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1、第八章第八章电泳技术电泳技术第八章第八章电泳技术电泳技术第一节第一节电泳技术发展简史电泳技术发展简史第二节第二节电泳的基本原理电泳的基本原理第三节第三节影晌电泳分离的主要因素影晌电泳分离的主要因素第四节第四节电泳的分类电泳的分类第五节第五节各种电泳技术介绍各种电泳技术介绍第六节第六节电泳测纯技术电泳测纯技术第一节第一节电泳技术发展简史电泳技术发展简史18091809年，俄国物理学家年，俄国物理学家年，俄国物理学家年，俄国物理学家首次发现电泳现象。首次发现电泳现象。首次发现电泳现象。首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加他在湿粘土中
2、插上带玻璃管的正负两个电极，加他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。象。象。象。19091909年，年，年，年，MichaelisMichaelis首次将胶体离子在电场中的移首次将胶体离子在电场中的移首次将胶体离子在电场中的移首次将胶体离子在电场中的移动称
3、为电泳。他用不同动称为电泳。他用不同动称为电泳。他用不同动称为电泳。他用不同pHpH的溶液在的溶液在的溶液在的溶液在U U形管中测定形管中测定形管中测定形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。19371937年，瑞典年，瑞典年，瑞典年，瑞典UppsalaUppsala大学的大学的大学的大学的TiseliusTiselius对电泳仪器对电泳仪器对电泳仪器对电泳仪器作了改进，创造了作了改进，创造了作了改进，创造了作了改进，创造了TiseliusTiselius电泳仪，建
4、立了研究蛋电泳仪，建立了研究蛋电泳仪，建立了研究蛋电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及由白蛋白及由白蛋白及由白蛋白及 、 、 球蛋白组成的，由于球蛋白组成的，由于球蛋白组成的，由于球蛋白组成的，由于TiseliusTiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了19481948年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。年的
5、诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。19481948年，年，年，年，WielandWieland和和和和FischerFischer重新发展了以滤纸作重新发展了以滤纸作重新发展了以滤纸作重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行了为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行了为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行了为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行了研究。研究。研究。研究。上世纪上世纪50年代起，特别是年代起，特别是1950年，年，Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、开创了利用各种固体物质（如各
6、种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。作为支持介质的区带电泳方法。1959年，年，Raymond和和Weintraub利用人工合利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。辨率，开创了近代电泳的新时代。聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽
7、、核酸等生物大分子使用最普中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即质的最高纯度：即质的最高纯度：即质的最高纯度：即“ “电泳纯电泳纯电泳纯电泳纯” ”（一维电泳一条带（一维电泳一条带（一维电泳一条带（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今或二维电泳一个点）的标准分析鉴定
8、方法，至今或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即后、最准确的手段，即后、最准确的手段，即后、最准确的手段，即“ “LastCheck”LastCheck”。上个世纪上个世纪上个世纪上个世纪8080年代发展起来的毛细管电泳技术，是年代发展起来的毛细管电泳技术，是年代发展起来的毛细管电泳技术，是年代发展起来的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到
9、化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。人们的充分重视。人们的充分重视。人们的充分重视。第二节第二节电泳的基本原理电泳的基本原理电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的它们在某个特定的pHpH值下可以带正电或负值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相
10、反的电极方向移动。着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。离、鉴定或提纯的技术。电泳过程必须在一种支持介质中进行。电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在等在1937年进行的自由界面电泳没年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较有固定支持介质，所以扩散和对
11、流都比较强，影响分离效果。强，影响分离效果。样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。扩散和对流等干扰作用。支持介质：滤纸、醋酸纤维素膜、硅胶薄层支持介质：滤纸、醋酸纤维素膜、硅胶薄层平板、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰平板、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。胺凝胶等。电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式
12、电泳是较为常见的一种，常用于聚垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。稀溶液中，电场对带电分子的作用力稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F）等于分子所带净电荷量（等于分子所带净电荷量（q）与电场强度）与电场强度（E）的乘积。即：）的乘积。即：FqE带电分子移动过程中，会受到介质粘滞力的带电分子移动过程中，会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（阻碍。粘滞力（F）的大小与分子大小、形）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于关，并与带电分子的移动速度
13、成正比，对于球状分子，球状分子，F的大小服从的大小服从Stoke定律，即：定律，即：F=6rr r是球状分子的半径，是球状分子的半径，是球状分子的半径，是球状分子的半径， 是缓冲液粘度（或介质粘滞是缓冲液粘度（或介质粘滞是缓冲液粘度（或介质粘滞是缓冲液粘度（或介质粘滞系数），系数），系数），系数）， 是电泳速度是电泳速度是电泳速度是电泳速度( (单位：单位：单位：单位：cm/s)cm/s)。当带电分子匀速移动时：当带电分子匀速移动时：F=FqE=6r=qE/6r 电泳迁移率（电泳迁移率（m）：单位电场强度下的迁移）：单位电场强度下的迁移速度：速度：m=/E=q/6r电泳迁移率与带电分子所带净电
14、荷成正比，电泳迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。的不同区带而被分开。的不同区带而被分开。的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大即使两个
15、分子具有相似的电荷，如果它们的分子大即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。也不同，在电泳过程中就可以被分离。也不同，在电泳过程中就可以被分离。也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不有些类型的电泳几乎完全依赖于分子
16、所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；同进行分离，如等电聚焦电泳；同进行分离，如等电聚焦电泳；同进行分离，如等电聚焦电泳；有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如过程中产生的阻力不同而得到分离，如过程中产生的阻力不同而得到分离，如过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS-SDS-聚丙烯聚丙烯聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳。酰胺凝胶电泳。酰胺凝胶电泳。酰胺凝胶电泳。第三节第三节影晌电泳分离的主要因素影晌电泳分离的主要因素3.1待分离
17、生物大分子的性质待分离生物大分子的性质3.2缓冲液的性质缓冲液的性质3.3电场强度电场强度3.4电渗电渗3.5支持介质的筛孔支持介质的筛孔3.1待分离生物大分子的性质待分离生物大分子的性质待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。3.2缓冲液的性质缓冲液的性质主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液的品溶液的pH值
18、、离子强度和粘度等。值、离子强度和粘度等。3.2.1pH3.2.1pH值值值值溶液溶液溶液溶液pHpH值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷的量。带净电荷的量。带净电荷的量。带净电荷的量。对两性电解质（如蛋白质）而言，溶液的对两性电解质（如蛋白质）而言，溶液的对两性电解质（如蛋白质）而言，溶液的对两性电解质（如蛋白质）而言，溶液的pHpH值离值离值离值离其等电点越远，带净电荷量就越多，泳动速度就其等电点越远，带净电荷量就越多，泳动速度就其等电点越远，带净电荷量就越多，泳动速度就其等
19、电点越远，带净电荷量就越多，泳动速度就越快。越快。越快。越快。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液pHpH还会影响到其电泳方向，当缓冲液还会影响到其电泳方向，当缓冲液还会影响到其电泳方向，当缓冲液还会影响到其电泳方向，当缓冲液pHpH大大大大于两性电解质的等电点，两性电解质带负电荷，于两性电解质的等电点，两性电解质带负电荷，于两性电解质的等电点，两性电解质带负电荷，于两性电解质的等电点，两性电解质带负电荷，其电泳的方向是指向正极。其电泳的方向是指向正极。其电泳的方向是指向正极。其电泳的方向是指向正极。电泳时应选择适宜的电泳时应选择适宜的电泳时应选择适宜的电泳时应选择适宜的pHpH值，并需采用缓冲溶液，值，
20、并需采用缓冲溶液，值，并需采用缓冲溶液，值，并需采用缓冲溶液，使溶液的使溶液的使溶液的使溶液的pHpH值恒定。值恒定。值恒定。值恒定。 3.2.2离子强度离子强度为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液及缓冲液及缓冲液及缓冲液pHpH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定值的稳定性，缓冲液通常要保持一定值的稳定性，缓冲液通常要保持一定值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在的离子强度，一般在的离子强度，一般在的离子强度，一般在0.020.020.20.2。
21、离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液pHpH值变化而影响泳动的速率。值变化而影响泳动的速率。值变化而影响泳动的速率。值变化而影响泳动的速率。离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离
22、子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。生了静电引力，因而引起电泳速度降低。生了静电引力，因而引起电泳速度降低。生了静电引力，因而引起电泳速度降低。离子强度的计算公式为：离子强度的计算公式为：I1/2mizi2=1/2(m1z12+m2z22+mnzn2)I I：溶液的离子强度；：溶液的离子强度；：溶液的离子强度；：溶液的离子强度； mmi i：离子的摩尔浓度；：离子的摩尔浓度；：离子的摩尔浓度；：离子的摩尔浓度；z zi i：离子
23、的价数；：离子的价数；：离子的价数；：离子的价数；1 1，2 2，nn代表各种离子。代表各种离子。代表各种离子。代表各种离子。3.2.3溶液粘度溶液粘度泳动度与溶液粘度是成反比关系。粘度过大泳动度与溶液粘度是成反比关系。粘度过大或过小，必然影响泳动度。或过小，必然影响泳动度。3.3电场强度电场强度电场强度（电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介
24、质中所做的功（增大。电流在介质中所做的功（W）为：）为：W=I2RtI I为电流强度，为电流强度，为电流强度，为电流强度，R R为电阻，为电阻，为电阻，为电阻，t t为电泳时间。为电泳时间。为电泳时间。为电泳时间。电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：起介质温度升高，这会造成很多影响：样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；分离带的加宽；产生对流，引起待分离物的混合；产生对流，引起待分离物的混合；如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；引起介质粘度降
25、低、电阻下降等等。引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，电泳分离带通常呈弓型。电泳分离带通常呈弓型。电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。不仅降低分辨率，而且在流强度会随着增大。不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂
26、糖凝胶支持物。严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持物。电流强度过低，生热少，电泳时间延长，引电流强度过低，生热少，电泳时间延长，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。离效果。电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。果。3.43.4电渗电渗电渗电渗当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸
27、附溶液中的正子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向
28、的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。电泳电场中，液体也会相对固体支持介质发电泳电场中，液体也会相对固体支持介质发生移动，出现电渗现象。在生移动，出现电渗现象。在pH值高于值高于3时，时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。极的电渗
29、流。当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。3.5支持介质的筛孔支持介质的筛孔支持介质的筛孔大小（如：琼脂和聚丙烯酰支持介质的筛孔大小（如：琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔）对待分离生胺凝胶都有大小不等的筛孔）对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。动速度慢。除上述影响泳动速度的因
30、子外，温度和仪器除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。装置等因子的影响也应考虑。第四节第四节电泳的分类电泳的分类4.1电泳按其分离的原理分类电泳按其分离的原理分类4.2按支持介质的分类按支持介质的分类4.3按支持介质形状分类按支持介质形状分类4.4按用途分类按用途分类4.5按所用电压分类按所用电压分类4.1电泳按其分离的原理分类电泳按其分离的原理分类 区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分在支持区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分在支持区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分在支持区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分在支持介质中被分离成许多条明显的区带，应用最广。介质中被分
31、离成许多条明显的区带，应用最广。介质中被分离成许多条明显的区带，应用最广。介质中被分离成许多条明显的区带，应用最广。 自由界面电泳：自由界面电泳：自由界面电泳：自由界面电泳： 这是瑞典这是瑞典这是瑞典这是瑞典UppsalaUppsala大学的著名科学大学的著名科学大学的著名科学大学的著名科学家家家家TiseliusTiselius最早建立的电泳技术，是在形管中进最早建立的电泳技术，是在形管中进最早建立的电泳技术，是在形管中进最早建立的电泳技术，是在形管中进行电泳，无支持介质，分离效果差，已被取代。行电泳，无支持介质，分离效果差，已被取代。行电泳，无支持介质，分离效果差，已被取代。行电泳，无支持
32、介质，分离效果差，已被取代。 等速电泳：需使用专用电泳仪，电泳平衡后，各等速电泳：需使用专用电泳仪，电泳平衡后，各等速电泳：需使用专用电泳仪，电泳平衡后，各等速电泳：需使用专用电泳仪，电泳平衡后，各电泳区带相随，分成清晰界面，以等速向前运动。电泳区带相随，分成清晰界面，以等速向前运动。电泳区带相随，分成清晰界面，以等速向前运动。电泳区带相随，分成清晰界面，以等速向前运动。 等电聚焦电泳：两性电解质在电场中自动形成等电聚焦电泳：两性电解质在电场中自动形成等电聚焦电泳：两性电解质在电场中自动形成等电聚焦电泳：两性电解质在电场中自动形成pHpH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的梯度，当被分
33、离的生物大分子移动到各自等电点的梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pHpH处聚集成很窄的区带。处聚集成很窄的区带。处聚集成很窄的区带。处聚集成很窄的区带。4.2按支持介质分类按支持介质分类 纸电泳（纸电泳（纸电泳（纸电泳（PaperelectrophorisisPaperelectrophorisis） 醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳（CelluloseAcetateelectrophoresisCelluloseAcetateelectrophoresis） 琼脂凝胶电泳（琼脂凝胶电泳（琼脂凝胶电泳（琼脂
34、凝胶电泳（AgarGelelectrophoresisAgarGelelectrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelPolyacrylamideGelelectrophoresiselectrophoresis，PAGEPAGE）SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）。）。）。）。4.3按支持介质形状分类按支持介质形状分类 薄层电泳薄层电泳薄层电泳薄层电泳 ； 板电泳板电泳板电泳板电泳 ； 柱电泳。柱电泳
35、。柱电泳。柱电泳。4.4按用途分类按用途分类 分析电泳；分析电泳；分析电泳；分析电泳； 制备电泳；制备电泳；制备电泳；制备电泳； 定量免疫电泳；定量免疫电泳；定量免疫电泳；定量免疫电泳； 连续制备电泳。连续制备电泳。连续制备电泳。连续制备电泳。4.5按所用电压分类按所用电压分类 低压电泳：低压电泳：低压电泳：低压电泳：100V100V500V500V，电泳时间较长，适于，电泳时间较长，适于，电泳时间较长，适于，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。分离蛋白质等生物大分子。分离蛋白质等生物大分子。分离蛋白质等生物大分子。 高压电泳：高压电泳：高压电泳：高压电泳：1000V1000V5000V
36、5000V，电泳时间短，有时，电泳时间短，有时，电泳时间短，有时，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。类等小分子物质的分离。类等小分子物质的分离。类等小分子物质的分离。第五节第五节各种电泳技术介绍各种电泳技术介绍5.1 5.1 纸电泳（纸电泳（纸电泳（纸电泳（paper electrophoresispaper electrophoresis）5.2 5.2 醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳5.
