成的 DNA 单链;第二,PCR过程中 DNA 的解旋不依靠解旋酶 ,而是通过对反应温度的控制来实现的。
答案:B 探究点一探究点二探究点三方法点拨PCR利用了 DNA 的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解旋与结合 PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行 ,需提供 DNA 模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的 DNA 聚合酶,同时通过控制温度使 DNA 复制在体外反复进行 探究点一探究点二探究点三PCR反应原理 ●问题导引● 若只有一个 DNA 分子,扩增 n次后得到多少个 DNA 片段?N0个 DNA分子呢? 提示:理论上 DNA 扩增呈指数扩增若只有一个 DNA 提供模板,则复制 n次后有 2 个;若开始有 N0个 DNA,则复制 n次后获得的子代 DNA 数目为 N0·2 个 nn 探究点一探究点二探究点三●名师精讲● 1.过程 (1)变性:在 94 ℃高温下,作为模板的双链 DNA 解旋成为单链 DNA (2)退火(复性):反应体系的温度降至 55 ℃,引物与单链 DNA 上的特定部位相互配对 DNA 双链单链 (3)延伸:反应体系的温度回升到 72 ℃左右条件下在 Taq DNA 聚合酶的作用下,以溶液中的四种脱氧核苷酸为原料,从引物的 3'端开始延伸,根据碱基互补配对原则合成与模板链互补的 DNA 链。
探究点一探究点二探究点三2.PCR反应过程图解 探究点一探究点二探究点三【例题 2】 PCR一般要经过 30多次循环,从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,由引物Ⅰ延伸而成的 DNA 单链作模板时( ) A.仍与引物Ⅰ结合进行 DNA 子链的延伸 B.与引物Ⅱ结合进行 DNA 子链的延伸 C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸 D.无需与引物结合,在酶的作用下从头合成子链 解析:考查对 PCR反应中的变性、复性、延伸的实质是否理解当由引物Ⅰ延伸而成的 DNA 单链作模板时,此单链引物固定端为 5'端,因此与它互补的子链应从另一端开始合成,即与引物Ⅱ结合延伸DNA 子链 答案:B 探究点一探究点二探究点三变式训练 1下图是 PCR反应过程中哪次循环的产物?( ) A.第一次循环 B.第二次循环 C.第三次循环 D.第四次循环 解析:在 PCR反应中,以引物为标记,第一次循环时加入的 DNA 为模板,两条 DNA 链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA 聚合酶的作用下延伸,所以形成的每个子代 DNA 中只有一种引物 答案:A 探究点一探究点二探究点三PCR反应所需的物质 ●问题导引● PCR反应需要什么物质? 提示:引物、反应物、DNA 聚合酶、模板 DNA、Mg 、反应缓冲液等。
●名师精讲● PCR操作过程中需注意的问题 1.为避免外源 DNA 等因素的污染,PCR 实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 2.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份 ,并在-20 ℃储存使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化 3.在微量离心管中添加反应成分时 ,每吸取一种试剂后 ,移液器上的枪头都必须更换所有的成分都加入后 ,盖严离心管口的盖子 ,用手指轻轻弹击管的侧壁,使反应液混合均匀 ,再将微量离心管放在离心机上 ,离心约 10 s, 使反应液集中在离心管底部,再放入 PCR仪中进行反应 2+ 探究点一探究点二探究点三【例题 3】 在 PCR扩增 DNA 的实验中,根据设计,一分子 DNA 经 303010次循环后,应得到约 2 个 DNA 分子,但结果只有约 2 个 DNA 分子出现该现象的原因可能是( ) ①循环次数不够 ②Taq DNA 聚合酶活力不够或其活性受到抑制 ③引物不能与母链结合 A.①②③ B.②③ C.①③ D.①② 解析:本题主要考查在 PCR扩增中出现的假阴性现象PCR反应获得产物少的原因有:Taq DNA 聚合酶活力不够或其活性受到抑制导致催化效率降低,得到的产物比预期得少;引物设计不合理,可能不能与模板 DNA 结合,导致无法进行扩增;提取的模板数量或质量不过关,可能不能起模板作用,无法进行扩增;循环次数过少,产物的量比预期得少。
