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1、第第3章章 酶催化反响催化反响动力学力学2学学时主要内容：主要内容： 3.1 酶催化反响速度酶催化反响速度 3.2 底物浓度对酶促反响速度的影响底物浓度对酶促反响速度的影响 3.3 抑制剂对酶促反响速度的影响抑制剂对酶促反响速度的影响 3.4 其它要素对酶促反响速度的影响其它要素对酶促反响速度的影响酶催化反响动力学也称酶促反响动力学kinetics of enzyme-catalyzed reactions，是研讨酶促反响速度以及影响此速度的各种要素的科学。在研讨酶的构造与功能的关系以及酶的作用机制时，需求酶促反响动力学提供相关的实验证据；为了找到最有利的反响条件从而提高酶催化反响的效率以及了
2、解酶在代谢过程中的作用和某些药物的作用机制等，也需求我们掌握酶促反响动力学的相关规律。因此，对于酶促反响动力学的研讨既有重要的实际意义又具有相当的实际价值。酶促反响动力学以化学动力学为根底，经过对酶促反响速度的测定来讨论诸如底物浓度、抑制剂、温度、pH和激活剂等要素对酶促反响速度的影响。酶的动力学研讨包括哪些内容 ?重重 要要温度、pH及激活剂都会对酶促反响速度产生非常重要的影响，酶促反响不但需求最适温度和最适pH，还要选择适宜的激活剂。而且在研讨酶促反响速度以及测定酶的活力时，都应选择相关酶的最适反响条件。3.1酶催化反响速度假设我们以产物生成量(或底物减少量)来对反响时间作图，便可以得到如
3、图3-1所示的曲线图。图3-1 酶促反响的速度曲线该曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化，因此曲线上任何一点的斜率就是相应横坐标上时间点的反响速度。从图中的曲线可以看出在反响开场的一段时间内斜率几乎不变，然而随着反响时间的延伸，曲线逐渐变平坦，相应的斜率也渐渐减小，反响速度逐渐降低，显然这时测得的反响速度不能代表真实的酶活力。引起酶促反响速度随反响时间延伸而降低的缘由很多，如底物浓度的降低、产物浓度添加从而加速了逆反响的进展、产物对酶的抑制或激活作用以及随着反响时间的延伸引起酶本身部分分子失活等等。因此在测定酶活力时，应测定酶促反响的初速度，从而防止上述各种复杂要素对反响速度的影响。由于反
4、响初速度与酶量呈线性关系，因此可以用测定反响初速度的方法来测定相关制剂中酶的含量。酶活力测定时需留意：1 选择反响的最适温度，根据不同的底物和缓冲液选择反响的最适pH。2 速度要快，取反响的初速度3 底物浓度要足够大普通在10Km以上使酶被底物饱和，以充分反响待测酶的活力测定酶活力的根本原理酶蛋白的含量很低，很难直接测定其蛋白质的含量，且常与其他各种蛋白质混合存在，将其提纯耗时费力。故不能直接用分量或体积等目的来衡量。测定产物添加量测定底物减少量测定酶活力常用的方法：分光光度法spectrophotometry荧光法fluorometry同位素法isotope method电化学方法elect
5、rochemical method其他方法：如旋光法、量气法、量热法和层析法等3.2 底物浓度对酶促反响速度的影响底物浓度对酶促反响速度的影响中间络合物学说中间络合物学说中中间间络络合合物物学学说说也也称称酶酶底底物物中中间间络络合合物物学学说说，最最早早是是由由Henri和和Wurtz两两位位科科学学家家提提出出的的。在在1903年年，Henri在在用用蔗蔗糖糖酶酶水水解解蔗蔗糖糖实实验验研研讨讨化化学学反反响响中中底底物物浓浓度度与与反反响响速速度度的的关关系系时时发发现现，当当酶酶浓浓度度不不变变时时，可可以以测测出出一一系系列列不不同同底底物物浓浓度度下下的的化化学学反反响响速速度度，
