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1、1 小组成员：周杰小组成员：周杰 张芬张芬 周伊玲周伊玲 陈艳梅陈艳梅第七节 葡萄糖异构酶2影响 酶活的因素酶活的测定酶的固定化提取分离、纯化国内外的研究情况产生菌株及其分布该酶的特性概念和用途参考文献参考文献葡萄糖异构酶本本节节课课的的框框架架3一、葡萄糖异构酶的概念一、葡萄糖异构酶的概念：也称也称木糖异构酶木糖异构酶，或或简称异构酶它可以催化简称异构酶它可以催化 D D木糖，木糖，DD葡萄糖，葡萄糖，即将即将DD核糖等核糖等醛糖转化为相应的酮糖醛糖转化为相应的酮糖。由于葡。由于葡萄糖异构化对果糖具有重要的经济意义，因此萄糖异构化对果糖具有重要的经济意义，因此工业上习惯将工业上习惯将DD木糖
2、异构酶称为葡萄糖异构酶。木糖异构酶称为葡萄糖异构酶。二、葡萄糖异构酶的用途：二、葡萄糖异构酶的用途：异构酶的主要用途就异构酶的主要用途就是将葡萄糖异构化成是将葡萄糖异构化成高果糖浆高果糖浆。4 葡萄糖异构酶的优点：味道纯葡萄糖异构酶的优点：味道纯正，具有较强的正，具有较强的保温性保温性，着色性和防着色性和防腐性腐性；营养价值较高，可不经消化直；营养价值较高，可不经消化直接被肠胃吸收，果糖的代谢接被肠胃吸收，果糖的代谢不受胰岛不受胰岛素调节素调节，糖尿病人可以利用。系饮料，糖尿病人可以利用。系饮料，糕点等食品工业的理想用糖。在蜂蜜糕点等食品工业的理想用糖。在蜂蜜中含量最为丰富，它的甜度约为蔗糖中
3、含量最为丰富，它的甜度约为蔗糖的的1 12-12-18 8倍。目前在全世界范围内，倍。目前在全世界范围内，各国都大力发展果葡糖浆和结晶果糖各国都大力发展果葡糖浆和结晶果糖的生产。的生产。 5 淀粉淀粉的浆液经过的浆液经过-淀粉酶的催化作用，淀粉酶的催化作用，可以形成可以形成糊精糊精；糊精经过糖化酶的催化作；糊精经过糖化酶的催化作用形成用形成葡萄糖葡萄糖；葡萄糖在葡萄糖异构酶的；葡萄糖在葡萄糖异构酶的催化作用下，分子的结构发生变化，这叫做催化作用下，分子的结构发生变化，这叫做葡萄糖的葡萄糖的异构化异构化。葡萄糖经过异构化，就。葡萄糖经过异构化，就形成了果糖。如果把果葡糖浆中的果糖和葡形成了果糖。
4、如果把果葡糖浆中的果糖和葡萄糖分离开来，将分离出来的葡萄糖再次进萄糖分离开来，将分离出来的葡萄糖再次进行异构化，并且如此反复多次，最后的混合行异构化，并且如此反复多次，最后的混合物中果糖的含量可以达到物中果糖的含量可以达到70%70%90%90%，这样的，这样的混合物就叫做高果糖浆。混合物就叫做高果糖浆。 果葡糖浆生产过程果葡糖浆生产过程回吧回吧6二、酶的特性、酶的特性葡萄糖异构酶的生物学性质葡萄糖异构酶的生物学性质 葡萄糖异构酶能催化葡萄糖异构酶能催化D2葡萄糖至葡萄糖至D2果糖的异构化反应果糖的异构化反应,它是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶它是工业上大规模从淀粉制备高果糖浆的关键酶
5、,且该酶且该酶可将木聚糖异构化为木酮糖可将木聚糖异构化为木酮糖,再经微生物发酵生产乙醇再经微生物发酵生产乙醇.A、热稳定性、热稳定性 B、底物专一性、底物专一性 C、 金属离子的影响金属离子的影响 D、最适、最适pH和温度和温度 亲爱的亲爱的想我了想我了吗？嘿嘿吗？嘿嘿7四、国内外的研究情况四、国内外的研究情况 目前国内许多科研机构和企业正在进行葡萄糖异构酶研究目前国内许多科研机构和企业正在进行葡萄糖异构酶研究和应用。在与基础理论研究中有关的基因改造、酶学性质，以和应用。在与基础理论研究中有关的基因改造、酶学性质，以及在遗传育种过程中突变型筛选，都需要一个准确、快速、具及在遗传育种过程中突变型
6、筛选，都需要一个准确、快速、具有较高重复性的测定葡萄糖异构酶活的方法。有较高重复性的测定葡萄糖异构酶活的方法。让俺好好看看让俺好好看看8 中国科学技术大学生命科学学院独家承担国家科委中国科学技术大学生命科学学院独家承担国家科委863”863”项目项目“葡萄糖异构酶的蛋白质工程葡萄糖异构酶的蛋白质工程”，经十五年科技，经十五年科技攻关目前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造，获得性攻关目前已完成葡萄糖异构酶的蛋白质工程改造，获得性质改良的质改良的基因重组葡萄糖异构酶基因重组葡萄糖异构酶；并利用基因工程方法构并利用基因工程方法构建建表达量表达量极高的基因重组链霉菌工业生产菌株。目前已拥极高的基因重组
7、链霉菌工业生产菌株。目前已拥有两项国家专利，同时正在申报有两项国家专利，同时正在申报“表达突变体酶表达突变体酶GIG138PGIG138P的的7 7号淀粉酶链霉菌基因工程菌株号淀粉酶链霉菌基因工程菌株SM33XZSM33XZ及其构建方法及其构建方法”的美的美国专利。已具备将基因重组葡萄糖异构酶产业化的成熟的国专利。已具备将基因重组葡萄糖异构酶产业化的成熟的科技条件。项目旨在建立完整的葡萄糖异构酶蛋白质工程科技条件。项目旨在建立完整的葡萄糖异构酶蛋白质工程研究系统，研究系统，利用蛋白质工程技术对葡萄糖异构酶的某些性利用蛋白质工程技术对葡萄糖异构酶的某些性质缺陷进行改造，质缺陷进行改造，如提高酶热
