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1、第四章第四章 质粒载体质粒载体第一节第一节 质粒载体概况质粒载体概况第二节第二节 质粒质粒DNA的复制与拷贝数的控制的复制与拷贝数的控制第三节第三节 质粒载体的构建质粒载体的构建第四节第四节 重要的质粒载体重要的质粒载体第五节第五节 质粒载体的稳定性问题质粒载体的稳定性问题2021/3/101第一第一节 质粒粒载体的概况体的概况一一 质粒的定义、命名、分类、分布质粒的定义、命名、分类、分布二二 质粒的基本生物学特性质粒的基本生物学特性三三 质粒的分离与纯化质粒的分离与纯化2021/3/102 一、质粒的定义、命名、分类、一、质粒的定义、命名、分类、分布分布定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立定义
2、：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外的自我复制并稳定遗传的环于染色体外的自我复制并稳定遗传的环状双链状双链DNA分子。分子。 命名：小写字母命名：小写字母p代表质粒，两个大写字代表质粒，两个大写字母代表发明者，后接实验编号，母代表发明者，后接实验编号，分类：分类：分布：分布：2021/3/1031）根据质粒的性状特征）根据质粒的性状特征 F质粒：质粒：又叫又叫F因子或性质粒因子或性质粒(sexplasmid)。 R质粒：质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数通称抗药性因子。编码有一种或数 种抗菌素抗性基因，种抗菌素抗性基因， Co1质粒质粒 ：产生大肠杆菌素因子。编码产生大肠杆菌素因子。编码
3、 有控制大肠杆菌素合成的基因有控制大肠杆菌素合成的基因2021/3/104质粒分类质粒分类2）根据质粒的传递性3）根据质粒的拷贝数4）根据质粒和细菌的关系4.质粒分布、大小和数目2021/3/105二、质粒的基本特性二、质粒的基本特性 1.寄生性寄生性 2质粒质粒DNA构型构型 3质粒质粒DNA编码的表型编码的表型 4质粒质粒DNA的转移的转移 5质粒质粒DNA的迁移作用的迁移作用 6质粒质粒DNA的复制类型的复制类型 7质粒的不亲和性质粒的不亲和性 8. 其他特性其他特性 2021/3/106质粒的基本生物学特性质粒的基本生物学特性1.寄生性寄生性2质粒质粒DNA (图图41)2021/3/
4、107大肠杆菌质粒分子的结构示意图大肠杆菌质粒分子的结构示意图2021/3/108质粒质粒DNA分子具有三种构型分子具有三种构型 SC构型构型: 共价闭合环形共价闭合环形DNA(cccDNA)， 超螺旋的超螺旋的 SC构型构型；OC构型构型: 开环开环DNA(ocDNA)，OC构型构型； L构型构型: 发生双链断裂而形成线性分子发生双链断裂而形成线性分子 (LDNA)，L构型构型。（图。（图42）2021/3/109环环形形双双链链DNA质质粒粒分分子子的的三三种种构构型型2021/3/1010 质粒质粒DNA的分子构型的分子构型 质粒质粒DNA琼脂糖琼脂糖 凝胶电泳模式图凝胶电泳模式图 (a
5、) (b)OC SCL2021/3/10113.质粒质粒DNA编码的表型编码的表型抗性特征抗性特征、代谢特征代谢特征、修饰寄主生活方式的因子修饰寄主生活方式的因子， 质粒质粒DNA编码的基因有编码的基因有产生抗菌素的基因产生抗菌素的基因、芳香族化合物降解基因芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、产生肠毒糖酵解基因、产生肠毒素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因，以及寄主诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因，以及寄主控制的限制与修饰系统的基因等控制的限制与修饰系统的基因等2021/3/10122021/3/10132021/3
6、/10144质粒质粒DNA的转移的转移(1) 接合型质粒的自我传递接合型质粒的自我传递(2) F质粒质粒(3 )质粒质粒DNA的接合转移的接合转移 细胞交配对的形成细胞交配对的形成 质粒质粒DNA的转移的转移2021/3/1015细菌的接合作用细菌的接合作用 在合适的条件下，雄性细胞和雌性在合适的条件下，雄性细胞和雌性细胞混合培养，形成细胞混合培养，形成 雌雌雄细胞配对过雄细胞配对过程为细菌的接合作用程为细菌的接合作用(conjugation)。 在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的的F因子按滚环复制模式因子按滚环复制模式(rolling circle replica