6、以以该该反反响响速速度度对对底底物浓度作图，可得到如图物浓度作图，可得到如图3-2所示的曲线。所示的曲线。 图3-2 底物浓度对酶促反响速度的影响从该曲线图可以看出，当底物浓度较低时，反响速度与底物浓度的关系呈正比关系，反响表现为一级反响。然而随着底物浓度的不断添加，反响速度不再按正比升高，此时反响表现为混合级反响。当底物浓度到达相当高时，底物浓度对反响速度影响逐渐变小，最后反响速度几乎与底物浓度无关，这时反响到达最大反响速度Vmax，反响表现为零级反响。根据这一实验结果，Henri和Wurtz提出了酶促化学反响的酶底物中间络合物学说。该学说以为：当酶催化某一化学反响时，酶(E)首先需求和底物
7、(S)结合生成酶底物中间络合物即中间复合物(ES)，然后再生成产物(P)，同时释放出酶。该学说可以用下面的化学反响方程式来表示： S + E ES P + E我们根据中间络合物学说很容易解释图3-2所示的实验曲线，在酶浓度恒定这一前提条件下，当底物浓度很小时酶还未被底物所饱和，这时反响速度取决于底物浓度并与之成正比。随着底物浓度不断增大，根据质量作用定律，中间复合物ES生成也不断增多，而反响速度取决于ES的浓度，故反响速度也随之增高但此时二者不再成正比关系。当底物浓度到达相当高的程度时，溶液中的酶曾经全部被底物所饱和，此时溶液中再也没有多余的酶，虽添加底物浓度也不会有更多的中间复合物ES生成，
8、因此酶促反响速度变得与底物浓度无关，而且反响到达最大反响速度Vmax。当我们以底物浓度S对反响速度v作图时，就构成一条双曲线。在此需求特别指出的是，只需酶促催化反响才会有这种饱和景象，而与此相反，非催化反响那么不会出现这种饱和景象。酶促反响的动力学方程式米氏方程 1913年Michaelis和Menten两位科学家在前人任务的根底上，根据酶促反响的中间络合物学说，推导出一个数学方程式，用来表示底物浓度与酶反响速度之间的量化关系，通常把这个数学方程式称为米氏方程：其中Km称为米氏常数 米氏常数的含义Km值就代表着反响速度到达最大反响速度一半时的底物浓度。 米氏常数的运用价值Km是酶的一个特征性常
9、数：也就是说Km的大小只与酶本身的性质有关，而与酶浓度无关。 Km值还可以用于判别酶的专注性和天然底物，Km值最小的底物往往被称为该酶的最适底物或天然底物。Km可以作为酶和底物结合严密程度的个度量目的，用来表示酶与底物结合的亲和力大小。知某个酶的Km值，就可以计算出在某一底物浓度条件下，其反响速度相当于Vmax的百分比。 Km值还可以协助我们推断详细条件下某一代谢反响的方向和途径，只需Km值小的酶促反响才会在竞争中占优势。 3.3抑制剂对酶促反响速度的影响抑制剂对酶促反响速度的影响由于酶的本质是蛋白质，凡可使酶蛋白变性而引起 酶 活 力 丧 失 的 作 用 都 称 为 失 活 作 用(inac
10、tivation)。假设由于酶必需基团的化学性质发生改动，但酶并未发生变性，而引起酶活力降 低 或 丧 失 的 作 用 那 么 称 为 抑 制 造 用(inhibition)。导致酶发生抑制造用的物质称为抑制剂(inhibitor)。由于抑制造用与变性作用从本质而言是不同的，因此与变性剂对酶的变性作用无选择性不同的是，抑制剂对酶的抑制造用是有选择性的，即一种抑制剂只能使某一种酶或对某一类酶产生抑制造用。对酶抑制造用的讨论是研讨酶的构造与功能、酶的催化机制以及阐明机体代谢途径的根本手段，也可以为医药产业中设计新药物和农业消费中设计新农药提供重要的实际根据，从这个角度而言，对酶抑制造用的研讨不仅具