37、3 5.3 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳5.4 5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳5.5 SDS-5.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）5.6 5.6 梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳5.7 5.7 等电聚焦等电聚焦等电聚焦等电聚焦5.8 5.8 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE2D-PAGE）5.9 5.9 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电
38、泳毛细管电泳5.10 5.10 免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳 immunoelectrophoresis immunoelectrophoresis5.11 5.11 细胞电泳细胞电泳细胞电泳细胞电泳5.12 5.12 电泳应用法电泳应用法电泳应用法电泳应用法 ionion（t t）ophoretic administra-tionophoretic administra-tion， electrophoretic administration electrophoretic administration5.13 5.13 差异凝胶电泳差异凝胶电泳差异凝胶电泳差异凝胶电泳5.1纸电泳（纸电
39、泳（paperelectrophoresis）纸电泳是在渗透了缓冲液的滤纸上加上电场纸电泳是在渗透了缓冲液的滤纸上加上电场使物质移动的一种区带电泳法。也就是把使物质移动的一种区带电泳法。也就是把样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检样品以带状加在作为支持体的滤纸内来检测其移动和分离的方法。滤纸悬垂或水平测其移动和分离的方法。滤纸悬垂或水平地支在支持板上。地支在支持板上。分辨率比凝胶介质要差，但操作简单，所以分辨率比凝胶介质要差，但操作简单，所以仍有很多应用，特别是在血清样品的临床仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。检测和病毒分析等方面有重要用途。电泳完毕记下滤纸的
40、有效使用长度，然后烘电泳完毕记下滤纸的有效使用长度，然后烘干，用显色剂显色。干，用显色剂显色。定量测定的方法有洗脱法和光密度法。定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下，用洗脱剂洗脱法是将确定的样品区带剪下，用洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。接定量测定各样品电泳区带的含量。5.2醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相似，不同之处在于醋酸纤维薄膜为支与纸电泳相似，不同之处在于醋酸纤维薄膜为支与纸电泳相似，不同之处在于醋酸纤维薄膜为
41、支与纸电泳相似，不同之处在于醋酸纤维薄膜为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后涂布成的均一细密微孔的薄膜。丙酮后涂布成的均一细密微孔的薄膜。丙酮后涂布成的均一细密微孔的薄膜。丙酮后涂布成的均一细密微孔的薄膜。操作简单、快速、价廉，广泛用于分析检测血浆操作简单、快速、价廉，广泛用于分析检测血浆操作简单、快速、价廉，广泛用于分析检测血浆操作简单、快速、价廉，广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体
42、液、蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验
43、的常规技术。规技术。规技术。规技术。正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1：清蛋白；：清蛋白；2：1-球蛋白；球蛋白；3：2-球蛋白；球蛋白；4：-球蛋白；球蛋白；5：-球蛋白；球蛋白；6：点样原点：点样原点醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比的优点：醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比的优点： 对蛋白质样品吸附极少，无对蛋白质样品吸附极少，无对蛋白质样品吸附极少，无对蛋白质样品吸附极少，无“ “拖尾拖尾拖尾拖尾” ”现象。现象。现象。现象。 快速省时。亲水性小，吸水少，电渗作用小。快速省时。亲水性小，吸水少，电渗作用小。快速省时。亲水性小，吸水少，电渗作用小。快速省时。亲水性
44、小，吸水少，电渗作用小。 灵敏度高，样品用量少。临床医学用于检测微量灵敏度高，样品用量少。临床医学用于检测微量灵敏度高，样品用量少。临床医学用于检测微量灵敏度高，样品用量少。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。异常蛋白的改变。异常蛋白的改变。异常蛋白的改变。 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素等。如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素等。如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素等。如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素等。 醋酸纤维薄膜电泳染色后，用
45、乙酸、乙醇混合液醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。光光度计扫描定量及长期保存。光光度计扫描定量及长期保存。光光度计扫描定量及长期保存。5.3琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳天然琼脂天然琼脂（agaragar）是一种多聚糖，主要由琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖糖（agaroseagarose，约，约，约，约80%80
46、%）及琼脂胶及琼脂胶（agaropectinagaropectin）组组成。成。琼脂胶是含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在琼脂胶是含硫酸根和羧基的强酸性多糖，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。度及分离效果。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。质，不带电荷。琼脂糖凝胶电泳优点：琼脂糖凝胶电泳优点：（1 1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快
47、，样品）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。不需事先处理就可以进行电泳。不需事先处理就可以进行电泳。不需事先处理就可以进行电泳。（2 2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%99%98%99%），近似自由电泳，样品扩散较自由，），近似自由电泳，样品扩散较自由，），近似自由电泳，样品扩散较自由，），近似自由电泳，样品扩散较自由，对样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重对样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重对样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重对
48、样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。复性好。复性好。复性好。（3 3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。接用紫外光灯检测及定量测定。接用紫外光灯检测及定量测定。接用紫外光灯检测及定量测定。 （4 4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。测定。制成干膜可长期保存。测定。制成
49、干膜可长期保存。测定。制成干膜可长期保存。 琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。好的抗对流性质。好的抗对流性质。好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖
50、的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。度的琼脂糖形成较小的孔径。度的琼脂糖形成较小的孔径。度的琼脂糖形成较小的孔径。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNADNA
51、、RNARNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。的分析。垂直式电泳应用得相对较少。的分析。垂直式电泳应用得相对较少。的分析。垂直式电泳应用得相对较少。5.3.1蛋白质的琼脂糖凝胶电泳蛋白质的琼脂糖凝胶电泳1 1的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说比较大，的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说比较大，的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说比较大，的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说比较大，对蛋白质的阻碍作用较小。此时蛋白质分子大小对蛋白质的阻碍作用较小。此时蛋白质分子大小对蛋白质的阻碍作用较小。此时蛋白质分子大小对蛋白质的阻碍作用较小。此时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，适用于忽略蛋白对电泳迁移率的影响相
52、对较小，适用于忽略蛋白对电泳迁移率的影响相对较小，适用于忽略蛋白对电泳迁移率的影响相对较小，适用于忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同
53、工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系；超微量技术，可检出系；超微量技术，可检出系；超微量技术，可检出系；超微量技术，可检出0.10.1 g g蛋白质。蛋白质。蛋白质。蛋白质。5.3.2核酸的琼脂糖凝胶电泳核酸的琼脂糖凝胶电泳 用于分离、鉴定核酸、提纯用于分离、鉴定核酸、提纯用于分离、鉴定核酸、提
54、纯用于分离、鉴定核酸、提纯DNADNA片段等。如片段等。如片段等。如片段等。如DNADNA鉴定，鉴定，鉴定，鉴定，DNADNA限制性内切核酸酶图谱制作等。限制性内切核酸酶图谱制作等。限制性内切核酸酶图谱制作等。限制性内切核酸酶图谱制作等。操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNADNA片段混合物，分开的片段混合物，分开的片段混合物，分开的片段混合物，分开的DNADNA可用低浓度的萤光可用低浓度的萤光可用低浓度的萤光可用低浓度的萤光染料（染料（染料（染料（0.5g/ml0.
