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1、 基因转移基因转移与与 基因治疗基因治疗20032003，1010基因转移与基因治疗基因：染色体上的基因：染色体上的DNA片段，是片段，是遗传信息结构和功能的基本单位。遗传信息结构和功能的基本单位。基因基因 决定决定 生老病死生老病死 控制控制 高矮胖瘦高矮胖瘦 影响影响 喜怒哀乐喜怒哀乐基因组：某一生物的细胞中所带有基因组：某一生物的细胞中所带有的全部遗传信息。的全部遗传信息。基因转移与基因治疗基因与疾病基因与疾病基因与人类的疾病密切相关：基因与人类的疾病密切相关：遗传病是由于基因先天缺陷所致遗传病是由于基因先天缺陷所致; 肿瘤的发生涉及多种基因改变肿瘤的发生涉及多种基因改变, 包括癌基包括
2、癌基因激活或抑癌基因失活因激活或抑癌基因失活; 高血压高血压, 糖尿病等多基因病也涉及到多种糖尿病等多基因病也涉及到多种基因的改变基因的改变; 由病原体所致的传染病也和人体基因密切由病原体所致的传染病也和人体基因密切相关相关, 存在易感人群和耐受人群存在易感人群和耐受人群. 基因转移与基因治疗一、基因治疗概念一、基因治疗概念 基因治疗基因治疗(Gene Therapy) (Gene Therapy) 指将正常基因或有治疗作用的基因指将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞通过一定方式导入靶细胞, ,纠正基纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目
3、的的生物医学高技达到治疗疾病目的的生物医学高技术。术。 基因转移与基因治疗TheapplicationofgeneticprinciplesintheTheapplicationofgeneticprinciplesinthetreatmentofhumandiseasetreatmentofhumandiseaseByintroductionofgeneticByintroductionofgeneticmaterialintotargetmaterialintotargetcellsinordertocounteracttheeffectofadiseasecellsinordertoco
4、unteracttheeffectofadiseasegeneorintroduceanewfunctiongeneorintroduceanewfunctionSomaticandGermlineapproachespossibleSomaticandGermlineapproachespossible基因转移与基因治疗基因治疗的必要条件基因治疗的必要条件UnderstandingofthediseaseprocessUnderstandingofthediseaseprocessStructure/functionofgenetobeintroducedStructure/function
5、ofgenetobeintroducedEfficientdeliveryofgenecontrolofgeneEfficientdeliveryofgenecontrolofgeneexpressionexpressionPrevention/controlofimmuneresponsesPrevention/controlofimmuneresponsesAnimalmodelandassessmentoffunctionAnimalmodelandassessmentoffunctionClinicaltrialClinicaltrial基因转移与基因治疗研究基因治疗的三个基本步骤研究
6、基因治疗的三个基本步骤寻找适当的靶细胞寻找适当的靶细胞导入目的基因导入目的基因基因表达基因表达基因转移与基因治疗体细胞基因治疗始终需要考虑的问题体细胞基因治疗始终需要考虑的问题基因转移的效率基因转移的效率治疗的特异性治疗的特异性基因表达的持久性及其调节基因表达的持久性及其调节治疗的毒副作用治疗的毒副作用 什么疾病什么疾病什么基因什么基因什么载体什么载体什么靶器官和靶细胞什么靶器官和靶细胞什么基因导入方法什么基因导入方法基因转移与基因治疗体细胞基因治疗体细胞基因治疗将基因作为一种特殊将基因作为一种特殊“药物药物”，通过，通过体细胞基因转移治疗疾病体细胞基因转移治疗疾病 慢性治疗慢性治疗急性治疗急
7、性治疗预防预防遗传性疾病遗传性疾病获得性疾病获得性疾病功能丧失功能丧失功能获得功能获得基因转移与基因治疗二、基因治疗和传统的基因工程的区别二、基因治疗和传统的基因工程的区别二者都着眼于寻找可治病或有其他应二者都着眼于寻找可治病或有其他应用价值的用价值的“目的基因目的基因”。 基因工程：基因工程： 目的基因目的基因载体载体导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞导入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞体外表达所需要的蛋白体外表达所需要的蛋白经过分离经过分离纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯化获得能用于治疗或其他用途的蛋白纯品纯品, 最终是制造出一种蛋白类的药物。最终是制造出一种蛋白类的药物。基因转移与基因治疗
8、 基因治疗基因治疗目的基因目的基因载体载体导入人体，目的基因在人体内的导入人体，目的基因在人体内的细胞中制造所需要的蛋白细胞中制造所需要的蛋白达到治达到治病的目的。病的目的。 基因治疗在技术上一旦成功基因治疗在技术上一旦成功, 其优其优势：势：制品为基因及其载体，非基因制品为基因及其载体，非基因表达蛋白产物表达蛋白产物,不需复杂的蛋白产物分不需复杂的蛋白产物分离和纯化工艺离和纯化工艺生产成本远远低于基生产成本远远低于基因工程产品因工程产品从理论上讲从理论上讲,凡能治病的凡能治病的基因，都有可能开发成为基因，都有可能开发成为“药物药物” 半衰期半衰期基因转移与基因治疗 但基因治疗难度高，技术要求
9、极为但基因治疗难度高，技术要求极为苛刻。例如，针对各种疾病，必须具有苛刻。例如，针对各种疾病，必须具有能够达到治病目的的基因。在此基础上，能够达到治病目的的基因。在此基础上，还必须具有能有效地将基因导入人体的还必须具有能有效地将基因导入人体的载体系统，这种系统要求高效，而且能载体系统，这种系统要求高效，而且能定向地导入人体某种细胞。基因导入人定向地导入人体某种细胞。基因导入人体后，必须能够控制它的表达。体后，必须能够控制它的表达。基因转移与基因治疗 因此，基因治疗是生物高技术的高因此，基因治疗是生物高技术的高度集成，是遗传学、分子生物学、细胞度集成，是遗传学、分子生物学、细胞生物学、分子病毒学
