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1、专题2细胞工程动物细胞融合与单克隆抗体章小寅章小寅 2016-5-19比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合原理原理融合前处理融合前处理使用的酶使用的酶诱导方法诱导方法主要用途主要用途细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物细胞全能性植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性纤维素酶、果胶酶纤维素酶、果胶酶胰蛋白酶胰蛋白酶 物理法物理法（离心、振动、电激）（离心、振动、电激） 化学法（化学法（PEG）物理、化学法物理、化学法灭活的病毒灭活的病毒获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合使细胞分散后使细胞分散
2、后诱导细胞融合诱导细胞融合植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较二、单克隆抗体二、单克隆抗体1.1.抗体是由何种细胞产生的？抗体是由何种细胞产生的？ 效应效应B B细胞（浆细胞）细胞（浆细胞）2.2.一个淋巴细胞一个淋巴细胞( (浆细胞浆细胞) )能分能分泌多种抗体吗？泌多种抗体吗？ 每一个淋巴细胞只分泌一每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体种特异性抗体3.3.一种抗原侵入机体之后，引起一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一机体免疫反应产生的抗体只有一种吗？种吗？ 动物在免疫反应过程中，体动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达内产生的特
3、异性抗体种类可多达百万种以上百万种以上出现在抗原分子表面、决定出现在抗原分子表面、决定抗原特异性的抗原特异性的特殊化学基团特殊化学基团.抗体的传统生产方法抗体的传统生产方法抗原抗原 反复注反复注射动物射动物从动物的从动物的血清血清中分离抗体中分离抗体该法制备抗体的缺点：该法制备抗体的缺点：产量低、纯度低，且抗产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度体的特异性差、灵敏度低。低。读下面一段资料，读下面一段资料，找出单克隆抗体的概念找出单克隆抗体的概念 人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B B细胞细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个可
4、以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B B细胞只分细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个一抗体，必须用单个B B细胞进行无性繁殖，即克隆。细胞进行无性繁殖，即克隆。2.1单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念单克隆单克隆抗体：单个抗体：单个B B细胞克隆产生的细胞克隆产生的化学性质化学性质单一、特异性强单一、特异性强的抗体的抗体提示提示1 1：对：对B B细胞进行细胞培养可行吗？细胞进行细胞培养可行吗？提示提示2 2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？问题：问题：
5、如何大量生产单克隆抗体？请尝试设如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计一个方案。计一个方案。2.2 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞能无限增殖骨髓瘤细胞能无限增殖杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞培养技术动物细胞培养技术设计方案：设计方案：动物细胞融合技术动物细胞融合技术单克隆单克隆抗体抗体 既能产生特异性抗体，既能产生特异性抗体， 又能大量增殖的细胞又能大量增殖的细胞米尔斯坦米尔斯坦（阿根廷）（阿根廷）和柯勒和柯勒（德国）（德国）【19841984年获得诺贝尔奖年获得诺贝尔奖】阅读课本阅读课本P P53-5453-54及
6、识图及识图2-242-24思考下列问题思考下列问题2.2 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程2.2 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程为什么给小鼠注射特为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？定的抗原蛋白？ 会有几种融合方式？会有几种融合方式？ 免疫处理，获得产生相免疫处理，获得产生相应抗体的应抗体的B B细胞细胞BBBB 、B B瘤瘤 、瘤瘤瘤瘤 （B B、瘤）、瘤）2.2 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 杂交瘤细胞是如何筛选杂交瘤细胞是如何筛选出来的？出来的？ 如何大规模进行培养得如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？到大量的单克隆抗体？一选一选：选择性培养基：选择性培养基： 只有只有
7、杂交瘤细胞杂交瘤细胞才能存活才能存活二选：二选： 克隆化培养和专一抗体检验克隆化培养和专一抗体检验 体外培养体外培养体外培养体外培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养小鼠腹腔内培养选出能产生所需专一抗体的选出能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交细胞杂交细胞诱导细胞融合诱导细胞融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞筛选筛选杂交瘤细胞群杂交瘤细胞群单克隆抗体单克隆抗体体内或体外培养体内或体外培养 提取提取动物动物细胞细胞融合融合技术技术动物动物细胞细胞培养培养技术技术注射抗原注射抗原经过免疫的经过免疫的B淋巴细胞淋巴细胞 免疫免疫单单克克隆隆抗抗体体的的制制备备过过程程特点：
8、既能大量繁殖又特点：既能大量繁殖又能产生专一抗体能产生专一抗体特点：特异性强、灵敏特点：特异性强、灵敏度高、可大量制备度高、可大量制备特异性杂交瘤细胞特异性杂交瘤细胞克隆化培养克隆化培养 专一抗体检验专一抗体检验筛选筛选 肿瘤细胞增增殖方式和产物是A无丝分裂和逆转录抗体B减数分裂和转基因抗体C有丝分裂和单克隆抗体D减数分裂和单克隆抗体根据已学的知识，能否利用其它方法根据已学的知识，能否利用其它方法获得单克隆抗体？获得单克隆抗体？ 英国科学家斯勒和米尔坦斯英国科学家斯勒和米尔坦斯,将将B淋巴细胞淋巴细胞产生抗体的基因转移到肿瘤细胞内产生抗体的基因转移到肿瘤细胞内,成功获得世成功获得世界上第二株能
9、稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞界上第二株能稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞株。株。2.3 单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程三个三个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势单克隆抗体最主要的优点：单克隆抗体最主要的优点：特异性强，灵敏特异性强，灵敏度高，并能大量制备。度高，并能大量制备。1、诊断试剂、诊断试剂最广泛应用最广泛应用准确、高效、简易、快速准确、高效、