55、5g/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直溴化乙锭）染色，在紫外灯下直溴化乙锭）染色，在紫外灯下直溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至接观察检测少至接观察检测少至接观察检测少至1ng1ng的的的的DNADNA。对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度密切关系。质量及分子构型，同时与凝胶的浓度密切关系。质量及分子构型，同时与凝胶的浓度密切关系。质量及分子构型，同时与凝胶的浓度密切关系。DNA迁移率取决于以下参数：迁移率取决于以下参数：D
56、NA分子的大小分子的大小线状双链线状双链DNA分子通过凝胶的速率与其分分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。子量的常用对数成反比。用已知分子量的标准物质和待测分子量的用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，可片段同时电泳，比较其电泳速率，可求出待测片段大小。求出待测片段大小。DNA分子超过分子超过20kb时，时，电泳迁移率不再依赖于分子大小。电泳迁移率不再依赖于分子大小。琼脂糖浓度琼脂糖浓度不同大小的不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。凝胶进行电泳分离。琼琼脂糖脂糖脂糖脂糖浓浓度与度与度与度与DNADNA分离范分
57、离范分离范分离范围围琼琼脂糖脂糖脂糖脂糖浓浓度度度度（%）0.30.30.60.60.70.70.90.91.21.21.51.52.02.0线线状状状状DNADNA大小大小大小大小（kbkb） 60-560-520-120-110-0.810-0.87-0.57-0.56-0.46-0.44-0.24-0.23-0.13-0.1DNA构型构型不同构型不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalentlyclosedcircularcovalentlyclosedcircular，cccDNAcccDNA）直直线线DNA开环的双链环状开环的双链环状DNA
58、。琼脂糖浓度太高时，环状琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小而同等大小的直线双链的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方（刚性棒状）则可以长轴方向前进。向前进。电压电压低电压时，线状低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用片段的迁移率与所用电压成正比。电压成正比。电压增高时，大分子量电压增高时，大分子量DNA片段迁移率的片段迁移率的增大是不同的，琼脂糖凝胶的有效分离范增大是不同的，琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。围随电压增大而减小。为了获得为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电片段的最大分辨力，凝胶电
59、泳时电压不应超过泳时电压不应超过5V/cm。5.45.4聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为简称为简称为简称为PAGEPAGE（PolyacrylamidegelelectrophoresisPolyacrylamidegelelectrophoresis），），），），是以聚是以聚是以聚是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。丙烯酰胺凝胶作为支持介质。丙烯酰胺凝胶作为支持介质。丙烯酰胺凝胶作为支持介质。1 1 1 1：样品胶：样品胶：样品胶：样品胶pH6.7 pH6.7 pH6.7 pH6.7 2 2 2 2：浓缩胶：浓缩胶：浓缩胶：浓缩胶pH6.7 pH6
60、.7 pH6.7 pH6.7 3 3 3 3：分离胶：分离胶：分离胶：分离胶pH8.9 pH8.9 pH8.9 pH8.9 4 4 4 4：电极缓冲液：电极缓冲液：电极缓冲液：电极缓冲液pH8.3pH8.3pH8.3pH8.3聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A(A(A(A为正面为正面为正面为正面,B,B,B,B为剖面为剖面为剖面为剖面) ) ) )夹心垂直板电泳槽示意图夹心垂直板电泳槽示意图夹心垂直板电泳槽示意图夹心垂直板电泳槽示意图1.1.1.1.导线接头导线接头导线接头导线接头 2. 2. 2. 2.下贮槽下
61、贮槽下贮槽下贮槽 3.3.3.3.凹形橡胶框凹形橡胶框凹形橡胶框凹形橡胶框 4.4.4.4.样品槽模板样品槽模板样品槽模板样品槽模板 5.5.5.5.固定螺丝固定螺丝固定螺丝固定螺丝 6. 6. 6. 6.上贮槽上贮槽上贮槽上贮槽 7.7.7.7.冷凝系统冷凝系统冷凝系统冷凝系统 凝胶模示意图凝胶模示意图5.4.1聚丙烯酰胺凝胶的聚合聚丙烯酰胺凝胶的聚合聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（acrylamideacrylamide，简称，简称，简称，简称AcrAcr）和甲叉双丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（N,Nmethylene-bisacylamideN,Nmethy
62、lene-bisacylamide，简称，简称，简称，简称BisBis）聚合聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。聚合。化学聚合：通常是加入催化剂过硫酸铵化学聚合：通常是加入催化剂过硫酸铵化学聚合：通常是加入催化剂过硫酸铵化学聚合：通常是加入催化剂过硫酸铵（ammoniumpersulfateammoniumpersulfate，(NH(NH4 4) )2 2S S2 2OO8 8，简称，简称，简称，简称APAP）以及加速剂四甲基乙二胺（）以及加速剂四甲基乙二胺（）以
63、及加速剂四甲基乙二胺（）以及加速剂四甲基乙二胺（N,N,NN,N,N ,N,N - -tetramethylethylenediaminetetramethylethylenediamine，简称，简称，简称，简称TEMEDTEMED）TEMEDTEMED催化过催化过催化过催化过APAP产生自由基：产生自由基：产生自由基：产生自由基：光聚合：催化剂是核黄素（光聚合：催化剂是核黄素（ribofavin，即，即vitaminB2，C17H20O6N4），核黄素在光照），核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照光照23小时即可完成聚合反应。小时即可完成
64、聚合反应。聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在可以在可以在可以在3 33030之间。之间。之间。之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如低浓度的凝胶具有较大的孔径，如低浓度的凝胶具有较大的孔径，如低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3 3的聚丙烯酰的聚丙烯酰的聚丙烯酰的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻
65、碍作用，可用于平胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或板等电聚焦或板等电聚焦或板等电聚焦或SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离胶，也可以用于分离胶，也可以用于分离胶，也可以用于分离DNADNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的作用
66、，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如的电泳中，如的电泳中，如的电泳中，如10102020的凝胶常用于的凝胶常用于的凝胶常用于的凝胶常用于SDS-SDS-聚丙聚丙聚丙聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。烯酰胺凝胶电泳的分离胶。烯酰胺凝胶电泳的分离胶。烯酰胺凝胶电泳的分离胶。聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数度和孔径大小均取决于两个重要参数T和和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。总百
67、分浓度。C是与是与T有关的交联百分浓度。有关的交联百分浓度。T与与C的计算公式是：的计算公式是：T=（a+b）/mC=b/(a+b)a a：丙烯酰胺的克数，：丙烯酰胺的克数，：丙烯酰胺的克数，：丙烯酰胺的克数，b b：甲叉双丙烯酰胺的克数，：甲叉双丙烯酰胺的克数，：甲叉双丙烯酰胺的克数，：甲叉双丙烯酰胺的克数，mm：水或缓冲液体积（：水或缓冲液体积（：水或缓冲液体积（：水或缓冲液体积（mLmL）。）。）。）。a a与与与与b b的重量比应在的重量比应在的重量比应在的重量比应在3030左右，此时凝胶富有弹性，且左右，此时凝胶富有弹性，且左右，此时凝胶富有弹性，且左右，此时凝胶富有弹性，且完全透明
68、。完全透明。完全透明。完全透明。选择选择T和和C的经验公式是：的经验公式是：C=6.50.3TT T：5 52020。C C值并不很严格，可变化的范围值并不很严格，可变化的范围值并不很严格，可变化的范围值并不很严格，可变化的范围约为约为约为约为 11；当当当当C C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着保持恒定时，凝胶的有效孔径随着保持恒定时，凝胶的有效孔径随着保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T T的增加而的增加而的增加而的增加而减小；减小；减小；减小；当当当当T T保持恒定，保持恒定，保持恒定，保持恒定，C C为为为为4 4时，有效孔径最小，时，有效孔径最小，时，有效孔径最小，时，有效孔径最小，C C
69、大于大于大于大于或小于或小于或小于或小于4 4时，有效孔径均变大，时，有效孔径均变大，时，有效孔径均变大，时，有效孔径均变大，C C大于大于大于大于5 5时凝胶时凝胶时凝胶时凝胶变脆，不宜使用。变脆，不宜使用。变脆，不宜使用。变脆，不宜使用。实验中最常用的实验中最常用的实验中最常用的实验中最常用的C C是是是是2.62.6和和和和3 3。 配成配成30的丙烯酰胺水溶液在的丙烯酰胺水溶液在4下能保存下能保存1个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是
70、一种对中枢神丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它们聚合后则无毒。触皮肤，但它们聚合后则无毒。5.4.2聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点目前尚无更好的支持介质能够取代丙烯酰胺凝胶。目前尚无更好的支持介质能够取代丙烯酰胺凝胶。目前尚无更好的支持介质能够取代丙烯酰胺凝胶。目前尚无更好的支持介质能够取代丙烯酰胺凝胶。主要的优点有：主要的优点有：主要的优点有：主要的优点有：可以控制胶浓度可以控制胶浓度可以控制胶浓度可以控制胶浓度“T”“T”和交联度和交联度和交联度和交联度“C”“C”，从而得到不，从而得
71、到不，从而得到不，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。凝胶浓度凝胶浓度凝胶浓度凝胶浓度分离的相对分子质量范围分离的相对分子质量范围分离的相对分子质量范围分离的相对分子质量范围附附附附 注注注注7-7.5%7-7.5%1 1万至万至万至万至100100万万万万凝胶浓度降低时，要适凝胶浓度降低时，要适凝胶浓度降低时，要适凝胶浓度降低时，要适当减少双含丙烯酰胺，当减少双含丙烯酰胺，当减少双含丙烯酰胺，当减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能以改
72、进凝胶的机械性能以改进凝胶的机械性能以改进凝胶的机械性能15-30%15-30%1 1万以下万以下万以下万以下4%4%100100万以上万以上万以上万以上能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：法中，达到更高的灵敏度：1010-9-9 1010-12-12mol/Lmol/L。由于聚丙烯酰胺凝胶是由由于聚丙烯酰胺凝胶是由CC键结合键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基CONH2，没有带电的其他离子基团，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，因而电渗作用比较小，不易化学惰性好，因而电渗作用比较小，不易和
73、样品相互作用。和样品相互作用。高纯度的单体原料制备容易，电泳分离的高纯度的单体原料制备容易，电泳分离的重复性好。重复性好。在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。透在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。透明度好，便于照相和复印。机械强度好，明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。有弹性，不易碎，便于操作和保存。无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。的凝胶扫描作定量分析。还可以用作固定化酶的惰性载体。还可以用作固定化酶的惰性载体。5.5SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）最常用的
74、定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。5.5.1SDS-PAGE5.5.1SDS-PAGE原理原理原理原理SDS-PAGESDS-PAGE是在要走电泳的样品中加入含有是在要走电泳的样品中加入含有是在要走电泳的样品中加入含有是在要走电泳的样品中加入含有SDSSDS和和和和-巯基乙醇的样品处理液。巯基乙醇的样品处理液。巯基乙醇的样品处理
75、液。巯基乙醇的样品处理液。强还原剂强还原剂强还原剂强还原剂-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDSSDS（十二烷基磺酸钠），是一种阴离子表面活（十二烷基磺酸钠），是一种阴离子表面活（十二烷基磺酸钠），是一种阴离子表面活（十二烷基磺酸钠），是一种阴离子表面活性剂（即去污剂），它可以断开分子内和分子间性剂（即去污剂），它可以断开分子内和分子间性剂（即去污剂），它可以断开分子内和
76、分子间性剂（即去污剂），它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。电泳样品加入样品处理液后，沸水浴电泳样品加入样品处理液后，沸水浴电泳样品加入样品处理液后，沸水浴电泳样品加入样品处理液后，沸水浴3 35min5min，使，使，使，使SDSSDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。聚，并形成棒状结构。聚，并形成棒状
77、结构。聚，并形成棒状结构。SDSSDS与蛋白质结合后使蛋白质与蛋白质结合后使蛋白质与蛋白质结合后使蛋白质与蛋白质结合后使蛋白质-SDS-SDS复合物上带有复合物上带有复合物上带有复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDSSDS分子；蛋白质分子本身的电荷完全被分子；蛋白质分子本身的电荷完全被分子；蛋白质分子本身的电荷完全被分子；蛋白质分子本身的电荷完全被SDSSDS掩盖，掩盖，掩盖，掩盖，消除蛋白质本身电荷上的差异。消除蛋白质本身电荷上的差异。消除蛋白质