10、等多种学科知识和生物学、分子病毒学等多种学科知识和技术的高度综合。技术的高度综合。基因转移与基因治疗三、基因治疗的主要策略三、基因治疗的主要策略GenereplacementGenereplacementGeneaugmentationtherapy(GAT)Geneaugmentationtherapy(GAT)Genecorrection(Chimeraplasty)Genecorrection(Chimeraplasty)TargetedkillingofspecificcellsTargetedkillingofspecificcellsTargetedinhibitionofgene
11、expressionTargetedinhibitionofgeneexpression(Geneablation)(Geneablation)基因转移与基因治疗Gene replacement: Deficient gene corrected by replacing the mutated Deficient gene corrected by replacing the mutated allele with an intact allele; used for the treatment of allele with an intact allele; used for the tr
12、eatment of autosomal dominant disorders. autosomal dominant disorders. The strategies are as follows: The strategies are as follows: a) kockout mutation by single crossing-over a) kockout mutation by single crossing-over (insertional inactivation) (insertional inactivation) b) gene replacement by do
13、uble (reciprocal) crossing-b) gene replacement by double (reciprocal) crossing-overoverc) target gene inhibition in dominant negative genetic c) target gene inhibition in dominant negative genetic disorders; usually mutated proteins which interact disorders; usually mutated proteins which interact w
14、ith normal cellular proteins to create altered with normal cellular proteins to create altered properties; mutational inactivation of the one mutated properties; mutational inactivation of the one mutated copy will alleviate this mutant phenotype ; the copy will alleviate this mutant phenotype ; the
15、 mutation can be carried out by insertional inactivation, mutation can be carried out by insertional inactivation, or antisense technology. or antisense technology. 基因转移与基因治疗GeneAugmentationTherapy(GAT)Fordiseasescausedbylossofgenefunctionmorecopiesofnormalgeneraiselevelsofgeneproductrestorenormalph
16、enotypeApplyto:monogenicrecessivediseasescysticfibrosis,haemophilia,musculardystrophy基因转移与基因治疗GeneCorrection-Chimeraplasty基因转移与基因治疗tumour celltkthymidinekinasegeneviralvectorganciclovirganciclovirphosphateganciclovirphosphateTargetedKillingGeneticPro-drugActivationTherapy基因转移与基因治疗Targetedinhibitiono
17、fgeneexpressionRibozymes-cancleave(orrepair)mRNATriplehelixoligonucleotides-blockgenetranscriptionAntisenseoligos-blockmRNAtranslation基因转移与基因治疗All gene therapy strategies dependon getting the gene or genetic material into the target cells! 基因转移与基因治疗四、基因转移的主要方法：四、基因转移的主要方法： 若干相关术语：若干相关术语：Transfection
18、 Transfection 转染转染转染转染 ：过去：将病毒过去：将病毒过去：将病毒过去：将病毒DNADNA或或或或RNA RNA 转入细胞。转入细胞。转入细胞。转入细胞。 现在：将外源现在：将外源现在：将外源现在：将外源DNADNA转入动物细胞。转入动物细胞。转入动物细胞。转入动物细胞。DNA Transfer DNA Transfer 转移：转移：转移：转移：基因导入或转移广义的概念。基因导入或转移广义的概念。基因导入或转移广义的概念。基因导入或转移广义的概念。Transduction Transduction 转导：转导：转导：转导：噬菌体介导的细菌之间的基噬菌体介导的细菌之间的基噬菌体
19、介导的细菌之间的基噬菌体介导的细菌之间的基 因因因因 转移。转移。转移。转移。Transformation Transformation 转化：转化：转化：转化：将裸将裸将裸将裸DNADNA或质粒导入原核或质粒导入原核或质粒导入原核或质粒导入原核 和真核细胞。和真核细胞。和真核细胞。和真核细胞。基因转移与基因治疗Two main routes of gene transfer:In vivo: i.v. or i.m. injectable; or non-invasive (eg “sniffable”)Ex vivo: hepatocytes, skin fibroblastshaemat
