第八章酶免疫技术

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1、免疫学检验免疫学检验吴倩讲师卫生检验系公共卫生学院南京医科大学025-第一节酶免疫技术的原理第一节酶免疫技术的原理第二节第二节 酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类第三节第三节 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验第四节第四节 固相酶免疫测定的技术要点固相酶免疫测定的技术要点第五节第五节 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术第六节第六节 其他酶免疫技术其他酶免疫技术第七节第七节 酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用第八章第八章 酶免疫技术酶免疫技术第一节第一节 酶免疫技术的原理酶免疫技术的原理o主要试剂主要试剂: : 酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原o酶标物特点：酶标物特点： 免疫学活性免疫学活性 酶

2、对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶促催化反应的高敏感性酶促催化反应的高敏感性原理及特点原理及特点特点：特点：灵敏度高、特异性强、灵敏度高、特异性强、准确性好准确性好酶标记试剂能够较长时酶标记试剂能够较长时间保持稳定间保持稳定操作简便、对环境没有操作简便、对环境没有污染。污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的衍生出适用范围更广的新方法新方法。原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分

3、析定性或定量的测定分析 原理及特点原理及特点第二节酶免疫技术分类第二节酶免疫技术分类 酶酶免免疫疫技技术术酶酶免疫组化免疫组化酶酶免疫测定免疫测定均均 相相异相异相固相酶固相酶免疫测定免疫测定液相液相酶免疫测定酶免疫测定组织切片中的抗原抗体反应组织切片中的抗原抗体反应 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量(ELISA)(ELISA)用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过

4、测定标记酶的活性和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。的改变，而确定抗原或抗体的含量。Ag+Ab-E Ag-Ab-E+?原理原理一、均相酶免疫测定一、均相酶免疫测定最具最具代表性的两种技术代表性的两种技术酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定EMITEMIT示意图示意图CEDIACEDIA示意图示意图分类：分类：液相酶免疫测定液

5、相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（验（ELISAELISA） 是目前最为常用的固相酶免疫测定是目前最为常用的固相酶免疫测定与均相与均相不同不同之处之处需分离游离与结合的酶标记物需分离游离与结合的酶标记物二、异相酶免疫测定二、异相酶免疫测定第三节酶联免疫吸附试验第三节酶联免疫吸附试验 三个部分： 免疫反应 酶与底物反应 检测方法的建立ELISAELISA酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）高纯度的抗原、高亲和力的抗体高活性、高纯度

6、的标记用酶有效的交联方法制备高质量的酶标记物选用适宜的酶/底物系统分离结合与游离标记物的方法建立操作步骤以及研究自动化测定技术底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234一、基本原理一、基本原理固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物酶标记物 酶反应的底物酶反应的底物 三个必要试剂三个必要试剂 二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理双抗体夹心法双抗体夹心法（double antibody

7、sandwich-ELISAdouble antibody sandwich-ELISA）方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色加底物显色应用：应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定( (乙型肝炎表乙型肝炎表面抗原面抗原HBsAgHBsAg),),不能用于半抗原等小分子的测定。不能用于半抗原等小分子的测定。ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE EELISAELISA检测抗体的方法检

8、测抗体的方法捕获法捕获法原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标记特加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体异性抗原的抗体 底物显色底物显色 应用：应用：病原体急性感染诊断中的病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗体型抗体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-HAV-IgMIgM抗体抗体 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-HBc-IgMIgM抗体抗体捕获法原理捕获法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测

9、物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加特异性抗原，不能与非原，不能与非特异性特异性IgMIgM结合结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体无抗原结合，无抗原结合，加底物不显色加底物不显色第第四四节节 固相酶免疫测定的技术要点固相酶免疫测定的技术要点试剂的准备试剂的准备反应条件的选择