78、本身电荷上的差异。消除蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。样品凹槽底部
79、。样品凹槽底部。样品凹槽底部。5.5.2SDS-PAGE制备制备制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度的分离胶浓度的分离胶浓度的分离胶浓度分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1 1cmcm），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。），并在浓
80、缩上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺浓度浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺浓度浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺浓度浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺浓度通常为通常为通常为通常为3 35 5），具有较大的孔径，各种蛋白质都），具有较大的孔径，各种蛋白质都），具有较大的孔径，各种蛋白质都），具有较大的孔径，各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常浓缩胶通常浓缩胶通常浓缩胶通常pHpH值较低（通常值较低（通常值较低（通常值较低（通常pH=
81、6.8pH=6.8），用于样品），用于样品），用于样品），用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。 5.5.3SDS-PAGE5.5.3SDS-PAGE系统系统系统系统聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电聚丙
82、烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统：只有分离胶的连续系统和有浓缩泳有两种系统：只有分离胶的连续系统和有浓缩泳有两种系统：只有分离胶的连续系统和有浓缩泳有两种系统：只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统。胶与分离胶的不连续系统。胶与分离胶的不连续系统。胶与分离胶的不连续系统。不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的名的名的名的Ornstein-DavisOrnstein-Davis高高高高pHpH碱性不连续系统，其浓碱性不连续系统，其浓碱性不连续系
83、统，其浓碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为缩胶丙烯酰胺浓度为缩胶丙烯酰胺浓度为缩胶丙烯酰胺浓度为4 4，pH=6.8pH=6.8，分离胶的丙，分离胶的丙，分离胶的丙，分离胶的丙烯酰胺浓度为烯酰胺浓度为烯酰胺浓度为烯酰胺浓度为12.512.5，pH=8.8pH=8.8。电极缓冲液的。电极缓冲液的。电极缓冲液的。电极缓冲液的pH=8.3pH=8.3，用，用，用，用TrisTris、SDSSDS和甘氨酸配制。配胶的缓和甘氨酸配制。配胶的缓和甘氨酸配制。配胶的缓和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用冲液用冲液用冲液用TrisTris、SDSSDS和和和和HClHCl配制。配制。配制。配制。不连续系统浓缩效应
84、示意图不连续系统浓缩效应示意图SDS-PAGESDS-PAGE电泳过程示意图电泳过程示意图电泳过程示意图电泳过程示意图A A：电泳前：电泳前：电泳前：电泳前3 3层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，层凝胶排列顺序，3 3层胶中均有快离子，慢离子层胶中均有快离子，慢离子层胶中均有快离子，慢离子层胶中均有快离子，慢离子B B：电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成：电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成：电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成：电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。极窄的区带。极窄的区带。极窄的区带。CC：显示蛋白质样
85、品分离成数个区带。：显示蛋白质样品分离成数个区带。：显示蛋白质样品分离成数个区带。：显示蛋白质样品分离成数个区带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率）测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（，并对各自分子量的对数（logMr）作图，）作图，即得到标准曲线。即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率
86、），通过标准曲线可以求出未知蛋白的分子量。通过标准曲线可以求出未知蛋白的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得
87、到关于分子量而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。计提纯过程都是非常重要的。5.6梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成梯度凝胶。梯度凝胶。梯度凝胶。梯度凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰
88、胺的浓度呈梯度变化，从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部浓度为如通常顶部浓度为如通常顶部浓度为如通常顶部浓度为5 5，底部浓度为，底部浓度为，底部浓度为，底部浓度为2525。凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，
89、而后溶液浓度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。在凝胶的底部孔径较小。在凝胶的底部孔径较小。在凝胶的底部孔径较小。梯度凝胶电泳也通常加入梯度凝胶电泳也通常加入梯度凝胶电泳也通常加入梯度凝胶电泳也通常加入SDSSDS，并有浓缩胶。电，并有浓缩胶。电，并有浓缩胶。电，并有浓缩胶。电泳过程与泳过程与泳过程与泳过程与SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。梯度凝胶优点：
90、梯度凝胶优点：梯度凝胶比单一浓度凝胶分离范围宽，可梯度凝胶比单一浓度凝胶分离范围宽，可同时分离较大范围分子量的蛋白质。同时分离较大范围分子量的蛋白质。分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔径部分得到分离；径部分得到分离；分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离，径部分得到分离，如：用如：用430的梯度胶可以分离相对分的梯度胶可以分离相对分子质量子质量5万万200万的蛋白质。万的蛋白质。 梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度梯度
91、凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。凝胶中不能分辨的蛋白质。凝胶中不能分辨的蛋白质。凝胶中不能分辨的蛋白质。梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。
92、带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。对于太稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次对于太稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次对于太稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次对于太稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次加样，大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相加样，大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相加样，大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相加样，大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相应的凝胶孔径中而得到分离。应的凝胶孔径中而得到分离。应的凝胶孔径中而得到分离。应的凝胶孔径中而得到分离。 可直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解可直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解可直接测定天然状态蛋
93、白质的分子量而不需要解可直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基，可以与离为亚基，可以与离为亚基，可以与离为亚基，可以与SDS-PAGESDS-PAGE测定分子量的方法互测定分子量的方法互测定分子量的方法互测定分子量的方法互为补充。为补充。为补充。为补充。梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子量，而对纤维蛋白将产生较大的误差。量，而对纤维蛋白将产生较大的误差。由于分子量的测定必须是在未知和标准蛋白由于分子量的测定必须是在未知和标准蛋白质分子到达完全被阻止迁移的孔径时才能质分子到达完全被阻止迁移的孔径时才能成立，因此电泳时要使用较高的电压。成立，因此
94、电泳时要使用较高的电压。例如平板凝胶为例如平板凝胶为0.5mm厚，使用厚，使用600V电压，电压，50mA电流，电泳时间约需电流，电泳时间约需2小时。小时。5.7等电聚焦等电聚焦等电聚焦技术是一种根据样品的等电点等电聚焦技术是一种根据样品的等电点（pI）不同而使它们在）不同而使它们在pH梯度中相互分离梯度中相互分离的一种电泳技术。的一种电泳技术。本法的分辩率极高，所以在进行等电聚焦电泳时，本法的分辩率极高，所以在进行等电聚焦电泳时，本法的分辩率极高，所以在进行等电聚焦电泳时，本法的分辩率极高，所以在进行等电聚焦电泳时，要求样品不能过于复杂，一般应经其他方法（如要求样品不能过于复杂，一般应经其他
95、方法（如要求样品不能过于复杂，一般应经其他方法（如要求样品不能过于复杂，一般应经其他方法（如层析法）提纯后再进行等点聚焦，才能得到比较层析法）提纯后再进行等点聚焦，才能得到比较层析法）提纯后再进行等点聚焦，才能得到比较层析法）提纯后再进行等点聚焦，才能得到比较满意的结果。满意的结果。满意的结果。满意的结果。等电聚焦电泳可以分辨出等电点相差等电聚焦电泳可以分辨出等电点相差等电聚焦电泳可以分辨出等电点相差等电聚焦电泳可以分辨出等电点相差0.010.01的蛋白的蛋白的蛋白的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法
96、。质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基多两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基多两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基多两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基多羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的pHpH梯梯梯梯度范围，既有较宽的范围如度范围，既有较宽的范围如度范围，既有较宽的范围如度范围，既有较宽的范围如pHpH3 31010，也有各，也有各，也有各，也有各种较窄的范围如种较窄的范围如种较窄的范围如种较窄的范围如pHpH7 78 8。
97、两性电解质的两性电解质的两性电解质的两性电解质的pHpH范围越小，分辨率越高。范围越小，分辨率越高。范围越小，分辨率越高。范围越小，分辨率越高。等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋白质微观不均一性白质微观不均一性白质微观不均一性白质微观不均一性. .例例例例1 1：一种蛋白质在：一种蛋白质在：一种蛋白质在：一种蛋白质在SDS-PAGESDS-PAGE中表现单一带，而在中表现单一带，而在中表现单一带，而在中表现单一带，而在等电聚焦中表现三条带。等电聚焦中表现三条带。
98、等电聚焦中表现三条带。等电聚焦中表现三条带。解析：可能是蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三解析：可能是蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三解析：可能是蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三解析：可能是蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的分子量产生明显的影响，因此分子量产生明显的影响，因此分子量产生明显的影响，因此分子量产生明显的影响，因此SDS-PAGESDS-PAGE表现单表现单表现单表现单一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等一带，但由
99、于它们所带的电荷有差异，所以在等一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等电聚焦中可以被分离检测到。电聚焦中可以被分离检测到。电聚焦中可以被分离检测到。电聚焦中可以被分离检测到。例例例例2 2：同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利：同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利：同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利：同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。等电聚焦还可以用于测定某个未知蛋白质的等电聚焦还可以用
100、于测定某个未知蛋白质的等电点。等电点。将一系列已知等电点的标准蛋白（通常将一系列已知等电点的标准蛋白（通常将一系列已知等电点的标准蛋白（通常将一系列已知等电点的标准蛋白（通常pIpI在在在在3.53.51010之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离对各自的距离对各自的距离对各自的距离对各自的pIpI值作图，即得到标准曲线。值作图
101、，即得到标准曲线。值作图，即得到标准曲线。值作图，即得到标准曲线。而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求出其等电点。出其等电点。出其等电点。出其等电点。5.8二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。白质的大
102、小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。蛋白质最有效的一种电泳手段。通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（113mm3mm）中）中）中）中加入含有两性电解质、加入含有两性电解质、加入含有两性电解质、加入含有两性电解质、8M8M的脲以及非离子型去污剂的聚的脲以及非离子型去污剂的聚的脲以及非离子型去污剂的聚的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白