7、tion model)，2021/3/1016(1) 接合型质粒的自我传递接合型质粒的自我传递 格兰氏阴性细菌的质粒分成接合型和非接合型。格兰氏阴性细菌的质粒分成接合型和非接合型。 接合型的质粒接合型的质粒(conjugative plasmid)，又叫自我转，又叫自我转移的质粒。除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，移的质粒。除了具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 非接合型的质粒非接合型的质粒(nonconjugative plasmid)，不能，不能自我转移是因为没有了控制细胞配对和接合转移的基因。自我
8、转移是因为没有了控制细胞配对和接合转移的基因。2021/3/10172021/3/1018(2)F质粒质粒 又叫又叫F因子因子(ferti1ity factor) ，单拷贝的接合型质，单拷贝的接合型质粒，其分子量约为粒，其分子量约为94kb，共编码，共编码19个转移基因个转移基因(tra)。F质粒有三种存在方式：质粒有三种存在方式： (i)以染色体外环形双链质粒以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，不形式存在，不带有染色体的基因或带有染色体的基因或DNA区段。这样的细胞叫做区段。这样的细胞叫做F+细胞。细胞。(ii)以染色体外环形双链质粒以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时还携形式存在，
9、同时还携带着细菌的染色体基因或带着细菌的染色体基因或DNA区段。这样的细胞叫做区段。这样的细胞叫做F细胞。细胞。 (iii)以线性以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞叫做体上，这样的细胞叫做Hfr细胞细胞(高频重组细胞高频重组细胞)。2021/3/1019大肠杆菌大肠杆菌F因子基因图因子基因图2021/3/1020(3)质粒质粒DNA的接合转移机制的接合转移机制 细胞交配对的形成：细胞交配对的形成： 大肠杆菌大肠杆菌F质粒编质粒编码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立码的特异性性须，在受体细胞的识别以及在确立配对细胞之间的表面接触中起着重要的
10、作用。它配对细胞之间的表面接触中起着重要的作用。它至少需要至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。种以上的转移基因编码产物的参与。 质粒质粒DNA的转移的转移F质粒质粒DNA的转移是从转的转移是从转移起点移起点oriT开始的。开始的。2021/3/1021 大肠杆菌大肠杆菌F质粒转移区结构质粒转移区结构-该区编码着控制细胞接合作用的基因该区编码着控制细胞接合作用的基因2021/3/1022质粒质粒DNA的接合转移及复制的接合转移及复制2021/3/1023 5质粒质粒DNA的迁移作用的迁移作用 共存的接合型质粒引发的非接合型共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。
11、质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用。2021/3/1024F因子带动因子带动Co1E1质粒转移的条件质粒转移的条件2021/3/10256.质粒的复制类型质粒的复制类型两种不同的复制型：两种不同的复制型： “严紧型严紧型” (stringentplasmid)； “松驰型松驰型” (relaxedplasmid)。质粒拷贝数的定义：质粒拷贝数的定义： 每个细菌细胞中所含有的质粒每个细菌细胞中所含有的质粒DNA 分子的数目分子的数目2021/3/10262021/3/10277质粒的不亲和性质粒的不亲和性 (1) 质粒的不亲和性现象质粒的不亲和性现象 (2) 质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的