10、反应条件的选择操作的标准化操作的标准化一、试剂的准备o（一）固相载体（一）固相载体 聚苯乙烯聚苯乙烯 特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性 形状：小试管、小珠、微量形状：小试管、小珠、微量ELISA板板 使用前检测其性能使用前检测其性能o（二）抗原和抗体（二）抗原和抗体 高纯度的高纯度的Ag 高效价的高效价的Ab 一、试剂的准备o（三）酶和底物的选择（三）酶和底物的选择 标记酶的要求：标记酶的要求： 活性高活性高 性质稳定性质稳定 专一性强专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行方法敏感，重

11、复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm （辅基）辅基）与与275nm275nm（主酶）主酶） ODOD值之比值之比 RZRZ值与酶活性无关，值与酶活性无关，酶活性单位比酶活性单位比RZRZ值值更为重要更为重要 ELISAELISA中应用最为广中应用最为广泛的标记用酶泛的标记用酶 常用酶常用酶HRPHRP的底物的底物 DHDH2 2

12、+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，底物有多种习惯上被称为底物，底物有多种 H H2 2O O2 2为受氢体，为受氢体，HRPHRP对受氢体的专一性很高对受氢体的专一性很高（小分子醇和尿素的过氧化物）（小分子醇和尿素的过氧化物） 常用底物常用底物HRPHRP的常见底物的常见底物 邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSA

13、BTS常用底物常用底物OPDOPD反应后显橙黄反应后显橙黄色，加酸终止反色，加酸终止反应后呈棕黄色，应后呈棕黄色，测定波长测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，致癌性。TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后，加酸终止反应后变为黄色变为黄色, ,测定波长测定波长450nm 450nm ，稳定，无稳定，无致癌性，致癌性，ELISAELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。 HRPHRP的常见底物的常见底物 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（ALPALP） 菌源性菌源性ALP ALP 肠粘膜肠粘膜ALPALP( (小牛小牛) ) 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal

14、） 常用酶常用酶大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌 ALPALP的的底物底物 -Gal-Gal的底物的底物 对对- -硝基苯磷酸酯（硝基苯磷酸酯（ pNPPpNPP ）4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半- -乳糖苷（乳糖苷（ 4MUG 4MUG ）经经ALPALP作用后的产物为黄色对作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm405 nm。 酶作用后，生成高强度酶作用后，生成高强度荧光物荧光物 ，用荧光计，用荧光计 测测量。量。常用底物常用底物二、酶标记抗体或抗原的方法酶免疫技术的核心组成部分酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物酶结合物（conjugateconj

15、ugate）酶酶标记物标记物 通过化学反应或免通过化学反应或免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 抗原要求纯度高，抗原性完整抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。产，易纯化。 制备方法要求制备方法要求制备方法制备方法过碘酸钠法（直接法）过碘酸钠法（直接法）常用于常用于HRPHRP标记抗体或抗原标记抗体或抗原 戊二醛交戊二醛交联法联法戊二醛交戊二醛交联法联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与与HRP

16、HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。步法高，酶标记物质量较均一。 纯化纯化标记完成后应除去反应液中的游离酶、标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法：常用的纯化方法：葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（SephadexSephade

17、x）G-200/G-150G-200/G-150过过柱层析纯化柱层析纯化50%50%饱和硫酸铵沉淀提纯饱和硫酸铵沉淀提纯亲和层析效果更好（亲和层析效果更好（SPA-SPA-IgG;ConAIgG;ConA-HRP-HRP）二、酶标记物的纯化和鉴定鉴定鉴定质量鉴定（质量鉴定（ELISAELISA法直接测定）法直接测定）HRPHRP标记标记IgGIgG的酶标记率（戊二醛法）的酶标记率（戊二醛法）酶结合量（酶结合量（mg/mlmg/ml）IgGIgG量（量（mg/mlmg/ml）HRP/ HRP/ IgGIgG摩尔比摩尔比酶的标记率酶的标记率四、最适工作浓度的选择(棋盘法)10+1:10001.17