103、质根据其等电点丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。的不同进行分离。的不同进行分离。的不同进行分离。将凝胶从管中取出，用含有将凝胶从管中取出，用含有将凝胶从管中取出，用含有将凝胶从管中取出，用含有SDSSDS的缓冲液处理的缓冲液处理的缓冲液处理的缓冲液处理30min30min，使，使，使，使SDSSDS与蛋白质充分结合。与蛋白质充分结合。与蛋白质充分结合。与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在将处理过的凝胶条放在将处理过的凝胶条放在将处理过的凝胶条放在SDS-PAGESDS-PAGE浓缩胶上，加入丙烯酰浓缩胶上，加入
104、丙烯酰浓缩胶上，加入丙烯酰浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。第二维电泳过程中，结合第二维电泳过程中，结合第二维电泳过程中，结合第二维电泳过程中，结合SDSSDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中的蛋白质从等电聚焦凝胶中的蛋白质从等电聚焦凝胶中的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入进入进入进入SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离聚丙烯酰胺凝胶，在
105、浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出细胞提取液的二维电泳可以分辨出10002000个蛋白质，有些报道可以分辨出个蛋白质，有些报道可以分辨出500010000个斑点，这与细胞中可能存在的蛋个斑点，这与细胞中可能
106、存在的蛋白质数量接近。白质数量接近。二维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工二维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工作。目前已有一些计算机控制的系统可以作。目前已有一些计算机控制的系统可以直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。生物学问题生物学问题生物学问题生物学问题的提出的提出的提出的提出实验模型实验模型实验模型实验模型的设计的设计的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的蛋白样品的蛋白样品的IEFIEF和和和和PAGEPAGE电泳分离电泳分离电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫
107、描和初步分析图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点蛋白点蛋白点的切取的切取的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现新蛋白质的发现新蛋白质的发现新蛋白质的发现其它实验其它实验其它实验其它实验的进一步的进一步的进一步的进一步验证验证验证验证蛋白信息的蛋白信
108、息的蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得初步获得初步获得检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝R-R-250250（CBBCBB，CoomassieCoomassiebrilliantbluebrilliantblue），在聚丙），在聚丙），在聚丙），在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到烯酰胺凝胶中可以检测到烯酰胺凝胶中可以检测到烯酰胺凝胶中可以检测到0.1mg0.1mg的蛋白质形成的的蛋白质形成的的蛋白质形成的的蛋白质形成的染色带。染色带。染色带。染色带。银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法，
109、银银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法，银银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法，银银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法，银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100100倍，可以检测倍，可以检测倍，可以检测倍，可以检测低于低于低于低于1 1ngng的蛋白质。的蛋白质。的蛋白质。的蛋白质。糖蛋白通常使用过碘酸糖蛋白通常使用过碘酸糖蛋白通常使用过碘酸糖蛋白通常使用过碘酸SchiffSchiff试剂（试剂（试剂（试剂（PASPAS）染色，）染色，）染色，）染色，但但但但PASPAS染色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的染
110、色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的染色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的染色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的红粉红带，难以在凝胶中观察。红粉红带，难以在凝胶中观察。红粉红带，难以在凝胶中观察。红粉红带，难以在凝胶中观察。糖蛋白灵敏的检测方法是凝胶印迹后用凝集素。糖蛋白灵敏的检测方法是凝胶印迹后用凝集素。糖蛋白灵敏的检测方法是凝胶印迹后用凝集素。糖蛋白灵敏的检测方法是凝胶印迹后用凝集素。5.9毛细管电泳毛细管电泳5.9.1毛细管电泳的发展史毛细管电泳的发展史毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)(capillaryelectrophore
111、sis,CE)又叫高又叫高又叫高又叫高效毛细管电泳效毛细管电泳效毛细管电泳效毛细管电泳(HPCE)(HPCE)，是近年来发展最快的分析方，是近年来发展最快的分析方，是近年来发展最快的分析方，是近年来发展最快的分析方法之一。法之一。法之一。法之一。19811981年年年年JorgensonJorgenson和和和和LukacsLukacs创立了现代毛细管电泳创立了现代毛细管电泳创立了现代毛细管电泳创立了现代毛细管电泳19841984年年年年TerabeTerabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱等建立了胶束毛细管电动力学色谱等建立了胶束毛细管电动力学色谱等建立了胶束毛细管电动力学色谱1987198
112、7年年年年HjertenHjerten建立了毛细管等电聚焦建立了毛细管等电聚焦建立了毛细管等电聚焦建立了毛细管等电聚焦,Cohen,Cohen和和和和KargerKarger提出了毛细管凝胶电泳。提出了毛细管凝胶电泳。提出了毛细管凝胶电泳。提出了毛细管凝胶电泳。高效毛细管电泳仪实图高效毛细管电泳仪实图1988198819891989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。CECE在生命科学各领域中对多肽、蛋白质在生命科学各领域中对多肽、蛋白质在生命科学各领域中对多肽、蛋白质在生命科学各领域中对多肽、
113、蛋白质( (包括酶，包括酶，包括酶，包括酶，抗体抗体抗体抗体) )、核苷酸乃至脱氧核糖核酸、核苷酸乃至脱氧核糖核酸、核苷酸乃至脱氧核糖核酸、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)的分离分析的分离分析的分离分析的分离分析要求要求要求要求, ,得到了迅速的发展。得到了迅速的发展。得到了迅速的发展。得到了迅速的发展。5.9.2毛细管电泳的特点毛细管电泳的特点CE是利用被分析离子在电场作用下移动的是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。离子的物质。是
114、经典电泳技术和现代微柱是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。分离相结合的产物。CE除了比其它色谱分离分析方法具有效率除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点。应用面同样广泛等优点。CECE的优点可概括为三高二少：的优点可概括为三高二少：的优点可概括为三高二少：的优点可概括为三高二少：高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度, ,常用紫外检测器的检测限可达常用紫外检测器的检测限可达常用紫外检测器的检测限可达常用紫外检测器的检测限可达1010-13-131010-15-15molmol，激光诱导荧光检测器则达，激光诱
115、导荧光检测器则达，激光诱导荧光检测器则达，激光诱导荧光检测器则达1010-19-191010-21-21molmol；高分辨率高分辨率高分辨率高分辨率, ,其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万乃至千万乃至千万乃至千万乃至千万, ,而而而而HPLCHPLC一般为几千到几万；一般为几千到几万；一般为几千到几万；一般为几千到几万；高速度高速度高速度高速度, ,最快可在最快可在最快可在最快可在60s60s内完成内完成内完成内完成, ,在在在在250s250s内分离内分离内分离内分
116、离1010种蛋白质种蛋白质种蛋白质种蛋白质, ,1.7min1.7min分离分离分离分离1919种阳离子种阳离子种阳离子种阳离子,3min,3min内分离内分离内分离内分离3030种阴离子；种阴离子；种阴离子；种阴离子； 样品少样品少样品少样品少, ,只需只需只需只需nLnL(10(10-9-9L)L)级的进样量；级的进样量；级的进样量；级的进样量；成本低成本低成本低成本低, ,只需少量只需少量只需少量只需少量( (几毫升几毫升几毫升几毫升) )流动相和价格低廉的毛细管。流动相和价格低廉的毛细管。流动相和价格低廉的毛细管。流动相和价格低廉的毛细管。CECE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一
117、。有些理成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。有些理成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。有些理成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。有些理论研究和实际应用正在进行与开发。论研究和实际应用正在进行与开发。论研究和实际应用正在进行与开发。论研究和实际应用正在进行与开发。5.9.35.9.3毛细管电泳基本原理毛细管电泳基本原理毛细管电泳基本原理毛细管电泳基本原理CECE和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱。在熔和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱。在熔和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱。在熔和一般电泳法的区别在于使用毛细管柱。在熔融石英毛细管内壁覆盖一层硅氧基（融石英毛细管内壁覆盖一层硅氧基（融
118、石英毛细管内壁覆盖一层硅氧基（融石英毛细管内壁覆盖一层硅氧基（Si-OSi-O）阴离）阴离）阴离）阴离子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管子，由于吸引了溶液中的阳离子，由此在毛细管内壁形成表面带阴离子的双电层。层外缘扩散层内壁形成表面带阴离子的双电层。层外缘扩散层内壁形成表面带阴离子的双电层。层外缘扩散层内壁形成表面带阴离子的双电层。层外缘扩散层中富集的阳离子被阴极吸引导致溶液向阴极的流中富集的阳离子被阴极吸引导致溶液向阴极的流中富集的阳离子被阴极吸引导致溶液向阴极的流中富集的阳离子被阴极吸引导致溶液向阴
119、极的流动，这种效应称为电渗（动，这种效应称为电渗（动，这种效应称为电渗（动，这种效应称为电渗（electroosmosiselectroosmosis）。）。）。）。电渗流的速度电渗流的速度ueo和电场强度和电场强度E成正比，定义成正比，定义电渗淌度电渗淌度eo。eo=ueo/E电渗淌度与硅氧层表面的电荷密度成正比，电渗淌度与硅氧层表面的电荷密度成正比，与离子强度的平方根成反比。与离子强度的平方根成反比。在低在低pH条件下，硅氧层形成分子条件下，硅氧层形成分子（SiSi-OH-OH），），），），因而减少了表面电荷密度，故电渗速度减因而减少了表面电荷密度，故电渗速度减小。如在小。如在pH=9的
120、绷砂缓冲液中电渗淌度约的绷砂缓冲液中电渗淌度约2mm/s，而在，而在pH=3介质中电渗淌度减小约介质中电渗淌度减小约一个数量级。一个数量级。淌度：溶质在单位时间内、单位电场上移动的距离淌度：溶质在单位时间内、单位电场上移动的距离淌度：溶质在单位时间内、单位电场上移动的距离淌度：溶质在单位时间内、单位电场上移动的距离影响电渗的一个重要因素是毛细管中因电流影响电渗的一个重要因素是毛细管中因电流作用产生的焦耳热，能使得柱中心的温度作用产生的焦耳热，能使得柱中心的温度高于边缘的温度，形成抛物线型的温度梯高于边缘的温度，形成抛物线型的温度梯度，管壁附近温度低，中心温度高，结果度，管壁附近温度低，中心温度
121、高，结果使电渗淌度不均匀而造成区带变宽，柱效使电渗淌度不均匀而造成区带变宽，柱效降低。降低。应避免使用过长和内径大于应避免使用过长和内径大于50m的毛细管的毛细管柱，减小毛细管的壁厚、选择适宜的电压柱，减小毛细管的壁厚、选择适宜的电压和缓冲液及使用良好的冷却系统。和缓冲液及使用良好的冷却系统。CE中观察到的离子速度是离子的电泳淌度中观察到的离子速度是离子的电泳淌度eo和溶液的电渗淌度和溶液的电渗淌度ep的加和。定义为表的加和。定义为表观淌度观淌度app，则，则app=ep+eo带正电荷的离子的带正电荷的离子的带正电荷的离子的带正电荷的离子的 epep0 0， eoeo0 0，故，故，故，故 a
122、ppapp总是为总是为总是为总是为正号，离子向阴极移动；正号，离子向阴极移动；正号，离子向阴极移动；正号，离子向阴极移动；带负电荷的离子受电泳流的影响被阴极排斥，带负电荷的离子受电泳流的影响被阴极排斥，带负电荷的离子受电泳流的影响被阴极排斥，带负电荷的离子受电泳流的影响被阴极排斥， epep0 0在高在高在高在高pHpH条件下，若条件下，若条件下，若条件下，若 eoeo epep， appapp仍为正号，离子仍为正号，离子仍为正号，离子仍为正号，离子仍然可向阴极移动，仍然可向阴极移动，仍然可向阴极移动，仍然可向阴极移动，低低低低pHpH条件下，条件下，条件下，条件下， appapp可为负号，离
123、子将向反方向移可为负号，离子将向反方向移可为负号，离子将向反方向移可为负号，离子将向反方向移动。此时必须改变电场方向，方可检测到欲分析动。此时必须改变电场方向，方可检测到欲分析动。此时必须改变电场方向，方可检测到欲分析动。此时必须改变电场方向，方可检测到欲分析的离子。的离子。的离子。的离子。对于实际淌度为对于实际淌度为net的组分的组分app=net/E=（Ld/t）/（V/Lt）L Ld d：从进样口到检测器的实际柱长；：从进样口到检测器的实际柱长；：从进样口到检测器的实际柱长；：从进样口到检测器的实际柱长；L Lt t ：总柱长；：总柱长；：总柱长；：总柱长；V V：电压；：电压；：电压；