8、稳定性等，使其更好地应用如提高酶热稳定性等，使其更好地应用于工业生产。项目涉及菌种筛选，基因克隆，基因表达，于工业生产。项目涉及菌种筛选，基因克隆，基因表达，基因突变，酶动力学，分子设计，工程菌构建以及酶的固基因突变，酶动力学，分子设计，工程菌构建以及酶的固定化研究等诸多方面。定化研究等诸多方面。9我国对a淀粉酶、葡萄糖淀汾酶和葡萄糖异构酶的研究取得了可喜的成就。但由于一些因素的影响，我国果葡糖浆的工业尚未形成一定规模，其主要问题是：1、 果葡糖生产技术，尤其是酶制剂未完全过。2、 原料价格过高影响生产成本。3、 果葡糖浆价格高。 在果葡糖生产的系列酶中，葡萄糖异构酶是关键，这不仅是因为葡萄糖
9、异构酶的价格比淀粉贵几十倍，更重要的在于异构酶的性质和反应条件和淀粉酶不相适应，在调节PH和支队Ca+等离子过程中增加了工艺流程，从而提高了成本，影响酶的活力和产品的质量。为此，葡萄糖异构酶的蛋白质过程势在必行。 而我们将葡萄糖异构酶经过改造后，在工艺上可望省略一次离子交换柱处理，酸咸调节等步骤，并可能在较高温度下（80）进行转化反应，从而大大加速反应速度，使重组葡萄糖异构酶生产的果糖浆产量高，质量好，味道鲜美。我国的果葡糖工业生产现状回了回了10五、酶的筛选五、酶的筛选 酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶处理细胞
10、破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。解到提取液中的过程。酶的提取方法酶的提取方法有有盐溶盐溶液提取法液提取法、碱溶液提取法碱溶液提取法和和有机溶剂提取法有机溶剂提取法等。为了提高酶的提取率和防止酶提取后变等。为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性失活，提取过程中性失活，提取过程中必须注意保持适宜的温必须注意保持适宜的温度和度和pHpH，并且添加适量的保护剂。提取液中，并且添加适量的保护剂。提取液中含有多种酶，要想从提取液中分离纯化出某含有多种酶，要想从提取液中分离纯化出某一种酶，必须根据这种酶的特性，选择适合一种酶，必须根据这种酶的特性，选择适合的分离纯化方法。的分离纯化方法。11
11、 葡萄糖异构酶主要是胞内酶，可以直接用其菌体，进行反应。提取胞葡萄糖异构酶主要是胞内酶，可以直接用其菌体，进行反应。提取胞 内酶，首先要破碎细胞内酶，首先要破碎细胞 破壁、膜然后将含有酶活性的部分用过滤破壁、膜然后将含有酶活性的部分用过滤 或离心法去除残留细胞和细胞碎片，从而得到澄清溶液。再采用逐步或离心法去除残留细胞和细胞碎片，从而得到澄清溶液。再采用逐步 逐级分离和浓缩等步骤将所得的无细胞提取液纯化。常用破碎处理方法：逐级分离和浓缩等步骤将所得的无细胞提取液纯化。常用破碎处理方法： 机械破碎法：指利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎开来机械破碎法：指利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎
12、开来。 物理破碎法：指利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎开来。物理破碎法：指利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎开来。 化学破碎法：指利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜，化学破碎法：指利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜， 使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变。使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变。 酶学破碎法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将酶学破碎法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将原生质体破碎开来。原生质体破碎开来。酶的提取酶的提取12 葡萄糖异构酶的分离纯化葡萄糖异构酶的分离纯化分子筛分子筛 DEAEFF（离子交换
13、层析离子交换层析的一种，的一种， 离子交换树脂为纤维素类）离子交换树脂为纤维素类） 透析透析13 IEXC可在中性条件下，利用多肽的可在中性条件下，利用多肽的带电性不带电性不同分离纯化同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。 在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的
