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1、 第四节第四节 种子扩展培育种子扩展培育 一一. 种子扩展培育的义务种子扩展培育的义务 工业消费规模的增大工业消费规模的增大 需求种子就增多需求种子就增多 种子的扩展培育种子的扩展培育 种子扩展培育的义务，不但要得到纯而壮种子扩展培育的义务，不但要得到纯而壮的培育物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、的培育物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足够的、纯的培育物。接种数量足够的、纯的培育物。 菌种的活化与种子的扩展培育的区别？菌种的活化与种子的扩展培育的区别？ 菌种扩展培育的目的 为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。由于发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间那么短。将较多
2、数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的时机。 对于不同产品的发酵过程来说，必需根据菌种生长繁衍速度快慢及消费的规模决议种子扩展培育的级数。 二二. 种子种子扩展培育展培育(制制备)阶段段 实验室种子的制室种子的制备： 消消费车间种子制种子制备: A 实验室种子的制室种子的制备： e.g 产黄青霉菌黄青霉菌(P.chrysogonum) 原始菌种原始菌种 斜面斜面试管管 获得得孢子子 250ml 茄子瓶大米或小米茄子瓶大米或小米 25 28 ，414天天 成熟在真空下抽去水分，使水分含量在成熟在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下以下，于，
3、于4 冰箱保管。冰箱保管。对于不产孢子的赤霉素消费菌Gibberelline fujikuroi，也可用大米固体培育基在茄子瓶中培育菌丝体，用作种子罐种子。 产孢子才干不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌Sgriseus ，产卡那霉素的卡那链霉菌Skanamyceticu，可以用摇瓶液体培育法，孢子接入含液体培育基的摇瓶中，于摇床上培育，获得菌丝体，作为种子。 不产孢子的细菌，如消费谷氨酸的棒状杆菌Corynebacterium、短杆菌Brevibacterium，消费上普通采用斜面营养细胞进展扩培，再转入液体摇瓶培育，获得细胞悬液再接种。 e.g. Glutamic acid-pr
4、oducer：谷氨酸消：谷氨酸消费菌菌原始菌种出原始菌种出发菌种菌种 固体固体试管斜面管斜面32 C ，1824小小时 三角瓶培育三角瓶培育摇床床(flask culture) 种子罐培育种子罐培育 e.g. yeast：原始菌种出原始菌种出发菌种菌种 10ml 麦汁麦汁试管管 250ml 三角瓶培育三角瓶培育 27 C 28 C ，3天天 25C， 2天天 510 L卡氏罐卡氏罐15 C 20 C ，35天天B：消费车间种子制备：消费车间种子制备：种子罐的作用：使有限数量的孢子种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体菌体)发芽、生长、发芽、生长、并繁衍成大量的菌丝体并繁衍成大量的菌丝体(菌体菌体
5、)，满足发酵罐的需求菌体，满足发酵罐的需求菌体生长和产物构成。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法生长和产物构成。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法和摇瓶菌种进罐法。和摇瓶菌种进罐法。种子罐级数确实定：种子罐级数是指制备种子逐级扩种子罐级数确实定：种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。培的次数。 根据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁衍的速度以根据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁衍的速度以及所用的发酵罐的容积。及所用的发酵罐的容积。种子罐种子罐(seeding tank)的级数的级数产物的种类产物的种类消费规模消费规模工艺条件工艺条件种子罐级数越少越好，缘由： 简化消费工艺和控制减少接种带来的染菌时机
6、需思索：尽量延伸发酵罐消费产物的时间，缩短由于种子发芽、消费而占用的非消费时间，以提高发酵罐的消费率产物mlh。 e.g. Glutamate fermentation 一级种子扩培 实验室种子 种子罐 发酵罐 e.g. penicillin fermentation 二级种子扩培 实验室种子 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐 e.g.Streptomycin fermentation 三级种子扩培实验室种子 一级种子罐 二级种子罐 三级种子罐 发酵罐 (Streptomyces griseus)灰色链霉菌 种龄与接种量：种龄(seed age)指种子罐培育种子从开场至终了的培育时间。在种子罐中