11、有重要的实际意义，而且具有突出的实际价值。3.3.1抑制造用的类型抑制造用的类型根据抑制剂与酶的作用方式的区别以及抑制造用能否可逆，我们可以将抑制造用分为两大类，即：不可逆的抑制造用可逆的抑制造用。3.3.1.1 不可逆的抑制造用不可逆的抑制造用由于抑制剂与酶的必需基团以共价键的方式结合而引起酶活力降低或丧失，因此不能用透析、超滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活，这种抑制造用是不可逆的，我们称之为不可逆抑制。此时被抑制的酶分子遭到抑制剂对其不同程度的化学修饰，因此不可逆抑制从本质上来说就是酶的修饰抑制。不可逆抑制剂 通常把不可逆抑制剂分为两种类型，即非专注性不可逆抑制剂和专注性不可逆抑制剂。非专
12、注性不可逆抑制剂 主要包括以下六大类：a) 有机磷化合物b) 有机汞、有机砷化合物：抑制含巯基的酶。c) 重金属盐：能使酶蛋白变性而失活。d) 烷化剂：与酶必需基团中的巯基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等结合，从而抑制酶活性。e) 硫化物、氰化物和CO：这类物质能经过与酶中金属离子构成较为稳定络合物的方式，来抑制酶的活性。f) 青霉素Penicillin：青霉素可经过与糖肽转肽酶活性部位丝氨酸羟基共价结合的方式，使糖肽转肽酶失活，导致细菌细胞壁合成受阻，从而损害细菌生长。专注性不可逆抑制剂 可以分为Ks型和Kat型两大类。a)Ks型不可逆抑制剂：具有与底物相类似的构造b)Kat型不可逆抑制剂：该
13、类抑制剂不但具有与天然底物相类似的构造，而且抑制剂本身也是酶的底物，这类不可逆抑制剂的特点是专注性极高，因此也被称为自杀性底物suicide substrate。3.3.1.2 可逆的抑制造用可逆的抑制造用由于抑制剂与酶以非共价键的方式结合而引起酶活力降低或丧失，但是能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，这种抑制造用是可逆的，我们称之为可逆抑制(reversible inhibition)。根据可逆抑制剂与底物的关系，我们将可逆抑制造用分为三种类型，它们分别是竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。竞争性抑制争性抑制(competitive inhibition) ：是是最最常常见的的
14、一一种种可可逆逆抑抑制制造造用用。抑抑制制剂(I)与与底底物物(S)竞争争酶(E)的的同同一一结合合部部位位，因因此此抑抑制制剂的的存存在在直直接接影影响响底底物物与与酶的的正正常常结合合。这是是由由于于酶的的活活性性部部位位不不能能同同时既既与与底底物物结合合又又与与抑抑制制剂结合合，所所以以在在底底物物和和抑抑制制剂之之间会会产生生竞争，从而构成一定的平衡关系。争，从而构成一定的平衡关系。对于绝大多数竞争性抑制剂而言，其构造与底物构造非常类似，因此也能与酶的活性部位结合构成可逆的酶-抑制剂复合物EI，但酶-抑制剂复合物EI不能分解成产物P，导致相应的酶促反响速度下降。其抑制程度取决于底物和
15、抑制剂的相对浓度，可以经过添加底物浓度的方法来解除这种抑制造用。这类抑制最典型的例子是丙二酸和戊二酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，但不能催化脱氢反响。非非竞争性抑制争性抑制(noncompetitive inhibition) ：这类抑抑制制造造用用的的特特点点是是底底物物(S)和和抑抑制制剂(I)可可以以同同时与与酶(E)结合合，两两者者之之间不不存存在在竞争争关关系系。但但是是在在酶与与抑抑制制剂结合合后后，还可可以以进一一步步与与底底物物结合合构构成成酶-底底物物-抑抑制制剂复复合合物物ESI；酶与与底底物物结合合后后，也也可可以以进一一步步与与抑抑制制剂结合合构构成成酶-底底物物-抑抑制制剂
