第十第十节 产气气荚膜梭菌膜梭菌检验食品食品食品食品卫卫生微生物学生微生物学生微生物学生微生物学检验检验产产气气气气荚荚膜梭菌膜梭菌膜梭菌膜梭菌检验检验Microbiological examination of food hygieneMicrobiological examination of food hygiene Examination of Clostridium perfringens Examination of Clostridium perfringens魏氏梭菌魏氏梭菌 目录1、概述2、生物学特性〔菌体形状学特征、 培育特性和抵抗力〕3、毒素与分型4、培育基和试剂5、检验程序6、阐明amozeshonline/.../ 09/uuoeoeoeuoeuuu.html 1 1、概述、概述 产气荚膜梭状芽孢杆菌产气荚膜梭状芽孢杆菌 又称魏又称魏/ /卫氏梭菌卫氏梭菌分布：自然界广泛存在分布：自然界广泛存在( (创伤感染〕创伤感染〕易污染食品：动物性食品原料易污染食品：动物性食品原料 食食品品加加热热后后未未及及时时冷冷却却，，所所含含耐耐高高温温而而剩剩余余的的产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌芽芽孢孢会会迅迅速速发发芽芽，，大大量量繁繁衍衍，，菌菌数数可可达达数数1010万万/g/g，，食食用用前前又又未未加加热热，，那那么么有能够引起产气荚膜梭菌食物中毒。
有能够引起产气荚膜梭菌食物中毒 食食品品中中产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌检检验验的的主主要要目目的的是是检检验验食食品品被被该该菌菌污污染染的的程程度度，，其其重重点点工工程程是是活活菌菌数数测测定定及及证证明实验 2 2、生物学特性、生物学特性1)1)形状与染色形状与染色 G+(G+(陈旧旧培培育育物物阴阴性性菌菌〕〕无无鞭鞭毛毛可可构成构成荚膜和芽胞的大杆菌膜和芽胞的大杆菌大小：大小：为(1(1－－2)μm X(22)μm X(2－－10)μm 10)μm 芽芽孢：：卵卵圆形形位位于于菌菌体体中中央央或或近近端端，，直直径大于菌体的径大于菌体的 直径，有的菌株直径，有的菌株难构成芽胞构成芽胞荚膜膜：：在在人人和和动物物活活体体组织内内，，或或在在含含血清的培育基血清的培育基 内生内生长时可构成可构成荚膜Clostridium perfringensbiol.vt.edu/ research/micimm/index.phporegonstate.edu/research/Images/SarkerSlide.jpg course.tjac.edu/shouyiweishengwu/图片资图片资料料/产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌.jpguni-ulm.de/.../ Diagnostik/Erreger/c_keim.htm 2)2)培育特性培育特性* *不不严厉的的厌氧氧* *普普通通营养养琼脂脂上上可可生生长，，假假设参参与与葡葡萄萄糖糖、、血血液液那那么么生生长更更好。
好 * *适宜生适宜生长温度温度为37—47℃37—47℃ *生生长和繁衍速度极快，在适宜条件下和繁衍速度极快，在适宜条件下8min/8min/代 *在在45℃45℃高温下可高温下可进展快速分展快速分别纯培育，每培育培育，每培育3—4h3—4h 传种种1 1次，次，较易分易分别纯化 Clostridium Perfringens Toxindtirp.dtra.mil/.../ agents/AgentsBW_toxins.asp 肝片肉肝片肉肝片肉肝片肉汤汤培育：培育：培育：培育： －－大量－－大量－－大量－－大量产产气，培育气，培育气，培育气，培育5h-6h5h-6h5h-6h5h-6h变浑浊变浑浊；；；；牛奶培育基中生牛奶培育基中生牛奶培育基中生牛奶培育基中生长长：：：： －－可以分解乳糖－－可以分解乳糖－－可以分解乳糖－－可以分解乳糖产产酸，将酪蛋白凝固酸，将酪蛋白凝固酸，将酪蛋白凝固酸，将酪蛋白凝固 产产生大量气体，冲散酪蛋白，生大量气体，冲散酪蛋白，生大量气体，冲散酪蛋白，生大量气体，冲散酪蛋白， 使其成海使其成海使其成海使其成海绵绵状。