7、，培育时间延伸菌体量添加基质耗费及代谢产物积累菌体量不再添加老化过老：消费才干下降，菌体自溶。过嫩：前期生长缓慢，发酵周期延伸，产物构成时间推迟，甚至呵斥异常发酵。 适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期exponential phase，且培育液中菌体量还未到达最顶峰时，较为适宜。 嗜碱性芽孢杆菌Bacillus alkalophilus)消费碱性蛋白酶alkaline proteinase/protease ，培育小时接种，酶活最高。 接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后培育液的体积比。Antibiotic： 7%7.5% Glu： 1%接种量的大小决议于消费
8、菌种在发酵罐中的繁衍速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁衍到达顶峰的时间，使产物构成提早。 缘由：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基 质的利用 、消费菌迅速占据了整个培育环境，减少染菌时机。 但过多，易使菌体菌丝体生长过快，培育液粘度添加，溶氧降低，产物合成受影响。 e.g. 嗜碱性芽孢杆菌消费碱性蛋白酶 接种1%，酶活最高；1.5%4%影响不大；大于4%，酶产量明显下降。 制霉菌素消费中，1%比10%效果好，0.1%与1%效果相当。 发酵消费的趋势：采取大接种量及丰富培育基。 如谷氨酸： 大接种量20% ，高生物素，高青霉素的强迫发酵工艺。 有的采用双种法增大接种量：
9、两只种子罐 一只发酵罐 如卡那霉素：双种比单种的发酵单位fermentation titer unit提高8%，到达产量 高 峰的 时间提早。 倒种法：将培育适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为种子。 如 链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。 三三. 影响种子质量的要素影响种子质量的要素 1. 原资料质量：如四环素、土霉素消费中配制孢子培原资料质量：如四环素、土霉素消费中配制孢子培育基的麸皮育基的麸皮wheat bran、霉菌用的大小米、琼脂、霉菌用的大小米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。原料质量的动摇，起
10、主要作用的是其中的无机盐含量原料质量的动摇，起主要作用的是其中的无机盐含量的不同，如微量元素的不同，如微量元素Mg+、Ca + 、Ba+能刺激孢子的构能刺激孢子的构成。成。P含量的多少也影响种子的质量。含量的多少也影响种子的质量。氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，参与其他的营养氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，参与其他的营养物麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆，也对种子质量物麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆，也对种子质量多少有些影响。多少有些影响。普通情况：培育基糖分要少，氮源要多，无机盐所占普通情况：培育基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培育基成分趋于一致也有益的比例要大。种子
11、罐和发酵罐培育基成分趋于一致也有益处，种子很快顺应，但各成分的数量根据目的各自确定。处，种子很快顺应，但各成分的数量根据目的各自确定。总之，各成分选择得当，才干发扬菌种的特征，提高总之，各成分选择得当，才干发扬菌种的特征，提高产量。产量。2. 培育条件：温度、pH值、湿度、培育时间和冷藏时间等都影响种子质量。制备斜面孢子培育基的湿度对孢子的数量影响很大。如土霉素消费菌种龟裂霉菌的孢子，在北方枯燥地域孢子斜面长的快，在含少量水分的试管斜面培育基中下部孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地域，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子构成。 普通相对湿度4045%时孢子数量最多，孢子颜色
12、均匀，质量较好。培育时间和冷藏时间对种子和孢子构成都有影响。如土霉素菌种孢子斜面培育四天左右，即于4冰箱保管，发现冷藏78天菌体自溶，而培育五天以后冷藏，20天未发现自溶。链霉素消费菌，斜面孢子在6 冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低8%。 四四. 种子种子质量的控制措施量的控制措施 必需保必需保证消消费菌种的菌种的稳定性定性 提供种子培育的适宜提供种子培育的适宜环境条件，保境条件，保证无无杂菌侵入菌侵入 1. 菌种菌种稳定性的定性的检查： 少量菌种少量菌种-无菌生理无菌生理盐水水-递增稀增稀释-平板划平板划线培育。培育。 挑出形状整挑出形状整齐，孢子丰子丰满的菌落的菌落进展展摇瓶瓶实验，