答案:D 探究点一探究点二探究点三变式训练 2在 PCR扩增的实验中,加入一种提取物(一种模板 DNA 片段),但实验得到的产物却有 2种 DNA其原因可能是( ) A.基因突变 B. Taq DNA 聚合酶发生变异 C.基因污染 D.温度过高 解析:此现象属于 PCR技术中的假阳性现象其原因是靶基因污染因此,在 PCR实验中,一定要做到隔离操作区、分装试剂、简化操作程序、用一次性吸头等,尽量避免靶基因污染 答案:C 探究点一探究点二探究点三 判断正误(正确的画“√”, 错误的画“×”) 1.转基因动物获得的新特性可以遗传给后代 ( ) 提示:√ 2.体内 DNA 合成不需要引物,PCR反应需要引物 ) 提示:× 体内 DNA 合成与 PCR反应都需要引物 3.DNA 的合成方向总是从子链的 3'端向 5'端延伸 ) 提示:× DNA 的合成方向总是从子链的 5'端向 3'端延伸 4.PCR通过控制温度来控制双链的解聚与结合 ( ) 提示:√ 5.PCR要用耐高温的 DNA 聚合酶 ) 提示:√ 探究点一探究点二探究点三6.PCR分为变性、退火和延伸三步。
( ) 提示:√ 7.DNA 聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的 DNA 序列,使这段固定长度的序列成倍扩增 ( ) 提示:× DNA 聚合酶复制处于两个引物之间的 DNA 序列,DNA 序列呈指数扩增 8.PCR反应避免外源 DNA 等因素的污染而造成干扰实验 ( ) 提示:√ 1 2 3 4 5 6 1.DNA 的合成方向总是 延伸( ) A.从 DNA 分子的左端向右端 B.从 DNA 分子的右端向左端 C.从子链的 5'端向 3'端 D.从子链的 3'端向 5'端 解析:DNA 的合成方向是从子链的 5'端向 3'端延伸 答案:C 1 2 3 4 5 6 2.假设 PCR反应中,只有一个 DNA 的片段作为模板 ,请计算在 30次循环后,反应物中大约有多少这样的 DNA 片段?( ) A.215 B.230 6031C.2 D.2 解析:DNA 片段以指数扩增 答案:B 1 2 3 4 5 6 3.要使 PCR反应在体外的条件下顺利地进行 ,需要严格地控制 ( ) A.氧气的浓度 B.酸碱度 C.温度 D.大气的湿度 解析:DNA 的变性、复性、延伸都是温度控制。
答案:C 1 2 3 4 5 6 4.在 温度下,DNA 的双螺旋结构解开 ( ) A.10 ℃ B.94 ℃ C.72 ℃ D.40~60 ℃ 答案:B 1 2 3 4 5 6 5.鉴定 DNA 可用( ) A.斐林试剂 B.重铬酸钾溶液 C.二苯胺试剂 D.苏丹Ⅲ染液 答案:C 1 2 3 4 5 6 6.在进行 DNA 亲子鉴定时,需大量的 DNAPCR技术(聚合酶链式反应 )可以使样品 DNA 扩增,获得大量 DNA 克隆分子该技术的原理是利用DNA 的半保留复制 ,在试管中进行 DNA 的人工复制(如下图,图中加粗线段代表引物)在很短的时间内将 DNA 扩增几百万倍甚至几十亿倍 ,使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体 (1)图中的变性、延伸分别是指 、 (2)假设 PCR反应中的 DNA 模板为 P,第一轮循环的产物 2个子代 DNA 为N1,第二轮的产物 4个子代 DNA 为 N2,N1、N2中分别含有模板 DNA 单链的 DNA 分别有 个、 个。
(3)若下图为第一轮循环产生的产物请绘出以a链和 b 链为模板经 PCR扩增的产物 1 2 3 4 5 6 解析:(1)变性是在高温下,DNA 解旋成单链;延伸是指在 DNA 聚合酶的催化下合成子链 (2)亲代 DNA 是一个,有 2条模板链,因为 DNA 是半保留复制,所以,N1、N2中都含有 2个含亲代模板链的 DNA 分子 (3)DNA 两条链互补配对,a链上无引物,b链上有引物 A从题图上看出,引物 A 与 a链配对,引物 B与 b链配对 答案:(1)模板 DNA 双链解旋形成单链 在 DNA 聚合酶的作用下,原料脱氧核苷酸聚合形成新的 DNA 链 (2)2 2 (3)如图 。