16、复复合合物物ESI。但但是是这种种中中间的的三三元元复复合合物物，即即酶-底底物物-抑抑制制剂复复合合物物ESI不不能能进一一步步分分解解产消消费物，因此相物，因此相应的的酶促反响速度下降。促反响速度下降。由于这类抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合，因此其构造与底物构造并无类似之处，而且不能用添加底物浓度的方法来解除这种抑制造用，故称非竞争性抑制。这类抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一种非竞争性抑制剂。还有某些重金属离子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等对酶的抑制造用也属于这一类。反竞争性抑制(uncompetitive inhibition) ：这类抑制造用的特点是只需在酶(E)与
17、底物(S)结合后，才干与抑制剂(I)结合，构成酶-底物-抑制剂复合物ESI，与非竞争性抑制类似，这种中间的三元复合物，即酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产消费物，因此相应的酶促反响速度下降。这种抑制造用在单底物反响中比较少见，而常见于多底物反响中。目前曾经证明，肼类化合物对胃蛋白酶的抑制造用、氰化物对芳香硫酸酯酶的抑制造用、L-Phe和L-同型精氨酸等多种氨基酸对碱性磷酸酶的抑制造用都属于反竞争性抑制。图3-3酶与底物或抑制剂结合的中间物3.3.2可逆抑制造用和不可逆抑制造用的鉴别可逆抑制造用和不可逆抑制造用的鉴别鉴别可逆抑制造用和不可逆抑制造用，除了用透析、超滤和凝胶过滤等物理方法
18、能否除去抑制剂来判别外，还可采用化学动力学的方法来区分。图3-4 可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别一曲线1，无抑制剂；曲线2，不可逆抑制剂；曲线3，可逆抑制剂在测定酶活力的系统中参与一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度条件下的酶促反响初速度，以酶促反响初速度对酶浓度作图。在测定酶活力的系统中不加抑制剂时，以酶促反响初速度对酶浓度作图得到如图3-4曲线1所示的一条经过原点的直线；当测定酶活力的系统中参与一定量的不可逆抑制剂时，由于抑制剂会使一定量的酶失活，因此只需参与的酶量大于不可逆抑制剂的量时，才表现出酶活力。以酶促反响初速度对酶浓度作图得到如图3-4曲线2所示的一条与曲线1平行的相交于横坐标正侧
19、的直线，所以不可逆抑制剂的作用相当于把原点向右挪动；当测定酶活力的系统中参与一定量的可逆抑制剂时，由于抑制剂的量是恒定的，因此以酶促反响初速度对酶浓度作图得到如图3-4曲线3所示的一条经过原点，但斜率较低于曲线1的直线。3.3.3可逆抑制造用动力学可逆抑制造用动力学对于可逆抑制剂与酶结合后产生的抑制造用，可以根据米氏学说根本原理加以推导，来定量阐明可逆抑制剂对酶促反响速度的影响，下面着重讨论三种类型可逆抑制造用的化学动力学。3.3.3.1 竞争性抑制竞争性抑制在竞争性抑制中，底物(S)或抑制剂(I)与酶(E)的结合都是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：在参与竞争性抑制剂后，Vmax不变，Km
20、变大，KmKm，而且Km随抑制剂浓度I的添加而添加。抑制分数与抑制剂浓度I成正比，而与成反响物浓度S反比。双倒数作图所得直线相交于纵轴，这就是竞争性抑制造用的特点。图3-5 竞争性抑制曲线3.3.3.2 非竞争性抑制非竞争性抑制在非竞争性抑制中，抑制剂(I)与酶(E)或酶-底物复合物(ES)以及底物(S)与酶-抑制剂复合物(EI)的结合都是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：在参与非竞争性抑制剂后，Km值不变，Vmax变小，而且Km= Km，Vmax随I的添加而减小。抑制分数与抑制剂浓度I成正比，而与底物浓度S无关，即I不变时，任何S的抑制分数是一个常数。双倒数作图所得直线相交于横轴，这是非竞