12、分子基础2021/3/10282021/3/10292021/3/10308.质粒的其他特性质粒的其他特性稳定性：维持一定的拷贝数稳定性：维持一定的拷贝数 同源性：不同的质粒有相同的同源区同源性：不同的质粒有相同的同源区重组性：质粒间、质粒同染色体间重组重组性：质粒间、质粒同染色体间重组消除和恢复性等特性消除和恢复性等特性2021/3/1031三三.质粒质粒DNA的分离与纯化的分离与纯化 1氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 2碱变性法碱变性法 3微量碱变性法微量碱变性法 4影响质粒影响质粒DNA产量的因素产量的因素 (1)寄主菌株的遗传背景寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大
13、小质粒的拷贝数及分子大小2021/3/1032 1氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法2021/3/1033 2碱变性法碱变性法 3微量碱变性法微量碱变性法 4影响质粒影响质粒DNA产量的因素产量的因素 (1) 寄主菌株的遗传背景寄主菌株的遗传背景 (2) 质粒的拷贝数及分子大小质粒的拷贝数及分子大小2021/3/1034分离纯化质粒分离纯化质粒DNA的程序的程序2021/3/1035寄主菌株的遗传背景寄主菌株的遗传背景 使用使用endA基因发生突变的基因发生突变的(endAl)大肠杆大肠杆菌寄主菌株，菌寄主菌株， endA基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去基因突变，使大肠杆菌寄主细胞失去了
14、合成具有功能活性的核酸内切酶了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，增的能力，增进了质粒进了质粒DNA分子的稳定性。分子的稳定性。2021/3/10362021/3/1037第二节第二节 质粒质粒DNA的复制与的复制与 拷贝数的控制拷贝数的控制 1质粒质粒DNA复制的多样性复制的多样性 2ColEl质粒质粒DNA复制的启动复制的启动 3质粒质粒DNA拷贝数的控制拷贝数的控制 (1)天然质粒拷贝数的控制天然质粒拷贝数的控制 (2)杂种质粒拷贝数的控制杂种质粒拷贝数的控制 4质粒复制控制的分子模型质粒复制控制的分子模型 (1)抑制蛋白质稀释模型抑制蛋白质稀释模型 (2)自体阻遏蛋白质模型自体阻遏蛋
15、白质模型2021/3/1038质粒质粒DNA的复制与拷贝数的控制的复制与拷贝数的控制 1质粒质粒DNA复制的多样性复制的多样性 (i) 对寄主酶的依赖性对寄主酶的依赖性 (ii) DNA聚合酶的利用聚合酶的利用 (iii) 复制的方向性复制的方向性 (iv) 复制的终止复制的终止 (v) 复制型复制型2021/3/1039 2ColE1质粒质粒DNA复制的启动复制的启动 3质粒质粒DNA拷贝数的控制拷贝数的控制 (1)天然质粒拷贝数的控制天然质粒拷贝数的控制 (2)杂种质粒拷贝数的控制杂种质粒拷贝数的控制2021/3/1040Co1El、pSCl 01及其杂种质粒及其杂种质粒pSCl34的的D
16、NA复制复制2021/3/1041 4质粒复制控制的分子模型质粒复制控制的分子模型 (1)抑制蛋白质稀释模型抑制蛋白质稀释模型 (2)自体阻遏蛋白质模型自体阻遏蛋白质模型2021/3/1042质粒质粒DNA复制控制的抑制蛋白复制控制的抑制蛋白质稀释模型质稀释模型2021/3/1043质粒质粒DNA复制控制的自体阻遏复制控制的自体阻遏蛋白质模型蛋白质模型2021/3/1044第三节质粒载体的构建第三节质粒载体的构建 1天然质粒用作克隆载体的局限性天然质粒用作克隆载体的局限性 2质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件 3质粒载体的选择记号质粒载体的选择记号 4不同类型的质粒载体不同类
17、型的质粒载体 (1)高拷贝数的质粒载体高拷贝数的质粒载体 (2)低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体 (3)失控的质粒载体失控的质粒载体 (4)插入失活型的质粒载体插入失活型的质粒载体 (5)正选择的质粒载体正选择的质粒载体 (6)表达型的质粒载体表达型的质粒载体2021/3/10451 天然质粒用作克隆载体的局限性天然质粒用作克隆载体的局限性 天然质粒有天然质粒有 Co1E1、RSF2124和和PSCl01等。天然质粒的局限性：如质粒等。天然质粒的局限性：如质粒的分子量较大，拷贝数较低，只有一个的分子量较大，拷贝数较低，只有一个抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技抗菌素抗性基因，无法使用插入失