14、多性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报道利用离子等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。有价值的数据供今后此类物质分离研究。 离子交换层析离子交换层析14透析透析在纯化中极为常用，透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中，可除
15、去除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色。 不同种类的蛋白质在不同种类的蛋白质在分子大小分子大小方面有一定方面有一定的差别，用一些简便的方法，使蛋白质混合的差别，用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。物得到初步分离。BACK15 提取和分离纯化后的酶制成酶制剂（如将某种酶的酶液提取和分离纯化后的酶制成酶制剂（如将某种酶的酶液进行干燥处理后，加入适量的稳定剂和填充剂），就可以用进行干燥处理后，加入适量的稳定剂和填充剂），就可以用来催化化学反应了。来催化化学反应了。 但是，这样的催化反应结束后，酶制剂和产物是混合在但是，这样的催化反应
16、结束后，酶制剂和产物是混合在一起的，产物的纯度不高，并且酶制剂不能重复使用。为此，一起的，产物的纯度不高，并且酶制剂不能重复使用。为此，科学家设想将分离纯化后的固定到一定的载体上，使用时将科学家设想将分离纯化后的固定到一定的载体上，使用时将被固定的酶投放到反应溶液中，催化反应结束后又能将被固被固定的酶投放到反应溶液中，催化反应结束后又能将被固定的酶回收，这样的酶叫做定的酶回收，这样的酶叫做固定化酶固定化酶。例如，将葡萄糖异构。例如，将葡萄糖异构酶吸附到离子交换树脂上，或者包埋在明胶，制成的固定化酶吸附到离子交换树脂上，或者包埋在明胶，制成的固定化葡萄糖异构酶，不仅可以用于使葡萄糖转化成甜度更高
17、的高葡萄糖异构酶，不仅可以用于使葡萄糖转化成甜度更高的高果糖浆、而且可以在生产中果糖浆、而且可以在生产中反复使用反复使用。目前，科学家已经研。目前，科学家已经研制出膜状、颗粒状等多种形态的固定化酶。制出膜状、颗粒状等多种形态的固定化酶。六、酶的固定化16酶的固定化方法归纳起来有三种：酶的固定化方法归纳起来有三种：载体结合法、交联法和包埋法。载体结合法、交联法和包埋法。看懂了吗？17载体结合法载体结合法： 指将酶固定到非水溶性载体上的方法。指将酶固定到非水溶性载体上的方法。根据根据固定方式的不固定方式的不同，这种方法可以分为物理吸附法、分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。离子结合法和共价结合
18、法。物理吸附法物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。离子结合法离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载体有离子交换树脂等。共价结合法共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。18交联法交联法： 指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用的交联剂结构的方法。交联法使用的交联剂 是戊二是戊二醛等水溶性化合物。醛等水溶性化合物。 包埋法：包埋法：指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹指将酶包裹在多孔的载体中，如
19、将酶包裹在在聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包等高分子凝胶中，或包裹在裹在硝酸纤维素硝酸纤维素等半透性高分子膜中。前等半透性高分子膜中。前者包埋成者包埋成格子型格子型，后者包埋成后者包埋成微胶囊型微胶囊型。19 现在国内普遍采用的是钼铵酸显色和半现在国内普遍采用的是钼铵酸显色和半胱氨酸胱氨酸-咔唑法，这些方法的优点是灵敏咔唑法，这些方法的优点是灵敏度高。现象直接，用肉眼可以粗略辨别酶活度高。现象直接，用肉眼可以粗略辨别酶活大小，但所用试剂多，易受环境温度的影响，大小，但所用试剂多，易受环境温度的影响，特别是后者需在浓硫酸存在下显色，对实验特别是后者需在浓硫酸存在下显色，对实验者和
20、一起易造成损伤。因此，有必要建立新者和一起易造成损伤。因此，有必要建立新的简便快速的检测酶活的手段。的简便快速的检测酶活的手段。七、酶活力的测定方法七、酶活力的测定方法20比色法测酶活21参考文献参考文献朱国萍朱国萍 徐冲徐冲 生物化学与生物物理进展生物化学与生物物理进展-2000-2000年年2 2期期 葡萄糖异构酶的生物工程研究进展葡萄糖异构酶的生物工程研究进展 佟毅佟毅 史立新史立新 吉林大学自然科学学报吉林大学自然科学学报-2000-2000年年2 2期期 葡萄糖异构酶的双层固定化及其在高果糖浆工业化生产中？葡萄糖异构酶的双层固定化及其在高果糖浆工业化生产中？ 黄婉冶王淳黄婉冶王淳 等等 中国科学技术大学学报中国科学技术大学学报 1992年年链霉菌链霉菌1033葡萄糖异构酶的分离、纯化及性质研究葡萄糖异构酶的分离、纯化及性质研究 2222谢 谢 观 看 ！2323