21、争性抑制造用的特点。图3-6 非竞争性抑制曲线3.3.3.3 反竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制的特点是，酶(E)必需先与底物(S)结合，然后才与抑制剂(I)结合，即抑制剂(I)与酶-底物复合物(ES)的结合是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：在参与反竞争性抑制剂后，Km及Vmax都变小，而且KmKm，VmaxVmax，即表观Km及表观Vmax，都随I的添加而减小。抑制分数既与抑制剂浓度I成正比，也与底物浓度S成正比。双倒数作图为一组平行线，这是反竞争性抑制造用的特点。图3-7 反竞争性抑制曲线为了方便了解和记忆，我们现将无抑制剂和有抑制剂等不同情况下的米氏方程和Vmax及Km的变化总结归
22、纳在表3-1中。为了便于比较三种抑制类型的区别，我们可以用Dixon作图法求Ki，只需以抑制剂浓度I为横坐标，以酶促反响速度的倒数1/v为纵坐标，采用一个以上的底物浓度S，然后给出不同S时的直线，再由这些直线的交点即可以得到Ki，如图3-8所示。 图3-8 Dixon作图法求KiS2S1A. 非竞争性抑制 B. 竞争性抑制 C. 反竞争性抑制3.4 其它要素对酶促反响速度的影响其它要素对酶促反响速度的影响其它各种影响酶促反响速度的要素主要包括温度、pH和激活剂等。3.4.1温度对酶促反响速度的影响温度对酶促反响速度的影响和绝大多数化学反响一样，酶促化学反响速度也和温度亲密相关。温度对酶促化学反
23、响速度的影响主要表如今两个方面，其一是当温度升高时，与普通化学反响一样，反响速度加快，这种影响可以用反响的温度系数来衡量。所谓反响的温度系数是指反响温度提高10 ，其反响速度与原来反响速度之比，通常用Q10来表示。对大多数酶而言，酶促化学反响的温度系数Q10多为2，即温度每升高10，酶促化学反响速度为原反响速度的2倍。其二是由于酶的本质是蛋白质，因此随着温度逐渐升高，酶蛋白会因逐渐变性而失活从而导致酶促化学反响速度下降。在不同温度条件下进展某种酶促化学反响，然后将所测得的酶促反响速度相对于温度来作图，即可得到如图3-9所示的钟罩形曲线。从该曲线我们可以看出，在较低的温度范围内，酶促化学反响速度
24、随温度升高而增大，但在超越一定温度后，酶促化学反响速度不见上升反而下降，因此只需在某一温度条件下，酶促化学反响速度到达最大值，通常把这个温度称为酶促化学反响的最适温度(optimum temperature)。在一定条件下每种酶都有其催化反响的最适温度。酶所表现的最适温度是上述两种影响综协作用的结果。在酶促化学反响的最初阶段，酶蛋白的变性尚未表现出来，第一个方面的影响占主导位置，因此反响速度随温度升高而添加；但当反响温度逐渐高于最适温度时，酶蛋白变性逐渐突出，第二个方面的影响逐渐取代第一个方面的影响从而占主导位置，反响速度随温度升高的效应也将逐渐被酶蛋白变性效应所抵消，反响速度开场迅速下降，因
25、此表现出酶促化学反响的最适温度。普通来说，动物细胞内的酶最适温度普通为3540，植物细胞中的酶最适温度较动物细胞中稍高，通常在4050之间，而微生物中的酶最适温度差别那么较大，如用于进展PCR反响的Taq DNA聚合酶的最适温度可高达70。需求指出的是，最适温度不是酶的特征物理常数，相反它经常遭到其他各种条件如底物种类、作用时间、pH和离子强度等要素影响。如最适温度随酶促反响进展时间的长短而改动，这是由于温度使酶蛋青丝生变性效应是随时间而逐渐累加的。普通而言，酶促反响进展时间长时酶的最适温度低，酶促反响进展时间短那么最适温度高，所以只需在规定的酶促反响时间内才可确定酶的最适温度。图3-9 温度