18、活技术选择重组体分子等。术选择重组体分子等。2021/3/1046 2质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件 (i)具有复制起点具有复制起点(ii)具有可具有可选择的标记选择的标记(iii)具有若干限制酶单一识别位点具有若干限制酶单一识别位点(iv)具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数(v)作为表达载体还有启动子，转录转移信号，作为表达载体还有启动子，转录转移信号，终止子序列等片段。终止子序列等片段。2021/3/10472021/3/10482021/3/10493质粒载体的选择记号质粒载体的选择记号 在基因克隆中采用的质粒载体的选在基因克隆中采用的质粒
19、载体的选择记号，有新陈代谢特性、对大肠杆菌择记号，有新陈代谢特性、对大肠杆菌素素E1 的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗的免疫性，抗菌素抗性等。使用抗菌素抗性记号有四环素抗性、氨苄青霉菌素抗性记号有四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性，卡那霉素抗性等素抗性、链霉素抗性，卡那霉素抗性等2021/3/10502021/3/10512021/3/1052正选择质粒载体正选择质粒载体PKN80的形体图的形体图2021/3/10534不同类型的质粒载体不同类型的质粒载体 (1)高拷贝数的质粒载体高拷贝数的质粒载体 (2)低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体 (3)失控的质粒载体失控的质粒载体 (4)插入失
20、活型的质粒载体插入失活型的质粒载体 (5)正选择的质粒载体正选择的质粒载体 (6)表达型的质粒载体表达型的质粒载体2021/3/10542021/3/1055 复制基因复制基因(replicator) 选择性记号选择性记号 克隆位点克隆位点 基因克隆质粒载体的三种组成基因克隆质粒载体的三种组成2021/3/1056二、构建载体的一般程序二、构建载体的一般程序1.根据原则设计根据原则设计2.分离纯化分离纯化DNA片段片段3.DNA片段连接重组片段连接重组4.重组连接液转化重组连接液转化5.筛选重组转化子筛选重组转化子6.载体的有关载体的有关DNA序列分析序列分析2021/3/1057 第四节重要
21、的质粒载体第四节重要的质粒载体一一.大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体 1pSCl01质粒载体质粒载体 2Co1E1质粒载体质粒载体 3pBR322质粒载体质粒载体 4pUC质粒载体质粒载体 5丧失迁移功能的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体 6.能在体外转录克隆基因的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体 2021/3/1058一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图2021/3/1059二、酵母菌质粒载体（穿梭质二、酵母菌质粒载体（穿梭质粒）粒）酵母酵母2质粒质粒乳酸克鲁维酵母中的线性质粒乳酸克鲁维酵母中的线性质粒大肠杆菌酵母穿梭质粒大肠杆菌酵母穿梭质粒酵
22、母表达型质粒酵母表达型质粒酵母分泌型表达质粒酵母分泌型表达质粒酵母人工染色体酵母人工染色体YAC 2021/3/10601pSCl01质粒载体质粒载体 2021/3/10612021/3/10622CoEEl质粒载体质粒载体 pSCl01质粒作载体克隆非洲爪赡的基因质粒作载体克隆非洲爪赡的基因 2021/3/10632021/3/10642021/3/1065 3pBR322质粒载体质粒载体(1)pBR322质粒载体的构建质粒载体的构建(2)pBR322质粒载体的优点质粒载体的优点 具有较小的分子量具有较小的分子量 具有两种抗菌素抗性基因可供作转具有两种抗菌素抗性基因可供作转 化子的选择记号。