20、opoietic cells“bioreactors”基因转移与基因治疗a a aaa aEx-vivoIn-vivotopical deliveryIn-vivosystemic deliveryVExamples:- bone marrow- liver cells- skin cellsExamples:- brain- muscle- eye- joints- tumorsExamples:- intravenous- intra-arterial- intra-peritonealTHREEclassesofanatomicalgenedelivery基因转移与基因治疗基因治疗过程中
21、的基因转移方法基因治疗过程中的基因转移方法Viral vectorsNon-viral vectorsPhysical methods目前最有效的是病毒载体，但存在目前最有效的是病毒载体，但存在插入大小有限、免疫原性强和生产插入大小有限、免疫原性强和生产难等局限难等局限基因转移与基因治疗1、病毒载体类型、病毒载体类型反转录病毒（反转录病毒（RV）载体）载体腺病毒（腺病毒（AV）载体）载体腺相关病毒（腺相关病毒（AAV）载体）载体单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV）载体）载体慢病毒（慢病毒（lentivirus)载体等载体等基因转移与基因治疗对载体的基本要求：对载体的基本要求：特异并有效的基因转
22、移特异并有效的基因转移特异、高效、持续性表达，具有可控性特异、高效、持续性表达，具有可控性免疫原性低免疫原性低易于生产易于生产基因转移与基因治疗载体特征载体特征： reproducibility stable propagated purified to high titers mediated targeted delivery基因转移与基因治疗Advantage and disadvantage of gene-transfer vector(1)Advantage and disadvantage of gene-transfer vector(1)VectorVector Advant
23、age Disadvantage Advantage DisadvantageAV Very high transfection ex vivo repeat dosing ineffective owing to AV Very high transfection ex vivo repeat dosing ineffective owing to & in vivo strong immune response & in vivo strong immune response Transfects proliferating & non- Insert-size limit 0f 7.5k
24、b Transfects proliferating & non- Insert-size limit 0f 7.5kb proliferating cells , substantial manufacture, storage, QC are proliferating cells , substantial manufacture, storage, QC are clinical experience acquired moderately difficult clinical experience acquired moderately difficult efficient ret
25、argeted transfction shout duration of expression efficient retargeted transfction shout duration of expression RV fairly prolonged expression lower transfection efficiency in vivo RV fairly prolonged expression lower transfection efficiency in vivo high transfection efficiency ex vivo insert-size li
26、mit of 8kb high transfection efficiency ex vivo insert-size limit of 8kb substantial clinical experience ex vivo transfect only proliferating cells,safty substantial clinical experience ex vivo transfect only proliferating cells,safty low immunogenicity concern of insertional mutagenesis low immunog
27、enicity concern of insertional mutagenesisLentivirus transfects proliferating & non- safety concern from immunodeficiencyLentivirus transfects proliferating & non- safety concern from immunodeficiency proliferating , haematopoietic virus origins, manufacturing, storage, proliferating , haematopoieti
28、c virus origins, manufacturing, storage, stem cells QC are extremely difficult, insert-size stem cells QC are extremely difficult, insert-size limit of 8kb, no clinical experience limit of 8kb, no clinical experienceAAV efficiently transfects a wide variety insert-size limits 4.5kbAAV efficiently tr
29、ansfects a wide variety insert-size limits 4.5kb 0f cells in vivo, very prolonged manufacture, QC are very difficult 0f cells in vivo, very prolonged manufacture, QC are very difficult expression in vivo little clinical experience, safety concern expression in vivo little clinical experience, safety