26、对酶促反响速度的影响 酶在固体形状下比在溶液中对温度的耐受力更高。酶的冰冻干粉制剂通常在冰箱中可存放几个月以上，而酶溶液普通在冰箱中只能保管数周。所以酶制剂以固体保管为佳。4.5.2 pH对酶促反响速度的影响对酶促反响速度的影响除温度影响之外，酶的活力还遭到环境pH的影响。通常在一定pH下，酶会表现出最大活力，而一旦高于或低于此pH，酶活力就会降低，我们把表现出酶最大活力时的pH称为该酶的最适pH，在不同pH条件下进展某种酶促化学反响，然后将所测得的酶促反响速度相对于pH来作图，即可得到如图3-10所示的钟罩形曲线。图3-10 pH对酶活力的影响与酶促化学反响的最适温度不同的是，各种酶在一定条
27、件下都有其特定的最适pH，因此最适pH是酶的特性之一。但是酶的最适pH并不是一个常数，它受诸如底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等众多要素的影响，因此只需在一定条件下最适pH才有意义。绝大多数酶的最适pH在58之间，动物体内的酶最适pH多在6.58.0之间，植物及微生物中的酶酶最适pH多在4.56.5左右。但并不排除例外，如胃蛋白酶的最适pH为1.5，肝中精氨酸酶最适pH为9.7等等。pH影响酶活力的缘由能够包括以下几个方面：(1)过酸或过碱使酶的空间构造遭到破坏，引起酶变性从而导致酶构象的改动、酶活性随之丧失。(2)当pH改动不是非常猛烈时，酶虽未发生变性，但其活力曾经遭到影响。这是由于pH影
28、响了底物的解离形状或酶分子活性部位上有关基团的解离形状或酶-底物复合物的解离形状，而使底物不能与酶结合构成酶-底物复合物，或者构成酶-底物复合物后不能生成产物，使酶活性降低。(3)pH影响了与维持酶分子空间构造有关的基团解离，从而改动酶活性部位的构象，进而降低了酶的活性。4种pH-酶活性曲线3.4.3激活剂对酶促反响速度的影响激活剂对酶促反响速度的影响与抑制剂相对的是，凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂(activator)，而激活剂中大部分是无机离子或简单的有机化合物。作为激活剂的金属离子主要包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+及Fe2+等离子，无机阴离子主要包括Cl-、Br-、I
29、-、CN-、PO4-等。如Mg2+可以作为多种激酶及合成酶的激活剂，Cl-可以作为唾液淀粉酶的激活剂。 激活剂对酶的作器具有一定程度的选择性，即一种激活剂只对某种酶起激活作用，而对另一种酶能够不起任何作用或起抑制造用，如对脱羧酶而言有激活作用的Mg2+对肌球蛋白腺三磷酶却有抑制造用；而对脱羧酶而言有抑制造用的Ca2+对肌球蛋白腺三磷酶却有激活作用。有时各种离子之间有拮抗作用，如被K+激活的酶会受Na+的抑制，被Mg2+激活的酶会受Ca2+的抑制。有时金属离子的作用也可以相互替代，如作为激酶的激活剂的Mg2+可被Mn2+所替代。 除此以外，可因浓度不同，同一种激活剂对于同一种酶会起不同的作用，如
30、对于NADP+合成酶，当Mg2+浓度为(510)10-3molL时起激活作用酶活性上升，但当浓度升高到3010-3molL时酶活性下降；假设用Mn2+替代Mg2+，那么在110 -3 molL起激活作用酶活性上升，高于此浓度时那么起抑制造用酶活性下降。除了上面提到的金属离子之外，有些小分子有机化合物也可作为酶的激活剂。例如对木瓜蛋白酶和甘油醛3-磷酸脱氢酶等含巯基的酶而言半胱氨酸，复原型谷胱甘肽等复原剂对其有激活作用，它们可使酶中二硫键复原成巯基从而提高酶活性。因此在分别纯化木瓜蛋白酶和甘油醛3-磷酸脱氢酶等含巯基的酶过程中，往往需加半胱氨酸，复原型谷胱甘肽等复原剂，以维护巯基不至于在分别纯化过程中被氧化。
