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1、食品微生物检验食品微生物检验规范操作根底培训规范操作根底培训4 接种、分别纯化接种、分别纯化福建出入境检验检疫局技福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验术中心食品所微生物实验室室2019.05主要内容：主要内容： 1清洗、消毒和清洗、消毒和灭菌操作菌操作 2培育基的制培育基的制备 3采采样和取、制和取、制样 4接种、分接种、分别纯化化 5制片、染色及制片、染色及显微察看微察看 6实验室平安根底知室平安根底知识4接种、分别纯化4.1接种 将微生物接到适于它生长繁衍的人工培育基上或活的生物体内的过程叫做接种。 4.1.1接种工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈
2、7.接种锄 8.小解剖刀 图4-1接种和分别工具4.1.2无菌操作 培育基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具如接种针和吸管等在无菌条件下接种含菌资料如样品、菌苔或菌悬液等于培育基上，这个过程叫做无菌接种操作。 在实验室检验中的各种接种必需是无菌操作。 接种时，翻开培育皿的时间应尽量短。用于接种的器具必需经干热或火焰等灭菌。 接种环的火焰灭菌方法：通常接种环在火焰上充分烧红接种柄，一边转动一边渐渐地来回经过火焰三次，冷却，先接触一下培育基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌资料或菌体，迅速地接种到新的培育基上。然后，将接种环从柄部至环端逐渐经过火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免残留在接种环上的
3、菌体爆溅而污染空间。 平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培育皿的盖翻开一小部分进展接种。在向培育皿内倒培育基或接种时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上经过。4.2接种法与纯培育的分别技术 含有一种以上的微生物培育物称为混和培育物Mixed culture。 假设在一个菌落中一切细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培育Pure culture。 在进展菌种鉴定时，所用的微生物普通均要求为纯的培育物。得到纯培育的过程称为分别纯化。 4.2.1平板划线分别培育法 平板划线分别培育法，用无菌的接种环取培育物少许在平板上进展划线，使培育物中混在的多种细菌在培育基外表分
4、散生长，各自构成菌落，根据菌落的形状及特征，挑选单个菌落，经过移种而获得纯种细菌纯培育。 分别细菌的方法很多，最常用的是平板划线分别法。根据划线的方式不同有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。图4-2 图4-2平板划线分别法 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法 1.曲线划线分别法1)先将接种环火焰灭菌,待冷后取培育物少许;2) 左手拿起平板，以中指为支点，并用拇指和食指将平板盖翻开；3)右手迅速将取有培育物的接种环从翻开的空间插入平板内，使接种环与培育基外表呈45角，在酒精灯上方56cm处划线接种。先在平板上1/5处悄然涂布，然后即可左右来回以曲线方式作延续划线接
5、种，线与线间留有适当间隔，将整个平板外表划满曲线；4)注明标识后，置35培育箱中培育，普通在1824小时后察看结果。2.斜线(分区)划线分别法 1)用接种环先将培育物涂布于平板1区并作数次划线,再在2、3区依次划线。2)每划完一个区域，均将接种环灭菌一次，待冷后再划下一区域。3)每一区域的划线均接触上一区域的接种线12次，使接种量逐渐减少，以获得单个菌落。4)其他操作与上述曲线划线分别法一样。斜线接种表示图斜线接种表示图3.方格划线法 将培育物涂布于平板上1/5处，接种环经火焰灭菌后，自1/5划线处作平行划线56条，将接种环灭菌后，划垂直线56条，使呈正方形格。其他操作同前。 细菌在固体培育基
6、外表只能在固定的地方生长繁衍，经过一定的培育时间后，可构成肉眼可见的菌落。菌落中只含有一种细菌，而每种细菌的菌落各有其特征。菌落形状往往有助于初步识别细菌；还可以由此获得细菌而进展一系列的鉴定。 识别菌落的才干是从事微生物检验人员的极为重要的根本功。菌落形状察看1)大小:以mm表示。菌落的大小随细菌种类、培育基及培育时间等条件而不同。同一种细菌在同一平板上，在密集处的菌落比疏散处小。因此，表示菌落大小时，应注明培育基称号。普通以培育1824小时后，选散在处的菌落大小。1mm左右为小菌落；23mm为中等大；3mm以上为大菌落。2)外形及边缘：圆形、不规那么、放射状、树根状、边缘整齐、波形、锯齿状
7、、卷发状等。3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。4)外表：光滑S型、粗糙R型；有无光泽等。 图4-3细菌的培育特征1.点状 2.圆形 3.丝状 4.不规那么形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状 30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状5)构造:
8、均匀、露滴状、颗粒状、发状、皱招状等。6)颜色：无色、白色、灰色、灰白色或乳白色、荧光绿、金黄色、柠檬色、红色等、7)透明度：透明、半透明、不透明、微透明等。8)硬度：硬、软、枯燥、潮湿，能否附着于培育基上或嵌入培育基内不易刮取。9)质地：脂状、粘液状、膜状等。10)乳化性：在盐水中研磨能否构成均匀乳剂或颗粒状。11)溶血性：在血平板上，菌落周围有无溶血环。4.2.2 斜面接种法 主要用于经划线分别培育所获得的单个菌落的移种，以及察看细菌的某些培育特征。 以菌种移种为例，其接种方法是：1.取一菌种管和培育基管，置左手食指、中指、无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于外侧，培育基管位于内
9、侧。2.右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。火焰灭菌接种环。3. 以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞先外管后内管，将两管口迅速经过火焰12次。4.将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸入待接种的培育基管中，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折延续划线，直至斜面上方顶端。5.取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞先塞内管；最后将接种环经火焰灭菌放好。6.做好标识，置35培育 箱中培育1824小时。斜面培育普通构成均匀一致的菌苔。普通可察看表面、透明度、色泽等特征。图4-4斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种
10、(6)塞好棉塞 4.2.3 液体接种法1.如斜面接种法持好菌种管及培育基管。2.灭菌接种环，从菌种管取菌，伸入培育基管中，在接近液面的管壁上方悄然研磨，并沾取少许培育基液体调和，使细菌混合于培育基的液体中。液体培育基普通以1824小时培育后察看生长特征。 肉汤培育可察看如下几项： a.发育程度：有无生长、微弱、中等、旺盛。 b.混浊度：有无及程度混、中等、微混、透明、均匀混浊、有颗粒、絮状生长。 c.沉淀:有无及量多少、性状粉状、颗粒状、絮状、沾性。 d.外表：有无生长、性状膜状、环状、菌膜厚薄及外表特征光滑、颗粒、皱状。 e.其他：有无特殊气味，色素。假设是糖发酵培育基那么主要察看能否产酸和
11、有无气体。 4.2.4 穿刺接种法 多用于保管菌种、察看动力及厌氧培育等也可以用于察看细菌的某些生化反响。1.如斜面接种法持好菌种管及培育基管。2.以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培育基的中心半固体或普通琼脂高层直达近管底部但不能完全刺到管底，接种针应沿原路退出。3.经培育后半固体培育基可察看到：沿穿刺线生长，线外的培育基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清，或沿穿刺线向外分散生长，或整个培育基混浊表示细菌有动力。4.2.5倾注平板法 首先把微生物悬液经过一系列稀释，取一定量1mL的稀释液参与已熔化并冷却至4550的15mL运用直径90mm的平皿时普通琼脂管中，立刻摇匀，趁琼脂未凝固前倾注于已
12、灭菌的平皿中，待凝固之后，将平板倒置在培育箱中培育。 图4-5 a 培育后察看，细菌大部分分散于琼脂层内，构成深层菌落，有一部分可生长于外表。图4-5倾注平板法a涂布平板法b图解 1.菌悬液 2.熔化的培育基 3.培育物 4.无菌水 稀释倒平板和涂布法稀释倒平板和涂布法4.2.6涂布平板法 首先把微生物悬液经过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的曾经凝固的琼脂平板上，然后用灭菌的L型玻璃棒把稀释液均匀地涂布在培育基外表上，经恒温培育后即可察看。图4-5 b 4.3 微生物的培育 研讨和鉴定细菌时所提到细菌的特征指的是细菌菌落的特征，而不是单个细菌的特征。大量食品微生物的质量检测是对可见菌株的
13、检测，如今衍变到给待检测细菌提供适当的条件使之代谢繁衍后再进展检测。因此在细菌学研讨中，最根本的要求是有能促使单个细菌生长和繁衍的物质和方法。能给细菌提供适当生长环境的营养物质称为培育基。 根据接种培育方式的不同，可将培育基以多种方式分装到试管、三角瓶或螺帽瓶中，试管或三角瓶的瓶口可用适当的棉塞、金属帽、塑料帽等盖紧。螺帽的优势是可以阻止蒸汽蒸发，防止培育基在保管过程中枯燥。4.3.1 培育的类型1.液体批量培育：在液体培育基中培育，培育过程不需求参与新的培育基。2.琼脂斜面培育：在试管中装入约5mL固体培育基融化后摆成斜面冷却。将接种物涂布到斜面或用接种环在斜面上划线。3.穿刺培育：将含琼脂培育基的试管或瓶子垂直放置，使培育基凝固，用接种针挑取少量接种物垂直穿入至容器的中部。4.半固体培育：菌株生长的培育基含有足够的琼脂0.02%0.3%使其有一定的黏度，但却没有完全固化。5.振荡培育：用摇床进展微生物振荡培育。6.平板培育：平板划线法、倾倒平皿法。根据培育时能否需求氧气，可分为：1.好氧培育： (1)固体外表培育法 ：斜面、培育皿、克氏瓶等 (2)液体培育法：静止、摇瓶振荡 2.厌氧培育： (1)深层穿刺培育 (2)化学吸氧与深层穿刺相结合 (3)抽气法：枯燥器、简易的真空和气体交换法、厌氧罐 4.3.2 微生物的培育方法 谢谢！