23、化子的选择记号。 具较高的拷贝数具较高的拷贝数 (3)pBR322质粒载体的改良质粒载体的改良2021/3/1066 pBR322质粒载体的构建过程质粒载体的构建过程2021/3/1067pBR322质粒载体的形体图质粒载体的形体图2021/3/1068pBR322质粒载体的结构来源质粒载体的结构来源2021/3/1069pBR322质粒载体质粒载体tet 基因的插入失活效应基因的插入失活效应2021/3/1070pBH20pBR322EcoRIEcoRIKlenowHaeHaeEcoRIEcoRIplacHaeIIIHindIIIBamHIHhalacHindIIIEcoRIligation
24、2021/3/1071pBH20HindIIIBamHIHhalacHindIIIEcoRIEcoRIBamHISamastetinBamHIEcoRIligationpsomIHindIIIEcoRIBamHISamastetinHhalacPstI2021/3/1072lacpsomIHindIIIEcoRIBamHISamastetinHhaPstIpBR322PstIEcoRIAmpEcoRIPstIEcoRIPstIpSomIIPstIEcoRIBamHIAmpSomastetinligation2021/3/1073pSomIIEcoRIBamHIAmpSomastetinPstI
25、EcoRIEcoRILac-gal-3EcoRIEcoRIligationpSomIIILac-galsomastetin2021/3/10744pUC质粒载体质粒载体 (1)pUC质粒载体的结构质粒载体的结构 (2)pUC质粒载体的优点质粒载体的优点第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数 第二，适用于组织化学方法检测重组体第二，适用于组织化学方法检测重组体第三，具有多克隆位点第三，具有多克隆位点MCS区段区段2021/3/1075pUCl8及及PUCl9质粒载体的形体图质粒载体的形体图2021/3/1076丧失迁移功能的丧失迁移功能的pBR327质粒载体的形
26、体图质粒载体的形体图2021/3/10775其它重要的质粒载体其它重要的质粒载体 (1)丧失迁移功能的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体 拥有较高水平的拷贝数拥有较高水平的拷贝数 失去了失去了bom位点，即便在共存的位点，即便在共存的F质粒提质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。用。 (2)能在体外转录克隆基因的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体2021/3/10782021/3/1079pSP64质粒载体的形体图质粒载体的形体图2021/3/1080pSP64与与PSP65质粒载体的多克隆位质粒载体的多克隆位点区的核苷酸序列结构点区的核苷酸序列
27、结构2021/3/1081(3)穿梭质粒载体穿梭质粒载体 穿梭质粒载体穿梭质粒载体(shuttleplasmidvector)，是指一类由，是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，在两种不同的寄主细胞中存活择记号，在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。和复制的质粒载体。 穿梭质粒载体，有大肠杆菌穿梭质粒载体，有大肠杆菌枯草枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体，大肠杆菌芽孢杆菌穿梭质粒载体，大肠杆菌酿酿酒酵母穿梭质粒载体。酒酵母穿梭质粒载体。2021/3/1082大肠杆菌大肠杆菌酿酒酵母穿梭质粒载体酿酒酵母穿梭质粒载体2021/3/10832021/3/1
28、0842021/3/1085第六节质粒载体的稳定性问题第六节质粒载体的稳定性问题1质粒载体不稳定性的类型质粒载体不稳定性的类型 (1)结构的不稳定性结构的不稳定性 (2)分离的不稳定性分离的不稳定性 2影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素 (1)新陈代谢负荷新陈代谢负荷 (2)拷贝数差度拷贝数差度 (3)寄主重组体系寄主重组体系 3随机分配的分子机理随机分配的分子机理 (1)控制环路使质粒拷贝数的限制在最低的水平控制环路使质粒拷贝数的限制在最低的水平 (2)位点特异的重组作用消除质粒的寡聚体位点特异的重组作用消除质粒的寡聚体 (3)调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生调节