状庖肉培育基中培育：庖肉培育基中培育：庖肉培育基中培育：庖肉培育基中培育： －－－－－－－－产产生大量气体，肉渣或肉生大量气体，肉渣或肉生大量气体，肉渣或肉生大量气体，肉渣或肉块块 略略略略带带粉粉粉粉红红，但不消化但不消化但不消化但不消化普通普通普通普通琼琼脂平板上培育：脂平板上培育：脂平板上培育：脂平板上培育： －－－－－－－－15h15h15h15h－－－－ 24h 24h 24h 24h构成构成构成构成S S S S型菌落，型菌落，型菌落，型菌落， 在在在在营营养缺乏或养缺乏或养缺乏或养缺乏或琼琼脂脂脂脂浓浓度度度度 高的平板上可构成高的平板上可构成高的平板上可构成高的平板上可构成锯齿锯齿状状状状带带 放射条放射条放射条放射条纹纹的的的的R R R R型菌落 msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.htmlat 45C， Clostridium perfringens is virtually the only organism that will produce the Stormy Fermentation 。
鲜鲜血血琼琼脂平板生脂平板生长长：： －－菌落周－－菌落周围围出出现现双双层层溶血溶血环环，内，内层层溶血完全，外溶血完全，外 层层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带带灰黄灰黄 色至浅灰褐色，与空气接触色至浅灰褐色，与空气接触30min30min后，有后，有时时能能够够 逐逐渐变为渐变为灰灰绿绿色、甚至色、甚至鲜绿鲜绿色，色，这这是本菌的特是本菌的特 征之一 Clostridium perfringens bacteria on a blood agar plate Courtesy Glenn Songer, The University . of Arizona College of Agriculture and Life Sciences. ： genomenewsnetwork.org/ articles/01_02/Clos... Clostridium perfringens shows double-zone hemolysis on blood agar. Note the small area of beta hemolysis (complete lysis of red blood cells) surrounded by a larger zone of alpha hemolysis (partial hemolysis). The plate is sitting on a black lab bench cat.md.us/.../ labmanua/lab16/bloodcp.html Clostridium perfringens Growing on Blood Agar genomenewsnetwork.org/ articles/01_02/Clos...cat.md.us/.../ labmanua/lab16/bloodcp.html 菌落周菌落周围围出出现现乳光乳光浑浑浊带浊带，此反响能被本菌的，此反响能被本菌的αα抗毒素抑制。
抗毒素抑制 * *由于由于发发酵乳糖，菌落酵乳糖，菌落周周围围的培育基的培育基颜颜色色发发生生变变化化 * *本菌不消化牛奶，不本菌不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周分解游离脂肪，菌落周围围不出不出现现透明透明环环及虹彩及虹彩层层〔〔肉毒梭菌可构成〕肉毒梭菌可构成〕sat.affrc.go.jp/.../ Cl_perfringens.htm乳糖牛奶卵黄乳糖牛奶卵黄琼琼脂平板上培育：脂平板上培育： 3) 3) 生化特性生化特性 * *发发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产产酸酸产产气，气， * *液化明胶液化明胶* *复原硝酸复原硝酸盐为亚盐为亚硝酸硝酸盐盐 *能将能将亚亚硫酸硫酸盐盐复原复原为为硫化物，硫化物， 在含在含亚亚硫酸硫酸盐盐及及铁盐铁盐 的的琼琼脂中构成黑色菌落脂中构成黑色菌落 * *发酵牛奶中酵牛奶中的乳糖，使牛奶的乳糖，使牛奶凝固，同凝固，同时大量大量产气，凝气，凝块碎裂，碎裂，即所即所谓‘‘‘‘暴暴风雨式雨式发酵〞，酵〞，这是本是本菌的重要生化特菌的重要生化特征之一，也是征之一，也是鉴别的主要目的。