30、 concern low immunogenicity of insertional mutagenesis, repeat low immunogenicity of insertional mutagenesis, repeat dosing affectedly by neutralizing dosing affectedly by neutralizing antibody responses antibody responses 基因转移与基因治疗基因治疗病毒载体比较基因治疗病毒载体比较 RV AV AAV HSV LVRV AV AAV HSV LV基因组成基因组成 ssRNA
31、dsDNA ssDNA dsDNA dsRNA ssRNA dsDNA ssDNA dsDNA dsRNA基因组长度基因组长度 10kb 36kb 5kb 152kb 10kb 10kb 36kb 5kb 152kb 10kb装载容量装载容量 8kb 8kb 4.5kb 30kb 9kb 30KbcapacityGenerationIIIAdenocanbegrownatveryhightiters,HoweverDonotintegrateCancontainRCAsAretoxic/immunogenicExamplesOTCdeficiency(clin,-)CysticFibrosis
32、(clin,-)Oncolyticviruses(clin,+)基因转移与基因治疗腺病毒载体研究进展与展望腺病毒载体研究进展与展望 进展进展 展望展望Ad载体用于治疗性的载体用于治疗性的angiogenesis 降低毒性的方法将继续获得进展降低毒性的方法将继续获得进展,取得进展取得进展 最终将提供安全的最终将提供安全的Ad载体系统载体系统.Ad引起的毒性问题得到进一步认识引起的毒性问题得到进一步认识 靶向方法的应用将进一步改进靶向方法的应用将进一步改进.提高提高Ad载体的靶向性，改善疗效载体的靶向性，改善疗效 缺陷型的缺陷型的Ad载体生产将不断进展载体生产将不断进展.新一代新一代Ad载体能降低
33、毒性，改善表达载体能降低毒性，改善表达 将面临再次注射的挑战将面临再次注射的挑战基因转移与基因治疗反转录病毒载体基因转移系统反转录病毒载体基因转移系统辅助细胞辅助细胞: : 将含有病毒结构基因但缺将含有病毒结构基因但缺失了顺式包装信号的缺陷型反转录病失了顺式包装信号的缺陷型反转录病毒导入哺乳动物细胞（毒导入哺乳动物细胞（2 2 ，PA317PA317，CRIPCRIP）。可产生病毒包装蛋白但。可产生病毒包装蛋白但不产生病毒颗粒；不产生病毒颗粒；反转录病毒载体反转录病毒载体: :以外源目的基因替换以外源目的基因替换病毒结构基因病毒结构基因, ,含病毒包装信号含病毒包装信号辅助细胞提供载体包装蛋白
34、，使后者辅助细胞提供载体包装蛋白，使后者产生含外源目的基因的病毒颗粒产生含外源目的基因的病毒颗粒基因转移与基因治疗 缺陷型的反转录病毒颗粒的缺陷型的反转录病毒颗粒的RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整合到进入靶细胞后，变成前病毒并整合到宿主细胞的染色体上，可稳定表达外宿主细胞的染色体上，可稳定表达外源基因。源基因。 反转录病毒只能感染处于增殖期反转录病毒只能感染处于增殖期的细胞。的细胞。基因转移与基因治疗a a aaa aEfficiencyApproachesMurineRetrovirusesVSV-pseudotypedRVLentivirusesSelf-inactivatingRVCo
35、mbinationvirusesAdvantages/Limitations9Kbcapacity+integrationthroughtranspositionalsoinquiescentcells(HIV),permitinprinciplelong-termtreatments,howeverdisturbedby:InsertionalmutagenesisGenesilencingHighmutationrateLowtiterofproductionExamplesSCID(IL2Rdefect,Paris)(clin,+)AdenosineDeaminasedeficiency
36、(clin,+!)Parkinson(preclin,+)Anticancer(clin+/-)RecombinantRetroviruses(includesHIV-basedRecombinantRetroviruses(includesHIV-basedRecombinantRetroviruses(includesHIV-basedRecombinantRetroviruses(includesHIV-based) ) ) )基因转移与基因治疗 反转录病毒安全性问题反转录病毒安全性问题病毒感染的可能性病毒感染的可能性病毒在靶细胞基因组整合可导致病毒在靶细胞基因组整合可导致: 破坏细胞正
37、常生长必需的抑癌基因破坏细胞正常生长必需的抑癌基因 LTR激活原癌基因激活原癌基因 染色体重排激活原癌基因染色体重排激活原癌基因基因转移与基因治疗腺相关病毒（腺相关病毒（AAV） 载体：载体：4.7kb单链单链DNA，结构为，结构为 ITR-rep-cap-ITR ，病毒基因组简，病毒基因组简单，易于消除，可降低细胞毒性和单，易于消除，可降低细胞毒性和T-淋巴细淋巴细胞反应的危险性；病毒胞反应的危险性；病毒DNA可在人可在人19号染色号染色体上进行位点特异性整合，需要辅助因子出体上进行位点特异性整合，需要辅助因子出现才复制；其现才复制；其Rep蛋白可能介导这种定向整蛋白可能介导这种定向整合宿主
38、范围宽，易感染造血干细胞，能潜伏合宿主范围宽，易感染造血干细胞，能潜伏感染非分裂期细胞；在动物模型中表达可持感染非分裂期细胞；在动物模型中表达可持续半年以上。续半年以上。 但但AAV载体接纳的外源载体接纳的外源DNA小于小于4.5kb，载体整合效率较低，制备困难载体整合效率较低，制备困难基因转移与基因治疗a a aaa aEfficiencyRecombinantadeno-associated-virus(AAV)ApproachesApproachesHelper-Helper-dependentdependentproductionproductionHelperHelperindepe