29、细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生 (4)大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性 4主动分配的分子机理主动分配的分子机理 (1)分配区的结构与功能分配区的结构与功能 (2)预配对模型预配对模型 (3)二聚体的解离有助于质粒的主动分配二聚体的解离有助于质粒的主动分配 (4)寄主致死功能对质粒稳定性的效应寄主致死功能对质粒稳定性的效应2021/3/1086 1质粒载体不稳定性的类型质粒载体不稳定性的类型 质粒的不稳定性质粒的不稳定性(plasmid instability)，包括，包括分离的不稳定性分离的不稳定性(segrega tionalinstability)和
30、和结构的不稳定性结构的不稳定性(structuralinstability) (1)结构的不稳定性结构的不稳定性 DNA的缺失、插入和重排都是造成质粒载体的缺失、插入和重排都是造成质粒载体结构不稳定性的原因。结构不稳定性的原因。 (2)分离的不稳定性分离的不稳定性 在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，也是导致质粒不稳定性的重要原因。也是导致质粒不稳定性的重要原因。2021/3/10872影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素 (1)新陈代谢负荷对质粒载体稳定性新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应的效应 (2)拷贝数差度对质粒载体稳定性
31、的拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响影响 (3)寄主重组体系对质粒载体稳定性寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应的效应2021/3/1088在细胞分裂过程中质粒的分配方式在细胞分裂过程中质粒的分配方式2021/3/10892021/3/10902021/3/1091 3随机分配的分子机理随机分配的分子机理 (1)通过精巧的控制环路使质粒拷贝数通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平的差度限制在最低的水平 (2)通过位点特异的重组作用消除天然质通过位点特异的重组作用消除天然质粒的寡聚体粒的寡聚体 (3)通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生细胞的产生
32、(4)大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定大肠杆菌素的合成增进了质粒的稳定性性2021/3/10922021/3/10934主动分配的分子机理主动分配的分子机理 (1)分配区的结构与功能分配区的结构与功能 (2)预配对模型预配对模型 (3)二聚体的解离有助于质粒的主动分配二聚体的解离有助于质粒的主动分配 (4)寄主致死功能对质粒稳定性的效应寄主致死功能对质粒稳定性的效应2021/3/10942021/3/10952021/3/1096R1质粒质粒parB(hoksok)体系对分裂后细体系对分裂后细胞的致死效应胞的致死效应2021/3/1097思考题一思考题一1.基因工程中常用的载体主要有哪几类？2
33、.质粒DNA的三种构型是什么？它们在琼脂糖凝胶中的迁移速度有什么区别？3.从基因工程的安全性考虑有利的质粒载体是接合型还是非接合型质粒？为什么？4.两个质粒基因不能稳定的共存在于一个细胞，是什么原因？5.什么是质粒的不相容性？相容性？机制？6.质粒如何维持在细胞中的稳定性？7.最简单的基因克隆载体至少具备哪三个条件？ 8.colE1质粒DNA复制启动主要涉及到哪几种酶和哪种蛋白因子？ 9.复制子由哪三部分组成？2021/3/1098思考题二思考题二10. pBR322的构建过程通过哪两个途径？它的复制子、四环素及氨卡青霉素抗性基因分别来源什么质粒？ 11.pUC质粒是通过哪两种质粒改造而来的？它的复制子和Ampr抗性标记克隆位点分别来自于什么载体？ 12.通过生长激素释放基因的克隆与表达载体构建得到什么启示？ 13.基因工程中真正天然的质粒有哪几个？ 14.YAC具有什么结构？为什么克隆大片段时它具有优越性？ 15.2质粒具有什么特性可使它配对形成大小两个哑铃结构？ 16.什么叫穿梭质粒？ 17.什么是质粒的带动转移？ 18.酵母质粒载体主要有哪几种类型？ 19.质粒不稳定主要有哪两类？2021/3/1099