的主要目的woodsend.org/ aaa/micro.html 4 4〕抵抗力〕抵抗力 A A型型与与C C型型菌菌株株的的芽芽胞胞：：耐耐热热性性强强，，煮煮沸沸1 1－－3h3h，， 繁衍型菌体不耐繁衍型菌体不耐热热pouch-hcho.co.jp/ japanese/virus23.html 3、毒素、酶与分型 毒素：产气荚膜梭菌能产生外毒素和肠毒素 外毒素：致死毒素、坏死毒素和溶血毒素， 毒性不强不耐热 肠毒素：不耐热，60℃经10min即可破坏不 耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶 等蛋白分解酶比较稳定 酶 ：纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶等 这些毒素和酶促使组织分解、坏死、产气、水肿及病变分散和全身中毒等 分型：分型： 根据毒素和抗血清中和实验将此菌分成根据毒素和抗血清中和实验将此菌分成A，，B，，C ，，D，，E 和和F六个型 A型：最常见，引起气性坏疽和食物中型：最常见，引起气性坏疽和食物中 毒；毒； A型最早由型最早由Welch andNuttal(1892)分别，分别， 所以叫卫氏所以叫卫氏/魏氏梭菌魏氏梭菌 C型：可引起肠炎。
型：可引起肠炎 *对人致病的主要是对人致病的主要是A、、C和和F型型 *引起食物中毒的主要是引起食物中毒的主要是A型型 4 4、培育基和、培育基和试剂试剂4.1 4.1 庖肉培育基庖肉培育基 －－－－产产生大量气体，肉渣或肉生大量气体，肉渣或肉块块略略带带粉粉红红，但，但不消化不消化 4.2 4.2 亚亚硫酸硫酸盐盐- -多粘菌素多粘菌素- -磺胺磺胺嘧啶琼嘧啶琼脂〔脂〔SPSSPS〕〕 -- -- 能将能将亚亚硫酸硫酸盐盐复原复原为为硫化物，在含硫化物，在含亚亚硫酸硫酸盐盐及及 铁盐铁盐( (含有含有柠柠檬酸檬酸铁铁胺胺) )的的琼琼脂中构成黑色菌落；脂中构成黑色菌落；前面前面 分分别别培育和培育和计计数用数用 〔〔SPS〕〕 4.3 液体硫乙醇酸盐培育基〔液体硫乙醇酸盐培育基〔FT〕〕 －－大量培育该菌用－－大量培育该菌用4.4 动力力—硝酸硝酸盐培育基培育基 --无鞭毛，不运无鞭毛，不运动；； 复原硝酸复原硝酸盐为亚硝酸硝酸盐 4.5 4.5 含含铁牛奶培育基牛奶培育基 -- --发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量大量产气，气，凝凝块碎碎 裂，裂， 即所即所谓‘‘‘‘暴暴风雨式雨式发酵〞酵〞/“/“暴烈暴烈发酵〞，酵〞，这是本菌的是本菌的 重要生化特征之一，也是重要生化特征之一，也是鉴别的主要目的。
察的主要目的察看看2h2h，， 5h 5h不不发酵酵为阴性阴性Iron Milk Medium. It is a medium used in Most Probable Number analysis of Clostridium perfringens. When placed at 45C, CP is virtually the only organism that will produce the Stormy Fermentation (seen in the right tube). The coagulation of milk fat forms a plug thereby restricting oxygen (which is necessary for this strict anaerobe). Stormy fermenation usually occurs within 6 to 8 hoursmsu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html 4.6 4.6 卵黄琼脂培育基卵黄琼脂培育基 －－检查卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶阳性，接种点〔每个－－检查卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶阳性，接种点〔每个平板接平板接 种种1010点以上〕的底部及其周围构成乳白色的浑浊点以上〕的底部及其周围构成乳白色的浑浊带。