39、ndentindependentproductionproductionCis-Cis-complementingcomplementingvectorsvectorsCo-infectionCo-infectionAdvantages/LimitationsAdvantages/LimitationsPersistenceinthegenomePersistenceinthegenomepermitslong-termexpression,permitslong-termexpression,hightitersareeasilyobtained,hightitersareeasilyobt
40、ained,immunogenicityisverylow,immunogenicityisverylow,HoweverHoweverSmallcapacity(4.5kb)whichSmallcapacity(4.5kb)whichdoesnotallowtoaccommodatedoesnotallowtoaccommodatelargegenesorgeneclusters.largegenesorgeneclusters.ExamplesExamplesHemophiliaB(clin,animal,+)HemophiliaB(clin,animal,+)Gaucher(clin,a
41、nimal,+)Gaucher(clin,animal,+)BrainIschemia(animal,+)BrainIschemia(animal,+)Cysticfibrosis(animal,+/-)Cysticfibrosis(animal,+/-)基因转移与基因治疗Lentivirus（慢病毒载体）（慢病毒载体）优点优点: 感染非分裂细胞感染非分裂细胞 ，有，有RV优势优势结构结构: LTR- gag- pol - env-LTR TAR tat, rev, tev应用应用: 宿主广泛宿主广泛; 艾滋病基因治疗艾滋病基因治疗问题问题: 安全性安全性基因转移与基因治疗HSV病毒病毒双链双
42、链DNA, 包括包括: HSV-1, 2, VZV, EB, CMV. 主要以主要以HSV-1型为主型为主.HSV载体含包装信号载体含包装信号, 复制复制位点等顺序结构位点等顺序结构, HSV病毒启动子病毒启动子,目的基因表目的基因表达框架达框架. 由辅助病毒共转染辅助细胞由辅助病毒共转染辅助细胞M64A, 制备制备重组病毒重组病毒. 辅助病毒的改造辅助病毒的改造: IE3 温度敏感突变型温度敏感突变型; 缺失突变型缺失突变型: IE3缺失缺失; 应用应用: 感染心肌细胞感染心肌细胞, 神经元神经元, 神经胶质细胞神经胶质细胞. VEGF-血管形成血管形成; 脑肿瘤脑肿瘤; 帕金森病帕金森病
43、基因转移与基因治疗a a aaa aRecap:currentlimitationsofpopularvectorsRecap:currentlimitationsofpopularvectorsAdenovirusAdenovirus-nopersistence-nopersistence-limitedpackaging-limitedpackaging-toxicity,toxicity,-immunogenicityimmunogenicityRetrovirus(incl.HIV)Retrovirus(incl.HIV)-limitedpackaging-limitedpackagi
44、ng-randominsertion-randominsertion-unstablegenome-unstablegenomeGeneralGeneral-antibodyresponse-antibodyresponse-limitedpackaging-limitedpackaging-genesilencing-genesilencingSolutions:Solutions:-syntheticviruses-syntheticviruses(“Virosomes”)(“Virosomes”)BiolisticbombardmentorlocaldirectinjectionBiol
45、isticbombardmentorlocaldirectinjection-limitedarea-limitedareaElectroporationElectroporation-limitedorganaccess-limitedorganaccessLiposomes,genecorrection&Co.Liposomes,genecorrection&Co.-veryinefficienttransfer-veryinefficienttransferGeneralGeneral-lowtransferefficiency-lowtransferefficiency-noorlit
46、tlegenomicintegration-noorlittlegenomicintegrationSolutions:Solutions:- -improvedliposomesimprovedliposomeswithviralproperties(“Virosomes”)withviralproperties(“Virosomes”)基因转移与基因治疗 非病毒载体除了基因转移的效非病毒载体除了基因转移的效率比较低以外，比病毒载体具有更率比较低以外，比病毒载体具有更多的优越性，将来会有多的优越性，将来会有viral-like, but artificial vectors.基因转移与基因治
47、疗PharmacologicalconsiderationsPharmacologicalconsiderationsforDNAtransferforDNAtransferClassicaldrugClassicaldrugClassicaldrugClassicaldrugMW50-500DaltonsMW50-500DaltonsSyntheticallypreparedSyntheticallypreparedRapiddiffusion/actionRapiddiffusion/actionOraldeliverypossibleOraldeliverypossibleCellula
48、rdelivery:Cellulardelivery:-actatcellsurface-actatcellsurface-permeatecellmembrane-permeatecellmembrane-importedthroughchannels-importedthroughchannelsCanbedeliveredassolublemoleculesCanbedeliveredassolublemoleculesngstrom/nmsizengstrom/nmsizerapidlyreversibletreatmentrapidlyreversibletreatment基因转移与