124、：电压；t t：所需的分析时间。：所需的分析时间。：所需的分析时间。：所需的分析时间。实际测试电渗淌度时可用中性组分，此时实际测试电渗淌度时可用中性组分，此时ep=0,eo=app,eo=/E=（Ld/t）/（V/Lt）5.9.4毛细管电泳基本装置毛细管电泳基本装置CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。前三个部件均易实现和检测器。前三个部件均易实现,困难之处困难之处在于检测器。在于检测器。迄今为止迄今为止,除了原子吸收光谱、电感耦合等除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱离子体发射光谱(ICP)及红外光谱未用于及红外光谱未用于CE外外,其它检测手
125、段如：紫外、荧光、电化学、其它检测手段如：紫外、荧光、电化学、质谱、激光等类型检测器均已用于质谱、激光等类型检测器均已用于CE。电渗是电渗是CE中推动流体前进的驱动力中推动流体前进的驱动力,它使整它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动，个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动，使整个流型呈近似扁平型的使整个流型呈近似扁平型的“塞式流塞式流”。它。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。与与HPLC类似类似,CE中应用最广泛的是紫外中应用最广泛的是紫外/可可见检测器。见检测器。按检测方式可分为固定波长或可变波长检测按检测方式可分为固定波长或可变波长检测器和二
126、极管阵列或波长扫描检测器两类。器和二极管阵列或波长扫描检测器两类。毛细管电泳仪系统毛细管电泳仪系统电泳仪电泳仪数据处理系统数据处理系统检测系统检测系统进样系统进样系统理论分析表明理论分析表明理论分析表明理论分析表明, ,增加速度是减少谱带展宽、提高增加速度是减少谱带展宽、提高增加速度是减少谱带展宽、提高增加速度是减少谱带展宽、提高效率的重要途径效率的重要途径效率的重要途径效率的重要途径, ,增加电场强度可以提高速度。增加电场强度可以提高速度。增加电场强度可以提高速度。增加电场强度可以提高速度。但高场强导致电流增加但高场强导致电流增加但高场强导致电流增加但高场强导致电流增加, ,引起毛细管中电解
127、质产引起毛细管中电解质产引起毛细管中电解质产引起毛细管中电解质产生焦耳热生焦耳热生焦耳热生焦耳热( (自热自热自热自热) )。自热将使流体在径向产生抛物。自热将使流体在径向产生抛物。自热将使流体在径向产生抛物。自热将使流体在径向产生抛物线型温度分布线型温度分布线型温度分布线型温度分布, ,即管轴中心温度要比近壁处温度即管轴中心温度要比近壁处温度即管轴中心温度要比近壁处温度即管轴中心温度要比近壁处温度高。高。高。高。溶液粘度随温度升高呈指数下降溶液粘度随温度升高呈指数下降溶液粘度随温度升高呈指数下降溶液粘度随温度升高呈指数下降, ,温度梯度使介温度梯度使介温度梯度使介温度梯度使介质粘度在径向产生
128、梯度质粘度在径向产生梯度质粘度在径向产生梯度质粘度在径向产生梯度, ,从而影响溶质迁移速度从而影响溶质迁移速度从而影响溶质迁移速度从而影响溶质迁移速度, ,使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得更快更快更快更快, ,造成谱带展宽造成谱带展宽造成谱带展宽造成谱带展宽, ,柱效下降。柱效下降。柱效下降。柱效下降。一般来说温度每提高一般来说温度每提高一般来说温度每提高一般来说温度每提高1,1,将使淌度增加将使淌度增加将使淌度增加将使淌度增加2%(2%(所谓所谓所谓所谓淌度
129、淌度淌度淌度, ,即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离移动的距离移动的距离移动的距离) )。 此外此外此外此外, ,温度改变使溶液温度改变使溶液温度改变使溶液温度改变使溶液pHpH值、粘度等发生变化值、粘度等发生变化值、粘度等发生变化值、粘度等发生变化, ,进一步导进一步导进一步导进一步导致电渗流、溶质分子的电荷分布致电渗流、溶质分子的电荷分布致电渗流、溶质分子的电荷分布致电渗流、溶质分子的电荷分布( (包括蛋白质的结构包括蛋白质的结构包括蛋白质的结构包括蛋白质的结构) )、离
130、、离、离、离子强度等的改变子强度等的改变子强度等的改变子强度等的改变, ,造成淌度改变、重复性变差、柱效下降造成淌度改变、重复性变差、柱效下降造成淌度改变、重复性变差、柱效下降造成淌度改变、重复性变差、柱效下降等现象。等现象。等现象。等现象。 降低缓冲液浓度可降低电流强度降低缓冲液浓度可降低电流强度降低缓冲液浓度可降低电流强度降低缓冲液浓度可降低电流强度, ,使温差变化减小。高离使温差变化减小。高离使温差变化减小。高离使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, ,并可产生柱上浓并
131、可产生柱上浓并可产生柱上浓并可产生柱上浓度聚焦效应度聚焦效应度聚焦效应度聚焦效应, ,防止峰扩张防止峰扩张防止峰扩张防止峰扩张, ,改善峰形。改善峰形。改善峰形。改善峰形。 减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚, ,但细管径使进样量减少但细管径使进样量减少但细管径使进样量减少但细管径使进样量减少, ,造成进样、检测等技术上的困难。造成进样、检测等技术上的困难。造成进样、检测等技术上的困难。造成进样、检测等技术上的困难。因此因此因此因此, ,
132、加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。液体加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。液体加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。液体加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。液体的导热系数要比空气高的导热系数要比空气高的导热系数要比空气高的导热系数要比空气高100100倍。现在有的采用液体冷却方倍。现在有的采用液体冷却方倍。现在有的采用液体冷却方倍。现在有的采用液体冷却方式的毛细管电泳仪可使用离子强度高达式的毛细管电泳仪可使用离子强度高达式的毛细管电泳仪可使用离子强度高达式的毛细管电泳仪可使用离子强度高达0.5mol/L0.5mol/L的缓冲液的缓冲液的缓冲液的缓冲液进行分离进行分离进行分离进行
133、分离, ,或使用或使用或使用或使用200200直径的毛细管进行微量制备直径的毛细管进行微量制备直径的毛细管进行微量制备直径的毛细管进行微量制备, ,仍能达仍能达仍能达仍能达到良好的分离效果和重现性。到良好的分离效果和重现性。到良好的分离效果和重现性。到良好的分离效果和重现性。5.9.5毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式CE现有六种分离模式：现有六种分离模式：.毛细管区带电泳毛细管区带电泳(capillaryzoneelectrophoresis,(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)CZE)，又称毛细管自由电泳又称毛细管自由电泳,是是CE中最基本、中最基本、
134、应用最普遍的一种模式。前述基本原理即应用最普遍的一种模式。前述基本原理即是是CZE的基本原理。的基本原理。2.2.胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱 (micellarelectrokineticcapillary(micellarelectrokineticcapillarychromatography,MECC)chromatography,MECC)把一些离子型表面活性剂把一些离子型表面活性剂把一些离子型表面活性剂把一些离子型表面活性剂( (如如如如SDS)SDS)加到缓冲液中加到缓冲液中加到缓冲液中加到缓冲液中, ,当其浓当其浓当其浓当其浓度超过临
135、界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。束。束。束。虽然胶束带负电虽然胶束带负电虽然胶束带负电虽然胶束带负电, ,但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度的迁移速度的迁移速度的迁移速度, ,故胶束将以较低速度向阴极移动。故胶束将以较低速度向阴极移动。故胶束将以较低速度向阴极移动。故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相溶质在水相
136、和胶束相溶质在水相和胶束相溶质在水相和胶束相( (准固定相准固定相准固定相准固定相) )之间产生分配之间产生分配之间产生分配之间产生分配, ,中性粒子中性粒子中性粒子中性粒子因其本身疏水性不同因其本身疏水性不同因其本身疏水性不同因其本身疏水性不同, ,在二相中分配就有差异在二相中分配就有差异在二相中分配就有差异在二相中分配就有差异, ,疏水性强疏水性强疏水性强疏水性强的胶束结合牢的胶束结合牢的胶束结合牢的胶束结合牢, ,流出时间长流出时间长流出时间长流出时间长, ,最终按中性粒子疏水性不同最终按中性粒子疏水性不同最终按中性粒子疏水性不同最终按中性粒子疏水性不同得以分离。得以分离。得以分离。得以
137、分离。MECCMECC使使使使CECE能用于中性物质的分离能用于中性物质的分离能用于中性物质的分离能用于中性物质的分离, ,拓宽了拓宽了拓宽了拓宽了CECE的应用范的应用范的应用范的应用范围围围围, ,是对是对是对是对CECE极大的贡献。极大的贡献。极大的贡献。极大的贡献。3.3.毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 (capillarygelelectrophoresis,CGE)(capillarygelelectrophoresis,CGE)将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电
138、泳。将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性凝胶具有多孔性凝胶具有多孔性凝胶具有多孔性, ,起类似分子筛的作用起类似分子筛的作用起类似分子筛的作用起类似分子筛的作用, ,溶质按分子大小逐溶质按分子大小逐溶质按分子大小逐溶质按分子大小逐一分离。一分离。一分离。一分离。凝胶粘度大凝胶粘度大凝胶粘度大凝胶粘度大, ,能减少溶质的扩散能减少溶质的扩散能减少溶质的扩散能减少溶质的扩散, ,所得峰形尖锐所得峰形尖锐所得峰形尖锐所得峰形尖锐, ,能达到能达到能达到能达到CECE中最高的柱效。中最高的柱效。中最高的柱效。中最高的柱效。常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱常用聚丙烯酰胺在毛细
139、管内交联制成凝胶柱常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱, ,可分离、测可分离、测可分离、测可分离、测定蛋白质和定蛋白质和定蛋白质和定蛋白质和DNADNA的分子量或碱基数的分子量或碱基数的分子量或碱基数的分子量或碱基数, ,但其制备麻烦但其制备麻烦但其制备麻烦但其制备麻烦, ,使用使用使用使用寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺, ,可形成无凝胶但有筛分作用的无胶
140、筛分可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分(Non-(Non-GelSieving)GelSieving)介质。它能避免空泡形成介质。它能避免空泡形成介质。它能避免空泡形成介质。它能避免空泡形成, ,比凝胶柱制备简单比凝胶柱制备简单比凝胶柱制备简单比凝胶柱制备简单, ,寿命长寿命长寿命长寿命长, ,但分离能力比凝胶柱略差。但分离能力比凝胶柱略差。但分离能力比凝胶柱略差。但分离能力比凝胶柱略差。CGECGE和无胶筛分已发展成第二代和无胶筛分已发展成第二代和无胶筛分已发展成第二代和无胶筛分已发展成第二代DNADNA序列测定仪序列测定仪
141、序列测定仪序列测定仪, ,在人类在人类在人类在人类基因组计划中起重要作用。基因组计划中起重要作用。基因组计划中起重要作用。基因组计划中起重要作用。4.4.毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 (capillaryisoelectricfocusing,(capillaryisoelectricfocusing,CIEF)CIEF)将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。通过管壁涂层使电渗流减到最小通过管壁涂层使电渗流减到最小通过管壁涂层使电渗流减到最小通过管壁涂层
142、使电渗流减到最小, ,以防蛋白质吸以防蛋白质吸以防蛋白质吸以防蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带附及破坏稳定的聚焦区带附及破坏稳定的聚焦区带附及破坏稳定的聚焦区带, ,再将样品与两性电解再将样品与两性电解再将样品与两性电解再将样品与两性电解质混合进样质混合进样质混合进样质混合进样, ,两端贮瓶分别为酸和碱。两端贮瓶分别为酸和碱。两端贮瓶分别为酸和碱。两端贮瓶分别为酸和碱。加高压加高压加高压加高压(6(68kV)38kV)35min5min后后后后, ,毛细管内部建立毛细管内部建立毛细管内部建立毛细管内部建立pHpH梯度梯度梯度梯度, ,蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦蛋白质在毛细管中向各自等电点聚
143、焦蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦, ,形成形成形成形成明显的区带。明显的区带。明显的区带。明显的区带。最后改变检测器末端贮瓶内的最后改变检测器末端贮瓶内的最后改变检测器末端贮瓶内的最后改变检测器末端贮瓶内的pHpH值值值值, ,使聚焦的蛋使聚焦的蛋使聚焦的蛋使聚焦的蛋白质依次通过检测器而得以确认。白质依次通过检测器而得以确认。白质依次通过检测器而得以确认。白质依次通过检测器而得以确认。5.5.毛细管等速电泳毛细管等速电泳毛细管等速电泳毛细管等速电泳 (capillaryisotachor-phoresis,CITP)(capillaryisotachor-ph
144、oresis,CITP)是一种较早的模式，采用先导电解质和后继电解是一种较早的模式，采用先导电解质和后继电解是一种较早的模式，采用先导电解质和后继电解是一种较早的模式，采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离，常用于质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离，常用于质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离，常用于质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离，常用于分离离子型物质，目前应用不多。分离离子型物质，目前应用不多。分离离子型物质，目前应用不多。分离离子型物质，目前应用不多。6.6.毛细管电色谱毛细管电色谱毛细管电色谱毛细管电色谱 (capillaryelectrochromatography
145、,(capillaryelectrochromatography,CEC)CEC)将将将将HPLCHPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中，中众多的固定相微粒填充到毛细管中，中众多的固定相微粒填充到毛细管中，中众多的固定相微粒填充到毛细管中，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所电渗流为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所电渗流为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所电渗流为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所下降，下降，下降，下降