10、简易、快速2、定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病利用同位素标记单抗，在特定组织成像甲胎蛋白(AFP)是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为抗原免疫小鼠，制备抗AFP单克隆抗体，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过全身血液渗透到所有组织。由于肿瘤细胞表面的AFP会和单克隆抗体特异性结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在肿瘤上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在的位置。“生物导弹生物导弹” 单克隆抗体药物单克隆抗体药物3、治疗疾病和运载药物、治疗疾病和运载药物主要用于治疗主要用于治疗癌症治疗癌症治疗，单克隆抗体作为载体，运载抗，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形
11、成癌药物，形成“生物导弹生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。准确杀伤癌变细胞。单抗导向，药物为弹头单抗导向，药物为弹头【例例4 4】科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（ ）A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 C.C.经过免疫的经过免疫的T T淋巴淋巴细胞细胞B.B.不经过免疫的不经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.不经过免疫的不经过免疫的B B淋淋巴细胞巴细胞【例例5 5】单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的单克
12、隆抗体是由下列哪种细胞产生的 （ ）A.A.B B淋巴细胞淋巴细胞 B BT T淋巴细胞淋巴细胞 C C骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 D D杂交瘤细胞杂交瘤细胞AD【例例6】用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中列实验步骤中错误错误的是（的是（ ）A A将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B B淋巴淋巴细胞细胞B B用纤维素酶处理用纤维素酶处理B B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C C用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B B淋巴淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合细胞与小鼠
13、骨髓瘤细胞融合D D筛选杂交细胞，并从中选出能产生所需抗体的筛选杂交细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体细胞群，培养后提取单克隆抗体B(1)(1)若若A A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B B细胞是取自小鼠细胞是取自小鼠体内的体内的 细胞，细胞，从小鼠体内提取分离该细胞之从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射前，应给小鼠注射_类物质。类物质。（2）d过程过程是一个是一个_过程，该过程的进过程，该过程的进行常用行常用_或或_的诱导。的诱导。(3)(3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成 种种类型的类型的C C细胞
14、，因此需用细胞，因此需用_培养基筛选出培养基筛选出D D细胞细胞用于培养，用于培养，D D细胞的名称是细胞的名称是 ，其特点是，其特点是_。效应效应B 抗原抗原 细胞融合细胞融合 聚乙二醇聚乙二醇 灭活的病毒灭活的病毒 选择性选择性 3既能无限增殖又能产生特异性抗体既能无限增殖又能产生特异性抗体 杂交瘤细胞杂交瘤细胞(4)(4)在培养时通过在培养时通过_分裂方式大量繁殖。分裂方式大量繁殖。D D细细胞体外培养需要注意的条件是（要求答胞体外培养需要注意的条件是（要求答5 5项）项）_。（5 5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特
15、点是与常规抗体相比，其特点是_。特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 有丝有丝有丝有丝无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和pHpH；适宜的气体环境适宜的气体环境 1515、（1）单克隆抗体是指）单克隆抗体是指 。（2 2）制备单克隆抗体的步骤：）制备单克隆抗体的步骤：将将_注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细胞，其中至少胞，其中至少1 1个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。将步骤将步骤获得的获得的B B淋巴细胞与步骤淋巴细胞与步骤培养的骨髓瘤细胞培养的骨髓瘤细胞在在_的诱导下融合。的诱导
16、下融合。将诱导后产生的多种细胞，放在将诱导后产生的多种细胞，放在_培养基的多孔培养基的多孔培养板上培养，筛选。培养板上培养，筛选。这样获得的杂交瘤细胞既具有这样获得的杂交瘤细胞既具有B B淋巴细胞淋巴细胞_的能力，又具有的能力，又具有_的本领。的本领。检测和分离带有抗检测和分离带有抗X X抗体的阳性细胞，培养板中每孔放抗体的阳性细胞，培养板中每孔放一个细胞进行培养。一个细胞进行培养。将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克隆抗体。隆抗体。化学性质单一，特异性强的抗体化学性质单一，特异性强的抗体 抗原抗原 聚乙二醇聚乙二醇选择性选择性 无限
17、增殖无限增殖 产生专一抗体产生专一抗体（3）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：体外培养法，可获得体外培养法，可获得10 g/mL的抗体；的抗体；动物体内动物体内诱生法可获得诱生法可获得520mmg/mL的抗体。你选择的方法及原的抗体。你选择的方法及原因是因是 。（4 4）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因为它是用小鼠的为它是用小鼠的_细胞制备的，其化学本质是细胞制备的，其化学本质是_，应用于人体，会作为，应用于人体，会作为 产生产生 ，解决这个问题的方法是，解决这个问题的方法是_。大量生产选大量生产选，小规
18、模生产选，小规模生产选效应效应B蛋白质蛋白质异物异物免疫反应免疫反应采用人的效应采用人的效应B细胞制备细胞制备15、右图为某同学根据杂交瘤技术、右图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。据图回答：体的实验方案。据图回答：（1）该方案能达到预期效果吗）该方案能达到预期效果吗？。原因是。原因是_。（2）图中）图中为为 过程，过程，常用常用 作为诱导剂。该细作为诱导剂。该细胞继承了胞继承了_ ，因此不仅能分泌，因此不仅能分泌_，还有，还有 本领。本领。不能不能 没有将抗原注入小鼠体内，无法获得没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生专一抗体的产生专一抗体的B淋巴细胞淋巴细胞 细胞融合细胞融合 灭活病毒灭活病毒 双亲细胞的遗传物质双亲细胞的遗传物质 特异性抗体特异性抗体 大量增殖大量增殖制备单克隆抗体制备单克隆抗体（3）该方案的目的是）该方案的目的是_。