49、基因治疗Mw20,000-100,000DaMw20,000-100,000DaBiologicallypreparedBiologicallypreparedSlowerdiffusion/actionSlowerdiffusion/actionOraldeliverynotpossibleOraldeliverynotpossibleCellulardeliveryCellulardelivery-actextracellularly-actextracellularlyCanbedeliveredassolublemoleculesCanbedeliveredassolublemolec
50、ulesnmsizenmsizerapidlyreversibletreatmentrapidlyreversibletreatmentProtein drug基因转移与基因治疗Nucleic acidMwNx1,000,000DaMwNx1,000,000DaBiologicallypreparedBiologicallypreparedSlowSlowdiffusiondiffusionOraldeliveryOraldeliveryinconceivableinconceivableCellulardelivery:Cellulardelivery:-nonomembranetransl
51、ocationmembranetranslocation-nononucleartranslocationnucleartranslocation-nonobiologicalimportbiologicalimportMustMustbedeliveredascomplexcarrierparticlesbedeliveredascomplexcarrierparticles50-200nmsize50-200nmsizeslowlyornotreversibleslowlyornotreversible基因转移与基因治疗Therapywithnucleicacidsrequirespart
52、iculatedformulationismuchmorecomplexthanpreviousdrugdeliverieshasadifferentdegreeofreversibility(dosageproblem)基因转移与基因治疗2 2、非病毒及物理方法、非病毒及物理方法脂质体介导法脂质体介导法磷酸钙转染法磷酸钙转染法机械法（显微注射、基因枪等）机械法（显微注射、基因枪等）DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene转染法转染法电穿孔法电穿孔法超声波辅助法超声波辅助法纳米材料等纳米材料等基因转移与基因治疗中性脂质体中性脂质体 由脂类形成的可高效包装由脂类形成的可高效包装DNA的人造的
53、人造单层膜，其结构和性质与细胞膜极为相似，单层膜，其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，细胞的内吞作用使其进入二者易于融合，细胞的内吞作用使其进入细胞，操作简单细胞，操作简单 ，转染效率可高达，转染效率可高达50%，可用于体内试验，但目的基因表达不稳，可用于体内试验，但目的基因表达不稳定定基因转移与基因治疗阳离子脂质体：阳离子脂质体：阳离子脂质体在水中可阳离子脂质体在水中可形成大小约形成大小约100-400nm单层脂质体。其单层脂质体。其带正电，带负电的带正电，带负电的DNA可自动结合到带可自动结合到带正电的脂质体正电的脂质体上，形成上，形成DNA-DNA-阳离子脂质阳离子脂质体复合物，
54、与细胞膜作用使体复合物，与细胞膜作用使DNA进入细进入细胞。在该系统胞。在该系统体内基因导入效率低，且体内基因导入效率低，且无靶向性。在体内应用，除肿瘤瘤内注无靶向性。在体内应用，除肿瘤瘤内注射外，其前景仍存在问题。射外，其前景仍存在问题。基因转移与基因治疗基因转移与基因治疗磷酸钙转染法：磷酸钙转染法：将氯化钙、目的将氯化钙、目的DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成含有和磷酸缓冲液混合，沉淀形成含有DNA的极小的不溶性磷酸钙颗粒。磷的极小的不溶性磷酸钙颗粒。磷酸钙酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜，通过复合物粘附到细胞膜，通过胞饮进入受体细胞的细胞质，转染过胞饮进入受体细胞的细胞质，转染过程简单有效程
55、简单有效 ，适用于贴壁、非贴壁细，适用于贴壁、非贴壁细胞，转染效率可达胞，转染效率可达20%左右，但目的左右，但目的基因表达不稳定基因表达不稳定基因转移与基因治疗机械法机械法如显微注射和基因枪（如显微注射和基因枪（biolistic particle）。）。显微注射使用一根细针头将外源显微注射使用一根细针头将外源DNA直接转直接转入受体细胞核。基因枪使用高压入受体细胞核。基因枪使用高压DNA分子导分子导入细胞。入细胞。基基因因枪枪工工作作原原理理显显微微注注射射基因转移与基因治疗a a aaa aEfficiencyApproachesAntisenseRibozymes/DNAzymesTr
56、iplehelixDecoy/competitorsGene-correctingoligosAdvantages/Limitationstheseproceduresmaybesuitablefor:handlingdominantdefectstransienttreatments(genemodulation)permanenttreatments(genecorrection)ExamplesAnticancer(clin,preclin.,+/-)Restenosis(clin,+)MuscularDistrophy(animal,+)Oligonucleotides基因转移与基因治
57、疗电穿孔法电穿孔法通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导目的中转导目的DNA。细胞悬浮液置于电场。细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，这种电中会诱导沿细胞膜的电压差异，这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。一般，压差异会导致细胞膜暂时穿孔。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。或更高）的毒性。基因转移与基因治疗DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene转染法转染法 带正电的带正电的DEAE-葡聚糖或葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的外源多聚体复合物和带负电的外源DNA分子分子作用，使得作