146、， 但增加了选择性。此法有发展前景。但增加了选择性。此法有发展前景。但增加了选择性。此法有发展前景。但增加了选择性。此法有发展前景。5.10免疫电泳免疫电泳immunoelectrophoresis把电泳法同双向扩散试验配合起来，对复杂组成把电泳法同双向扩散试验配合起来，对复杂组成把电泳法同双向扩散试验配合起来，对复杂组成把电泳法同双向扩散试验配合起来，对复杂组成的抗原进行定性的方法。此法是由格拉巴（的抗原进行定性的方法。此法是由格拉巴（的抗原进行定性的方法。此法是由格拉巴（的抗原进行定性的方法。此法是由格拉巴（P PGrabarGrabar）和威廉斯（）和威廉斯（）和威廉斯（）和威廉斯（C
147、CA AWilliamsJrWilliamsJr，19531953）所开创，主要用于分析血清蛋白的组成。）所开创，主要用于分析血清蛋白的组成。）所开创，主要用于分析血清蛋白的组成。）所开创，主要用于分析血清蛋白的组成。在琼脂凝胶内进行时，首先将血清施行电泳，然在琼脂凝胶内进行时，首先将血清施行电泳，然在琼脂凝胶内进行时，首先将血清施行电泳，然在琼脂凝胶内进行时，首先将血清施行电泳，然后在与电泳方向相平行两侧开槽，使该血清的抗后在与电泳方向相平行两侧开槽，使该血清的抗后在与电泳方向相平行两侧开槽，使该血清的抗后在与电泳方向相平行两侧开槽，使该血清的抗血清流入沟中，在适当的湿度、温度条件下，静血清
148、流入沟中，在适当的湿度、温度条件下，静血清流入沟中，在适当的湿度、温度条件下，静血清流入沟中，在适当的湿度、温度条件下，静置约置约置约置约1 1天，可看到抗血清沿着沟形成许多弓形沉淀天，可看到抗血清沿着沟形成许多弓形沉淀天，可看到抗血清沿着沟形成许多弓形沉淀天，可看到抗血清沿着沟形成许多弓形沉淀线。线。线。线。免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。这种技术有两大优点：产物。这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度一是加快了沉淀反应的速度二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此作更
149、将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。细微的分析。免疫电泳扩散模式图免疫电泳扩散模式图白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白A1bA1b；球蛋白；球蛋白；球蛋白；球蛋白11区、区、区、区、22区、区、区、区、 区和区和区和区和 区区区区ALBALBALBALB11112222白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白1-1-1-1-抗抗抗抗胰蛋白胰蛋白胰蛋白胰蛋白酶酶酶酶触珠蛋白触珠蛋白触珠蛋白触珠蛋白转铁转铁蛋白蛋白蛋白蛋白IgGIgGIgGIgG前白蛋前白蛋前白蛋前白蛋白白白白1-1-1-1-酸酸酸酸糖蛋白糖蛋白糖蛋白糖蛋白铜蓝铜蓝蛋白蛋白蛋白蛋白C3aC3aC3aC3a、C3bC3bC3bC3bCRPCRPC
150、RPCRP1111脂脂脂脂蛋白蛋白蛋白蛋白抗糜蛋抗糜蛋抗糜蛋抗糜蛋白白白白酶酶酶酶2-2-2-2-巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白IgAIgAIgAIgA、IgMIgMIgMIgM、IgDIgDIgDIgD、纤维纤维蛋蛋蛋蛋白原、白原、白原、白原、1111脂蛋白、血凝脂蛋白、血凝脂蛋白、血凝脂蛋白、血凝素素素素 血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分血浆免疫电泳各区带所含蛋白成分血浆蛋白各区带位置示意图血浆蛋白各区带位置示意图PreALBPreALB：前白蛋白；：前白蛋白；：前白蛋白；：前白蛋白；HPHP：触珠蛋白；：触珠蛋白；：触珠蛋白；：
151、触珠蛋白；11脂蛋白；脂蛋白；脂蛋白；脂蛋白；ALBALB：白蛋白；白蛋白；白蛋白；白蛋白；TRFTRF：转铁蛋白：转铁蛋白：转铁蛋白：转铁蛋白LIPLIP： 脂蛋白；脂蛋白；脂蛋白；脂蛋白；AATAAT：抗胰蛋白酶；：抗胰蛋白酶；：抗胰蛋白酶；：抗胰蛋白酶；AAGAAG：酸糖蛋白；：酸糖蛋白；：酸糖蛋白；：酸糖蛋白；2M2M：22巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白巨球蛋白免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响：免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响：免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响：免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响：首先是抗原与抗体的比例，同其它沉淀反应一样，要首先是抗原与
152、抗体的比例，同其它沉淀反应一样，要首先是抗原与抗体的比例，同其它沉淀反应一样，要首先是抗原与抗体的比例，同其它沉淀反应一样，要预测抗体与抗原的最适比；预测抗体与抗原的最适比；预测抗体与抗原的最适比；预测抗体与抗原的最适比；其次是抗血清的抗体谱，一只动物的抗血清往往缺乏其次是抗血清的抗体谱，一只动物的抗血清往往缺乏其次是抗血清的抗体谱，一只动物的抗血清往往缺乏其次是抗血清的抗体谱，一只动物的抗血清往往缺乏某些抗体，如将几只动物或几种动物的抗血清混合使某些抗体，如将几只动物或几种动物的抗血清混合使某些抗体，如将几只动物或几种动物的抗血清混合使某些抗体，如将几只动物或几种动物的抗血清混合使用，则效果
153、更好；用，则效果更好；用，则效果更好；用，则效果更好；电泳条件，如缓冲液、琼脂和电泳等皆可直接影响沉电泳条件，如缓冲液、琼脂和电泳等皆可直接影响沉电泳条件，如缓冲液、琼脂和电泳等皆可直接影响沉电泳条件，如缓冲液、琼脂和电泳等皆可直接影响沉淀线的分辨率。淀线的分辨率。淀线的分辨率。淀线的分辨率。对于免疫电泳的分析，更重要的是经验的积累，只有对于免疫电泳的分析，更重要的是经验的积累，只有对于免疫电泳的分析，更重要的是经验的积累，只有对于免疫电泳的分析，更重要的是经验的积累，只有多看，多对比分析，才能作出恰当的结论。多看，多对比分析，才能作出恰当的结论。多看，多对比分析，才能作出恰当的结论。多看，多
154、对比分析，才能作出恰当的结论。免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别等方面。及正常和异常体液蛋白的识别等方面。及正常和异常体液蛋白的识别等方面。及正常和异常体液蛋白的识别等方面。5.10.2对流免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳是定向加对流免疫电泳是定向加速度的免疫双扩散技术。速度的免疫双扩散技术。其基本原理是：在琼脂板上打两排孔，左侧其基本原理是：在琼脂板上打两排孔，左侧各孔加入待测抗原，右侧孔内放入相应抗各孔加入待测抗原，
155、右侧孔内放入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，带负电荷的抗原泳向阳极抗体侧，而后，带负电荷的抗原泳向阳极抗体侧，而抗体藉电渗作用流向阴极抗原侧，在两者抗体藉电渗作用流向阴极抗原侧，在两者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线。沉淀线。5.10.3火箭免疫电泳火箭免疫电泳又称单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单又称单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。是加速度的单向扩散。在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入在含抗体的琼脂板
156、一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距待测标本后，将抗原置阴极端，用横距23mA/cm的电流强度进行电泳。的电流强度进行电泳。火箭电泳图火箭电泳图火箭电泳图火箭电泳图为标本；为标本；为标本；为标本；为标准抗原为标准抗原为标准抗原为标准抗原抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，用标本中的抗原含量。用标本中的抗原含量。
157、火箭电泳操作时应注意以下几点：火箭电泳操作时应注意以下几点：1所用琼脂可选择无电渗或电渗很小的，否所用琼脂可选择无电渗或电渗很小的，否则火箭形状不规则。则火箭形状不规则。2注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。3标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后再加样。搭桥并开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底峰形，使定量不准。否则易形成宽底峰形，使定量不准。4作作IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火
158、箭峰因电渗呈纺缍状。为了纠正这同，火箭峰因电渗呈纺缍状。为了纠正这种现象，可用甲醛与种现象，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲上的氨基结合（甲酰化），使本来带两性电荷的酰化），使本来带两性电荷的IgG变为只带变为只带电荷，加快了电泳速度，抵消了电渗作用，电荷，加快了电泳速度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。而出现伸向阳极的火箭峰。5火箭电泳作为抗原定量只能测定火箭电泳作为抗原定量只能测定g/ml以以上的含量，如低于此水平则难于形成可见上的含量，如低于此水平则难于形成可见的沉淀峰。加入少量的沉淀峰。加入少量125I标记的标准抗原共标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可同电泳，
159、则可在含抗体的琼脂中形成不可见的放射自显影技术。根据自显影火箭峰见的放射自显影技术。根据自显影火箭峰降低的程度（竞争法）可计算出抗原的浓降低的程度（竞争法）可计算出抗原的浓度。放射免疫自显影技术可测出度。放射免疫自显影技术可测出ng/ml的抗的抗原浓度。原浓度。5.10.4免疫固定电泳免疫固定电泳免疫固定电泳（免疫固定电泳（免疫固定电泳（免疫固定电泳（immunofixationelectrophoresisimmunofixationelectrophoresis，IFEIFE）是）是）是）是AlperAlper和和和和JohnsonJohnson（19691969）推荐的一项有实用价值的电
160、泳加）推荐的一项有实用价值的电泳加）推荐的一项有实用价值的电泳加）推荐的一项有实用价值的电泳加沉淀反应技术。可用于各种蛋白质的鉴定。沉淀反应技术。可用于各种蛋白质的鉴定。沉淀反应技术。可用于各种蛋白质的鉴定。沉淀反应技术。可用于各种蛋白质的鉴定。原理类似免疫电泳，不同之处是将血清直接加于电泳后蛋原理类似免疫电泳，不同之处是将血清直接加于电泳后蛋原理类似免疫电泳，不同之处是将血清直接加于电泳后蛋原理类似免疫电泳，不同之处是将血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与白质
161、区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固物中。将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固物中。将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固物中。将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定的某种蛋白。定的某种蛋白。定的某种蛋白。定的某种蛋白。区带电泳支持物选用滤纸、醋纤膜、琼脂或聚丙烯酰胺皆区带电泳支持物选用滤纸、醋纤膜、琼脂或聚丙烯酰胺
162、皆区带电泳支持物选用滤纸、醋纤膜、琼脂或聚丙烯酰胺皆区带电泳支持物选用滤纸、醋纤膜、琼脂或聚丙烯酰胺皆可。可。可。可。5.10.5放射免疫对流电泳放射免疫对流电泳将放射性元素标记的抗体（或抗原）与相应将放射性元素标记的抗体（或抗原）与相应的抗原（或抗体）沉淀时，沉淀线通过自的抗原（或抗体）沉淀时，沉淀线通过自显影而证实。显影而证实。能检出肉眼看不见的沉淀线，从而提高反应能检出肉眼看不见的沉淀线，从而提高反应的敏感性，这种方法可应用于凝胶中的所的敏感性，这种方法可应用于凝胶中的所有反应。有反应。5.10.6酶标对流免疫电泳酶标对流免疫电泳利用酶标记抗原（抗体）和待测抗体（抗原）利用酶标记抗原（抗
163、体）和待测抗体（抗原）在电场中向一定方向移动，在比例适当的在电场中向一定方向移动，在比例适当的地方形成沉淀线，通过酶作用底物而显色，地方形成沉淀线，通过酶作用底物而显色，指示沉淀线的存在。指示沉淀线的存在。敏感性大大高于对流免疫电泳。敏感性大大高于对流免疫电泳。5.10.7免疫电泳结果分析免疫电泳结果分析1 1常见的沉淀弧常见的沉淀弧常见的沉淀弧常见的沉淀弧由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，而相应的抗体呈直线扩散，因此生成的沉淀一
164、般多呈弧形，而相应的抗体呈直线扩散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，而相应的抗体呈直线扩散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，而相应的抗体呈直线扩散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常见的弧形如下：常见的弧形如下：常见的弧形如下：常见的弧形如下：交叉弧：表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不交叉弧：表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不交叉弧：表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不交叉弧：表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不同；同；同；同；平行弧：表示两个不同的抗原成分，它们的迁移率平行弧：表示两个不同的抗原成分，它们的迁移率平行弧：表示两个不同的抗原成分，它们的迁移率平行弧：表示两个不同的抗原成
165、分，它们的迁移率相同，但扩散率不同；相同，但扩散率不同；相同，但扩散率不同；相同，但扩散率不同；加宽弧：一般是由于抗原过量所加宽弧：一般是由于抗原过量所加宽弧：一般是由于抗原过量所加宽弧：一般是由于抗原过量所致；致；致；致；分枝弧：一般是由于抗体过量；分枝弧：一般是由于抗体过量；分枝弧：一般是由于抗体过量；分枝弧：一般是由于抗体过量；沉淀线中间逐渐沉淀线中间逐渐沉淀线中间逐渐沉淀线中间逐渐加宽并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处加宽并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处加宽并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处加宽并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处形成；形
166、成；形成；形成；其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。2沉淀弧的曲度沉淀弧的曲度匀质性的物质具有明确的迁移率，能生成曲匀质性的物质具有明确的迁移率，能生成曲度较大的沉淀弧。度较大的沉淀弧。有较宽迁移范围的物质，其沉淀弧曲度较小。有较宽迁移范围的物质，其沉淀弧曲度较小。3 3沉淀的清晰度沉淀的清晰度沉淀的清晰度沉淀的清晰度沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关，沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关，沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关，沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关，也与抗体的来源有关。