带4.7 0.14.7 0.1％％ 蛋白胨水稀释剂；蛋白胨水稀释剂；4.8 4.8 硝酸盐复原试剂硝酸盐复原试剂: :甲萘胺液和对氨基苯磺酸液；甲萘胺液和对氨基苯磺酸液；4.9 4.9 革兰氏染色液革兰氏染色液pouch-hcho.co.jp/ japanese/virus23.html肉毒梭菌肉毒梭菌对比对比 5 5、检验程序、检验程序 计数计数30～～300个个菌落的稀释倍数菌落的稀释倍数活菌计数培育活菌计数培育 检验程序程序——续36℃，18～24h36℃，24h ＋46℃,2～5h 迸发酵无无 6 6、、阐阐明明 1 1．活菌．活菌计计数培育数培育 ：：1 1：：1010稀稀释释的的样样品用蛋白品用蛋白胨胨水水依次依次 稀稀释释至至10-210-2－－10-610-6倍，取倍，取1ml1ml放入放入2 2个平板，个平板，分分别别加加 15ml SPS 15ml SPS琼琼脂，于脂，于36℃36℃培育培育24h24h，，选选取取长长有有30—30030—300 个黑色菌落的平板，个黑色菌落的平板，计计数黑色菌落数。
数黑色菌落数 msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html 2 2、、证明明实验 (1) (1)纯培育：由平板上任取培育：由平板上任取1010个黑色菌落，分个黑色菌落，分别接种接种 FT FT培育基，于培育基，于(36±1)℃(36±1)℃培育培育1818－－24h24h，大量繁衍大量繁衍 (2)(2)菌体形状和染色菌体形状和染色检验：用培育液涂片，革：用培育液涂片，革兰氏氏 染色染色镜检产气气荚膜梭菌膜梭菌为革革兰氏阳性氏阳性 粗大杆菌，其耐粗大杆菌，其耐热株有卵形芽株有卵形芽孢，位于，位于 菌体中央或近端菌体中央或近端 (3)(3)检查动力和硝酸力和硝酸盐复原复原实验：： 用用接接种种环( (针) )穿穿刺刺接接种种动力力——硝硝酸酸盐培培育育基基，，于于(36 ±1)℃(36 ±1)℃培育培育24h.24h. -- --判判别有无有无动力力----产气气荚膜梭菌无膜梭菌无动力；力； ----滴滴加加硝硝酸酸盐复复原原试剂““甲甲萘胺胺液液和和对氨氨基基苯苯磺磺酸酸液液〞〞各各0.5 0.5 mlml，，察察看看硝硝酸酸盐能能否否被被复复原原----产气气荚膜膜梭梭菌菌，，能能将将硝硝酸酸盐复复原原为亚硝硝酸酸盐。
＋＋ 〔〔红色〕色〕 (4)牛乳乳糖牛乳乳糖发酵酵产气气“迸迸发酵〞酵〞实验：： 取生取生长旺盛的旺盛的FT培育培育液液1ml接种于含接种于含铁牛乳培牛乳培育基，在育基，在46℃℃水浴中培育水浴中培育2h后察看有无后察看有无“迸迸发酵〞酵〞景象5h内不内不发酵者酵者为阴阴性 －－－－产气气荚膜梭菌膜梭菌发酵酵乳糖，乳糖，产酸凝固酪蛋白并酸凝固酪蛋白并大大 量量产气，呈气，呈“暴暴风雨式雨式发酵〞景象，但培育基不酵〞景象，但培育基不变黑 (5)(5)卵磷脂酶检查实验：用接种环取卵磷脂酶检查实验：用接种环取FTFT培育液点种于卵黄培育液点种于卵黄 琼脂平板琼脂平板( (每块平板每块平板 至少可接种至少可接种1010点点) )，于厌氧，于厌氧 培育，察看接种点的变化产气荚膜梭菌产生卵培育，察看接种点的变化产气荚膜梭菌产生卵 磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及 周围乳白色的混浊带周围乳白色的混浊带 3 3、菌数计算、菌数计算 根据黑色菌落的计数和证明实验的结果，计根据黑色菌落的计数和证明实验的结果，计算算1 g(ml)1 g(ml)食品检样的含菌数。
食品检样的含菌数 例如：例如：1010－－4 4稀释液的平板长有黑色菌落稀释液的平板长有黑色菌落100100个，个，而供做证明实验的而供做证明实验的1010个菌落中有个菌落中有7 7个被确证为产气个被确证为产气荚膜梭菌，那么荚膜梭菌，那么1g(mL)1g(mL)食品检样所含产气荚膜梭食品检样所含产气荚膜梭菌数为菌数为计算：计算：msu.edu/course/ fsc/441/resulex10.html 复习题1、食品中产气荚膜梭菌检验的主要目、食品中产气荚膜梭菌检验的主要目的就验食品被该菌污染的程度，因此，的就验食品被该菌污染的程度，因此，其检验的重点工程是活菌数测定及证其检验的重点工程是活菌数测定及证明实验能引起奶中乳糖迸发酵能引起奶中乳糖迸发酵2、对产气荚膜梭菌的检验程序进展阐、对产气荚膜梭菌的检验程序进展阐明。