58、用，使得DNA可以结合在细胞表面。可以结合在细胞表面。通过使用通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克或甘油获得的渗透休克将外源将外源DNA导入。两种试剂都已成功用导入。两种试剂都已成功用于转染。于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。葡聚糖仅限于瞬时转染。基因转移与基因治疗a a aaa aEfficiencyApproachesNakedDNAinjection/biolisticNakedDNA+pressureNakedDNA+electroporationLiposomalformulationsCombinationsAdvantages/LimitationsUnlimitedsiz
59、ecapacity+lowerimmunogenicityandlowerbio-riskofnonviralformulationsisdisturbedbyLowefficiencyofgenetransferEvenlowerstableintegrationExamplesCriticallimbIschemia(clin,+)CardiacIschemia(clin,+/-)Vaccination(clin,+/-)Antirestenosis(preclin.+/-)Naked/complexedDNANaked/complexedDNA基因转移与基因治疗a a aaa aIdea
60、lpropertiesofasystemicallydeliveredIdealpropertiesofasystemicallydeliverednon-viralformulationnon-viralformulationStabilityStabilityparticleshouldresistseruminactivationparticleshouldbeinerttoimmuneinactivationAddressabilityAddressabilityparticleshouldpossessavascularaddressingsignatureparticleshoul
61、dbearatissue-dockingspecificityDNAconstructshouldincludetissue-specificregulatoryelementsEfficiencyEfficiencycargoshouldbeprotectedfromcytoplasmicinactivation(ex.lysosomes)cargoshouldcontainnuclear-translocatingsignalsDNAcargoshouldincludegenome-integrationfunctionsDNAelementmustbeguaranteedtofuncti
62、onaftergenomicintegration(nosilencing)基因转移与基因治疗OtherpropertiesOtherpropertiesParticleshouldnotincludeimmunogenic/toxicsurfacesParticleshouldnotincludeimmunogenic/toxicsurfacescargoshouldnotencodeimmunogenic/toxicproductscargoshouldnotencodeimmunogenic/toxicproductsCargoshouldincludeanti-apoptoticfun
63、ctionsCargoshouldincludeanti-apoptoticfunctions severalindependentproblemsmustbesolvedforaseveralindependentproblemsmustbesolvedforanonviralformulationtobesuitableforclinicaltreatmentnonviralformulationtobesuitableforclinicaltreatmentandforindustrialproductionandforindustrialproductionmostviralvecto
64、rsincludemany,ifnotallthosemostviralvectorsincludemany,ifnotallthosepropertiesproperties基因转移与基因治疗裸裸DNA基因转移和治疗基因转移和治疗 进展进展展望展望裸裸DNA肌肉注射，活体转移肌肉注射，活体转移非病毒基因转移越来越重要非病毒基因转移越来越重要电击促进质粒电击促进质粒DNA进入肌肉皮肤进入肌肉皮肤未来几年遗传病临床试验将首选血友病未来几年遗传病临床试验将首选血友病血管内导入质粒血管内导入质粒DNA，肝细胞基因转移，肝细胞基因转移Duchenne 肌营养不良，关节炎等肌营养不良，关节炎等尾静脉导入
65、尾静脉导入pDNA，简单有效，转染大、，简单有效，转染大、 啮齿类的尾静脉注射作为快速检测表啮齿类的尾静脉注射作为快速检测表小鼠肝细胞小鼠肝细胞 达状况和基因治疗方法广泛应用达状况和基因治疗方法广泛应用pDNA表达载体可高水平持续表达表达载体可高水平持续表达血管内裸血管内裸DNA导入为细胞有效涉入导入为细胞有效涉入pDNARNAi将在基因治疗领域中成为重要手将在基因治疗领域中成为重要手裸裸DNA导入法已经在临床研究（导入法已经在临床研究（PAOD， 段段外周动脉闭锁症）外周动脉闭锁症）SiRNA可通过血管内基因转移法有效导入可通过血管内基因转移法有效导入Knockout 小鼠小鼠基因转移与基因
66、治疗a a aaa a problemsthatmustbesolvedtobesuitableforclinicaltreatmentandforindustrialproblemsthatmustbesolvedtobesuitableforclinicaltreatmentandforindustrialproductionaredifferentbetweenviralandnon-viralvectorsproductionaredifferentbetweenviralandnon-viralvectorswhenignoringtheirlowefficiency,nonvira
67、lvectorsappearslargelysuperiorwhenignoringtheirlowefficiency,nonviralvectorsappearslargelysuperiorMostrelevantissuesinthetwomainvectorologysectors(viralversusnonviral)ViralvectorsViralvectorsPackagingcapacityfrom4to30kbproblemforsomelargegenes(ex.dystrophingeneorCFTRgene)importanttoxicload:ratioinfe