167、也与抗体的来源有关。也与抗体的来源有关。也与抗体的来源有关。抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗体的特点是形抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗体的特点是形抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗体的特点是形抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗体的特点是形成沉淀线宽而淡，抗体过量对沉淀线影响较小，成沉淀线宽而淡，抗体过量对沉淀线影响较小，成沉淀线宽而淡，抗体过量对沉淀线影响较小，成沉淀线宽而淡，抗体过量对沉淀线影响较小，而抗原过量，沉淀线发生部分溶解。马抗血清所而抗原过量，沉淀线发生部分溶解。马抗血清所而抗原过量，沉淀线发生部分溶解。马抗血清所而抗原过量，沉淀线发生部分溶解。马抗血清所形成的沉淀线致密、清晰，抗原或抗体过
168、量时，形成的沉淀线致密、清晰，抗原或抗体过量时，形成的沉淀线致密、清晰，抗原或抗体过量时，形成的沉淀线致密、清晰，抗原或抗体过量时，复合物沉淀溶解、消失，而且产生继发性的非特复合物沉淀溶解、消失，而且产生继发性的非特复合物沉淀溶解、消失，而且产生继发性的非特复合物沉淀溶解、消失，而且产生继发性的非特异性沉淀。因此使用抗原抗体时，一定要找好适异性沉淀。因此使用抗原抗体时，一定要找好适异性沉淀。因此使用抗原抗体时，一定要找好适异性沉淀。因此使用抗原抗体时，一定要找好适当的比例。当的比例。当的比例。当的比例。4沉淀弧的位置沉淀弧的位置高分子量的物质扩散慢，所形成的沉淀线离高分子量的物质扩散慢，所形成
169、的沉淀线离抗原孔较近；抗原孔较近；分子量较小的物质，扩散速度快，沉淀弧离分子量较小的物质，扩散速度快，沉淀弧离抗体槽近一些。抗体槽近一些。抗原浓度高沉淀弧偏近抗体槽抗原浓度高沉淀弧偏近抗体槽.抗体浓度过高，沉淀弧偏近抗原孔。抗体浓度过高，沉淀弧偏近抗原孔。5.10.8 注意事项注意事项1 1免疫电泳分析法的成功与否，主要取决于抗血清免疫电泳分析法的成功与否，主要取决于抗血清免疫电泳分析法的成功与否，主要取决于抗血清免疫电泳分析法的成功与否，主要取决于抗血清的质量。抗血清中必须含有足够的抗体，才能同的质量。抗血清中必须含有足够的抗体，才能同的质量。抗血清中必须含有足够的抗体，才能同的质量。抗血清
170、中必须含有足够的抗体，才能同被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。2 2抗血清虽然含有对所有抗原物质的相应抗体，但抗血清虽然含有对所有抗原物质的相应抗体，但抗血清虽然含有对所有抗原物质的相应抗体，但抗血清虽然含有对所有抗原物质的相应抗体，但抗体效价有高有低，因此要适当考虑抗原孔径的抗体效价有高有低，因此要适当考虑抗原孔径的抗体效价有高有低，因此要适当考虑抗原孔径的抗体效价有高有低，因此要适当考虑抗原孔径的大小和抗体槽的距离。大小和抗体槽的距离。大小和抗体槽的距离。大小和抗体槽的距离。3 3
171、免疫电泳要求分析的物质一方为抗原，另一方为免疫电泳要求分析的物质一方为抗原，另一方为免疫电泳要求分析的物质一方为抗原，另一方为免疫电泳要求分析的物质一方为抗原，另一方为沉淀反应性抗体。因此没有抗原性的物质或抗原沉淀反应性抗体。因此没有抗原性的物质或抗原沉淀反应性抗体。因此没有抗原性的物质或抗原沉淀反应性抗体。因此没有抗原性的物质或抗原性差的物质、非沉淀反应性抗体，均不能用免疫性差的物质、非沉淀反应性抗体，均不能用免疫性差的物质、非沉淀反应性抗体，均不能用免疫性差的物质、非沉淀反应性抗体，均不能用免疫电泳进行分析。电泳进行分析。电泳进行分析。电泳进行分析。5.115.11细胞电泳（细胞电泳（细胞
172、电泳（细胞电泳（cellelectrophoresiscellelectrophoresis）在一定在一定在一定在一定pHpH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳。加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳。加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳。加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳。引起细胞电泳的电位值称为引起细胞电泳的电位值称为引起细胞电泳的电位值称为引起细胞电泳的电位值称为 电位。电位。电位。电位。各种细胞或处于不
173、同生理状态的同种细胞荷电量有所各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。尚可用来不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。尚可用来不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。尚可用来不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。尚可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。胞分开。胞分开。胞分开。恒定的电场下，同种细胞的电泳速度
174、相当稳定，因而恒定的电场下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而恒定的电场下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而恒定的电场下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的可通过测定电泳速度来推算出细胞的可通过测定电泳速度来推算出细胞的可通过测定电泳速度来推算出细胞的 电位。电位。电位。电位。 电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。断疾病上有一定价值。断疾病上有一定价值。断疾病上有一定价值。5.125.12电泳应用法电泳应用法
175、电泳应用法电泳应用法ionion（t t）ophoreticadministrationophoreticadministration，electrophoreticadministrationelectrophoreticadministration这是一种为了给单个细胞的膜表面加药而采用的这是一种为了给单个细胞的膜表面加药而采用的这是一种为了给单个细胞的膜表面加药而采用的这是一种为了给单个细胞的膜表面加药而采用的方法。在尖端极细（数微米以下）的小玻璃吸量方法。在尖端极细（数微米以下）的小玻璃吸量方法。在尖端极细（数微米以下）的小玻璃吸量方法。在尖端极细（数微米以下）的小玻璃吸量管中加上药液
176、，当给吸量管通电时，药物离子和管中加上药液，当给吸量管通电时，药物离子和管中加上药液，当给吸量管通电时，药物离子和管中加上药液，当给吸量管通电时，药物离子和中性分子便分别通过电泳和电渗透向吸量管尖端中性分子便分别通过电泳和电渗透向吸量管尖端中性分子便分别通过电泳和电渗透向吸量管尖端中性分子便分别通过电泳和电渗透向吸量管尖端移动而被释放出来。移动而被释放出来。移动而被释放出来。移动而被释放出来。如果把吸量管放在离细胞表面几微米的地方，在如果把吸量管放在离细胞表面几微米的地方，在如果把吸量管放在离细胞表面几微米的地方，在如果把吸量管放在离细胞表面几微米的地方，在一定的时间里就会对该细胞施予定量的药
177、物。一定的时间里就会对该细胞施予定量的药物。一定的时间里就会对该细胞施予定量的药物。一定的时间里就会对该细胞施予定量的药物。此法和微电极记录法结合起来，在研究诸如化学此法和微电极记录法结合起来，在研究诸如化学此法和微电极记录法结合起来，在研究诸如化学此法和微电极记录法结合起来，在研究诸如化学递质和各种物质的作用方面是非常有效的。递质和各种物质的作用方面是非常有效的。递质和各种物质的作用方面是非常有效的。递质和各种物质的作用方面是非常有效的。如如如如1 1：肌纤维对乙酰胆碱的感受性只局限于终板部位，：肌纤维对乙酰胆碱的感受性只局限于终板部位，：肌纤维对乙酰胆碱的感受性只局限于终板部位，：肌纤维对
178、乙酰胆碱的感受性只局限于终板部位，用此法能检查出仅仅离开终板用此法能检查出仅仅离开终板用此法能检查出仅仅离开终板用此法能检查出仅仅离开终板5 5微米地方对乙酰胆微米地方对乙酰胆微米地方对乙酰胆微米地方对乙酰胆碱的感受性降到碱的感受性降到碱的感受性降到碱的感受性降到1 11010以下。以下。以下。以下。如如如如2 2：做中枢神经系统的实验是不能直接观察的，所：做中枢神经系统的实验是不能直接观察的，所：做中枢神经系统的实验是不能直接观察的，所：做中枢神经系统的实验是不能直接观察的，所以通常都是把记录电极和吸量管连结起来进行实以通常都是把记录电极和吸量管连结起来进行实以通常都是把记录电极和吸量管连结
179、起来进行实以通常都是把记录电极和吸量管连结起来进行实验。在运用这种方法的过程中，还可以把验。在运用这种方法的过程中，还可以把验。在运用这种方法的过程中，还可以把验。在运用这种方法的过程中，还可以把2525个药个药个药个药液吸量管连结起来，研究液吸量管连结起来，研究液吸量管连结起来，研究液吸量管连结起来，研究2525种药物对同一细胞的种药物对同一细胞的种药物对同一细胞的种药物对同一细胞的效应。效应。效应。效应。5.13差异凝胶电泳差异凝胶电泳将样品在电泳前标记将样品在电泳前标记将样品在电泳前标记将样品在电泳前标记Cy2Cy2、Cy3Cy3和和和和Cy5Cy5这这这这3 3种荧光染料种荧光染料种荧
180、光染料种荧光染料, ,然然然然后将标记后的后将标记后的后将标记后的后将标记后的3 3种样品混合种样品混合种样品混合种样品混合, ,同时在一块胶上进行电泳同时在一块胶上进行电泳同时在一块胶上进行电泳同时在一块胶上进行电泳, ,即即即即为差异凝胶电泳为差异凝胶电泳为差异凝胶电泳为差异凝胶电泳(DIGE)(DIGE)。所得到的所得到的所得到的所得到的2D2D胶图像可使用胶图像可使用胶图像可使用胶图像可使用3 3种不同的激发种不同的激发种不同的激发种不同的激发P P发射过滤器得发射过滤器得发射过滤器得发射过滤器得到不同颜色荧光信号到不同颜色荧光信号到不同颜色荧光信号到不同颜色荧光信号, ,根据这些信号
181、的比例来判断样品之根据这些信号的比例来判断样品之根据这些信号的比例来判断样品之根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异间蛋白质的差异间蛋白质的差异间蛋白质的差异, ,这样可避免在匹配时出现的误差这样可避免在匹配时出现的误差这样可避免在匹配时出现的误差这样可避免在匹配时出现的误差, ,进行定进行定进行定进行定量分析时也不依赖于胶与胶之间的重复性。量分析时也不依赖于胶与胶之间的重复性。量分析时也不依赖于胶与胶之间的重复性。量分析时也不依赖于胶与胶之间的重复性。用于标记的荧光基团在化学结构上相似用于标记的荧光基团在化学结构上相似用于标记的荧光基团在化学结构上相似用于标记的荧光基团在化学结构上相似
182、, ,分子量也基本相分子量也基本相分子量也基本相分子量也基本相同同同同, ,都带有正电荷都带有正电荷都带有正电荷都带有正电荷, ,所以在与赖氨酸残基反应时所以在与赖氨酸残基反应时所以在与赖氨酸残基反应时所以在与赖氨酸残基反应时, ,保证了所保证了所保证了所保证了所有的样品可以移至相同的位置。有的样品可以移至相同的位置。有的样品可以移至相同的位置。有的样品可以移至相同的位置。第六节第六节 电泳测纯技术电泳测纯技术农作物种子品种纯度是种子质量评价的主要农作物种子品种纯度是种子质量评价的主要指标之一，为了解决农作物种子纯度和品指标之一，为了解决农作物种子纯度和品种真实性鉴定问题，近年来大量电泳测纯种
183、真实性鉴定问题，近年来大量电泳测纯技术应用在农作物种子品种纯度鉴定中。技术应用在农作物种子品种纯度鉴定中。种子电泳技术是通过蛋白质或同工酶的分子种子电泳技术是通过蛋白质或同工酶的分子大小和电荷数量或两项同时具有的差异进大小和电荷数量或两项同时具有的差异进行分离，并形成不同电泳图谱而显示种和行分离，并形成不同电泳图谱而显示种和品种之间差异的有效方法。品种之间差异的有效方法。醇溶蛋白质电泳技术、酸溶蛋白质电泳技术、醇溶蛋白质电泳技术、酸溶蛋白质电泳技术、盐溶蛋白质电泳技术、酯酶同工酶电泳技盐溶蛋白质电泳技术、酯酶同工酶电泳技术等技术先后出现，并应用于水稻、玉米、术等技术先后出现，并应用于水稻、玉米
184、、蔬菜、杂交油菜种子纯度鉴定试验，均有蔬菜、杂交油菜种子纯度鉴定试验，均有成功的报导。成功的报导。等电聚焦电泳技术出现后，因其谱带清晰、等电聚焦电泳技术出现后，因其谱带清晰、分辨率高而备受欢迎，但由于其成本高、分辨率高而备受欢迎，但由于其成本高、时间长、技术难度大，难以推广等缺点，时间长、技术难度大，难以推广等缺点，严重制约了它在种子测纯中的应用。严重制约了它在种子测纯中的应用。为了进一步推动电泳技术在种子纯度鉴定中为了进一步推动电泳技术在种子纯度鉴定中的推广应用，国际种子检验协会（的推广应用，国际种子检验协会（ISTA）品种技术委员会于品种技术委员会于1983年成立生化测定工年成立生化测定工
185、作组，致力于总结和发展种子测纯电泳技作组，致力于总结和发展种子测纯电泳技术。术。1986年年ISTA正式颁布了正式颁布了“醇溶蛋白质聚丙醇溶蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定品种的程序）鉴定品种的程序”并列入并列入1993国际种子检验规程国际种子检验规程，我，我国也将其纳入国也将其纳入GB/T3543-1995农作物种子农作物种子检验规程检验规程。19981998年全国农业技术推广服务中心组织北京、山年全国农业技术推广服务中心组织北京、山年全国农业技术推广服务中心组织北京、山年全国农业技术推广服务中心组织北京、山西、吉林等西、吉林等西、吉林等西、吉林等1212家种子检验单
186、位成立项目组，在对家种子检验单位成立项目组，在对家种子检验单位成立项目组，在对家种子检验单位成立项目组，在对现行的各种电泳纯度鉴定方法进行分析的基础上，现行的各种电泳纯度鉴定方法进行分析的基础上，现行的各种电泳纯度鉴定方法进行分析的基础上，现行的各种电泳纯度鉴定方法进行分析的基础上，选定盐溶蛋白电泳、醋酸尿素蛋白电泳和酯酶同选定盐溶蛋白电泳、醋酸尿素蛋白电泳和酯酶同选定盐溶蛋白电泳、醋酸尿素蛋白电泳和酯酶同选定盐溶蛋白电泳、醋酸尿素蛋白电泳和酯酶同工酶电泳三种电泳方法进行攻关研究，最终于工酶电泳三种电泳方法进行攻关研究，最终于工酶电泳三种电泳方法进行攻关研究，最终于工酶电泳三种电泳方法进行攻关
187、研究，最终于20012001年年年年1111月出台了农业行业标准月出台了农业行业标准月出台了农业行业标准月出台了农业行业标准NY/T449NY/T44920012001玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法。 农业部农作物种子质量监督检验测试中心农业部农作物种子质量监督检验测试中心农业部农作物种子质量监督检验测试中心农业部农作物种子质量监督检验测试中心( (太原太原太原太原) )作为全国玉米种子电泳测纯技术项目协作攻关单作为全国玉米种子电泳测纯技术项目协作攻关单作为全国玉米种子电泳测纯技术项目协作攻关单作
188、为全国玉米种子电泳测纯技术项目协作攻关单位之一，已广泛开展了玉米、小麦种子纯度电泳位之一，已广泛开展了玉米、小麦种子纯度电泳位之一，已广泛开展了玉米、小麦种子纯度电泳位之一，已广泛开展了玉米、小麦种子纯度电泳检测工作，年检测样品量约检测工作，年检测样品量约检测工作，年检测样品量约检测工作，年检测样品量约300300份，为政府和企业份，为政府和企业份，为政府和企业份，为政府和企业决策提供了充分的依据。决策提供了充分的依据。决策提供了充分的依据。决策提供了充分的依据。 目前主要应用于农作物品种纯度鉴定的电泳目前主要应用于农作物品种纯度鉴定的电泳方法有四种：蛋白质方法有四种：蛋白质PAGE（小麦、大麦、（小麦、大麦、玉米、大豆、水稻等）、玉米、大豆、水稻等）、SDS-PAGE（玉（玉米、西瓜等）、等电聚焦电泳（玉米、菜米、西瓜等）、等电聚焦电泳（玉米、菜豆、水稻、大豆、蔬菜等）和淀粉凝胶电豆、水稻、大豆、蔬菜等）和淀粉凝胶电泳（玉米等）。泳（玉米等）。