13、测定其消定其消费才干。才干。 2. 无菌无菌检查： 显微微镜察看、种子液察看、种子液进展无菌展无菌检验、生化分、生化分析。析。 种子液平板划种子液平板划线、斜面培育用肉眼察看能否、斜面培育用肉眼察看能否有异常菌落、异常景象及有异常菌落、异常景象及镜检能否有能否有杂菌。菌。五五. 种子种子质量的判量的判别： 调查种子在种子在发酵罐中所表酵罐中所表现出来的消出来的消费才干。才干。感官判感官判别：看：看颜色、色、闻气味气味 理化目的理化目的测定：定： 1、pH值 2、培育基、培育基灭菌后的糖、氨基氮菌后的糖、氨基氮 3、菌体形状、菌体形状、浓度度 4、产物量物量 5、残糖、残糖浓度度 6、酶活力活力
14、 如土霉素消如土霉素消费，淀粉，淀粉酶的活力的活力与与发酵酵单位有一定的关系。位有一定的关系。六六. 工业微生物培育的类型工业微生物培育的类型 静置培育法：即将培育基盛于发酵容器中，在接种后，不通静置培育法：即将培育基盛于发酵容器中，在接种后，不通 空气进展培育发酵，也称为嫌气性培育空气进展培育发酵，也称为嫌气性培育 (anaerobic culturing)通气培育法：消费菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长通气培育法：消费菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长 的环境必需供应空气，以维持一定的溶解氧程度的环境必需供应空气，以维持一定的溶解氧程度 ， 使菌体迅速生长和发酵，也称为好气性使菌
15、体迅速生长和发酵，也称为好气性 培育培育 (aerobic culturing)。 1 外表培育法surface culturing)： 好氧静置培育法。针对容器内培育基物形状又分为液态外表培育和固体外表培育。相对于容器内培育基体积而言，外表积越大，越易促进氧气由气液界面向培育基内传送。 这种方法菌的生长速度与培育基的深度有关，单位体积的外表积越大，生长速度越快。 2 固体培育发酵法固体培育发酵法(solid culturing)： 固体培育又分为浅盘固体培育又分为浅盘(shallow pan)固体培育和深固体培育和深层固体培育，统称曲法培育。它来源于我国酿造消费特层固体培育，统称曲法培育。它
16、来源于我国酿造消费特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。 3 液体深液体深层培育培育发酵法：酵法：(liquid submerged culturing) 液体深液体深层发酵法从罐底部通气，酵法从罐底部通气，进入的空气由入的空气由搅拌拌桨叶叶分散成微小气泡以促分散成微小气泡以促进氧的溶解。氧的溶解。这种由罐的底部通气种由罐的底部通气搅拌拌的培育方法，相的培育方法，相对于由气液界面靠自然分散使氧溶解的外表于由气液界面靠自然分散使氧溶解的外表培育法来培育法来讲，称，称为深深层培育法。培育法。 液体曲液体曲(liquid koji)、柠檬酸
17、、谷氨酸、肌苷酸檬酸、谷氨酸、肌苷酸(inosinic acid)及其他及其他发酵酵产品先后采用此法品先后采用此法进展消展消费。特点：容易按照消特点：容易按照消费菌种菌种对于代于代谢的的营养要求以及不同养要求以及不同生理生理时期的通气、期的通气、搅拌、温度、培育基中拌、温度、培育基中氢离子离子浓度等条件，度等条件，选择最正确培育条件。最正确培育条件。外循环带升式发酵罐 内循环带升式发酵罐 小型机械小型机械搅拌拌发酵罐酵罐11三三角角皮皮带转轴；22轴承承支支架架；33联轴节；44轴封封；55窥镜；66取取样口口；77冷冷却却水水出出口口；88夹套套；99螺螺旋旋片片；1010温温度度计接接口口
18、；1111轴；1212搅拌拌器器；1313底底轴承承；1414放放料料口口；1515冷冷水水进口口；1616通通风管管；1717热电偶偶接接口口；1818挡板板；1919接接压力力表表；2020手手孔孔；2121电动机机；2222排排气气口口；2323取取样口口；2424进料料口口；2525压力力表表接接口口；2626窥镜；2727手手孔孔；2828补料口料口深层培育的几个主要控制点A 灭菌(sterilization)：发酵工业要求纯培育。因此在种子培育前必需对培育基进展加热灭菌。B 温度控制：培育基灭菌后，冷却至培育温度进展培育，由于随着微生物的生长和繁衍，会有热量产生、搅拌产热等，所以为维持温度恒定。 C 通气(aeration)、搅拌(agitation)： 空气进入发酵罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再经过搅拌将空气分散成微小气泡。 搅拌的目的：添加溶解氧；使基质混合均匀；促进热传送 。培育液中的微生物均匀地分散在种子罐内，并使参与的酸和碱均匀分散等。