68、ctious/non-infectiousparticlesfrom1/10to1/100strongimmunogenicity:capsidandenvelopeproteins,residualviralgenescontaminants:replication-competentviruses(ex.wildtyperevertantviruses)Viralamount(titre)obtainablewithrecombinants(ex.10exp5=poor,10exp10=excellent)Complexityofproduction(existenceornotofpac
69、kagingcellsystems)Emotionalproblemslinkedtopathogenicityofdonorvectors(ex.lentiviruses)NonviralvectorsNonviralvectorsPackagingcapacitynotanissue,evenverylargeconstructscanbeused(exampleentirelociupto150kb)minortoxicload:smallpercentageofnonrelevantadventitiousmaterialsmoderateimmunogenicity:methylat
70、ionstatusofDNA(exampleCpGmotifs)contaminants:adventitiouspathogensfrompoorDNApurification(exendotoxins)AmountofDNAmoleculesisusuallynotaproblem,theothercomponentsdependsonchemicalsynthesisNoparticularcomplexity,exceptforspeciallyformulatedliposomesnoparticularemotionalproblemslinkedtothenatureofther
71、eagents基因转移与基因治疗a a aaa aNotallgenetherapyapproachesarerandomshootingNotallgenetherapyapproachesarerandomshootingNotallgenetherapyapproachesarerandomshootingNotallgenetherapyapproachesarerandomshooting基因转移与基因治疗a a aaa aWhichvectorforwhichdiseasecategory？基因转移与基因治疗基因治疗载体的发展趋势基因治疗载体的发展趋势综合病毒载体与非病毒载体的优势
72、综合病毒载体与非病毒载体的优势,构建构建杂种病毒载体杂种病毒载体其需要达到的境界：其需要达到的境界：靶向性进入特异细胞靶向性进入特异细胞表达持久、可控、安全、高效表达持久、可控、安全、高效商业化定做（商业化定做（tailormade)依据特异的治疗依据特异的治疗依据不同个体依据不同个体基因转移与基因治疗五、基因治疗的靶细胞五、基因治疗的靶细胞体细胞：体细胞：造血干细胞，皮肤成纤维细胞，造血干细胞，皮肤成纤维细胞，肝细胞，血管内皮细胞，淋巴细胞，肌肉肝细胞，血管内皮细胞，淋巴细胞，肌肉细胞，肿瘤细胞细胞，肿瘤细胞生殖细胞生殖细胞 在实际应用中需根据具体目的和条件进在实际应用中需根据具体目的和条件
73、进行选择，但一般行选择，但一般最好为组织特异性细胞；最好为组织特异性细胞；较易获得、生命周期较长；在离体情况下较易获得、生命周期较长；在离体情况下较易被外源基因转化，离体细胞经转染和较易被外源基因转化，离体细胞经转染和培养后再植回体内，仍较易成活培养后再植回体内，仍较易成活基因转移与基因治疗 Target cells for gene transfer in ongoing clinical studies Disease target cells Cancer tumor cells, antigen-presenting cells,Cancer tumor cells, antigen-
74、presenting cells, blood progenitor cellsblood progenitor cells T cells, fibroblasts, muscle cellsT cells, fibroblasts, muscle cellsInherited monogenic Inherited monogenic Lung epithelial cells, macrophages, skinLung epithelial cells, macrophages, skindisorders disorders fibroblast, T cells, blood pr
75、ogenitor cells,fibroblast, T cells, blood progenitor cells, antigen-presenting cells, muscle cellsantigen-presenting cells, muscle cellsInfectious diseases Infectious diseases T cells, blood progenitor cells, antigen- T cells, blood progenitor cells, antigen- presenting cells, muscle cells presentin
76、g cells, muscle cellsCardiovascular diseases Cardiovascular diseases endothelial cells, muscle cellsendothelial cells, muscle cellsRheumatoid arthritis Rheumatoid arthritis sinovial lining cellssinovial lining cellsCubital tunnel syndrome Cubital tunnel syndrome Nerve cellsNerve cells基因转移与基因治疗ApplicationHaematopoieticstemcellseasiestMuscle,Liver-goodtargetsEyeretinaaccessiblebutfragileBrain(neurons)v.difficultTumoursaccesstointeriormaybedifficult基因转移与基因治疗基因转移与基因治疗