18、10+1:10000.1510- 1:10000.091.0+ 1:100021.0+ 1:10000.261.0- 1:10000.120.1+ 1:10000.420.1+ 1:10000.140.1- 1:10000.1110+1:50000.4610+1:50000.0310- 1:500001.0+ 1:50000.91.0+ 1:50000.121.0- 1:50000.010.1+ 1:50000.120.1+ 1:50000.040.1- 1:50000.0210+1:100000.1210+1:10000010-1:1000001.0+ 1:100000.221.0+ 1:1

19、00000.011.0-1:1000000.1+ 1:100000.030.1+ 1:1000000.1-1:100000五、测定方法的标准化o包被o加样o洗涤o孵育o结果判定o理想coating：吸附尽可能多的Ag或Ab；吸附牢固；非特异性吸附较少o包被机制 1、物理性吸附（被动的） 2、共价交联（戊二醛，标准化）o影响包被的因素 1、包被物质的性质及其浓度 2、包被缓冲溶液的pH及离子强度 3、包被温度和时间o包被物质的性质及其浓度 聚苯乙烯吸附抗原效果好 聚乙烯吸附抗体效果好 浓度过高引起前带现象 浓度过低引起非特异性吸附(BSA封闭)o包被缓冲溶液的pH及离子强度 相对低的离子强度有利

20、于蛋白质分子吸附固相表面o包被温度和时间 置4冰箱过夜，或37 孵育2ho加样 加样量准确 加样位置 不产生气泡o洗涤 目的 1、洗去未结合的物质 2、洗去非特异性吸附 要求 1、每孔充满液体 2、去净洗涤液（Tween20） 3、冲洗次数和浸泡时间足够 4、具有传染性样品必须采用全自动冲洗o孵育 定义：定义：要使抗原抗体反应和酶催化反应顺利进行，需要合适的pH和适当离子强度的基质液，保持一定的温度，并作用一定时间，整个过程称为孵育或温育。 方法：方法：干式 湿氏 推荐温度：推荐温度：37 增强作用增强作用:聚乙二醇 反应时间反应时间:以阳性标本的吸光度值达到1.0时为反应终点o结果判定 1、

21、吸光度法（A） 2、比例法(A/A0) 3、滴度法（倍比稀释样品） 4、吸光度直接表示阳性的程度（均一化） 5、标准曲线法第第五五节节 酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry technique)o定义 在一定条件下，应用酶标抗体或抗原与细胞或普通组织切片中抗原或抗体反应，酶与底物作用形成有色沉淀物或产物电子密度发生改变，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原或抗体的分布和性质；经图像分析也可达到定量的目的。o种类 1、标记抗体免疫组织化学技术 2、非标记抗体酶免疫组织化学技术 3、酶标记免疫电镜技术o1、标记抗体免疫组织化

22、学技术第第六六节节 其他酶免疫技术其他酶免疫技术o免疫印记法（immunoblotting test）其他酶免疫技术其他酶免疫技术o生物素-亲和素（BSA）-酶联免疫吸附试验 生物素（biotin）-亲和素（avidin） 亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的亲和力至少高1万倍，且具有高度特异性和稳定性。其他酶免疫技术其他酶免疫技术第第七七节节 酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用oELISA在预防医学、临床医学的应用病原体及其抗体的检测（乙肝两对半）蛋白质的检测非肽类激素的检测药物的检测尿中毒品的检测酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用oELISA在食品检测中的应用食品中微生物的检测食品毒

23、素的检测（黄曲霉毒素）食品中残留农药的检测（除草剂、杀菌剂和杀虫剂）食品中残留抗生素的检测（氯霉素、磺胺类、呋喃类、喹诺酮类）酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用oELISA在转基因食品检测中的应用（PCR-ELISA方法）DNA检测蛋白质检测酶免疫测定的应用酶免疫测定的应用1 1酶免疫技术的要点？酶免疫技术的要点？2 2酶联免疫吸附试验的原理（酶联免疫吸附试验的原理（ELISAELISA）？）？3 3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4 4常用的底物有哪几类？特点？常用的底物有哪几类？特点？5 5常用的酶有哪几类？特点？常用的酶有哪几类？特点？6 6

24、何谓包被与封闭？其作用？何谓包被与封闭？其作用？7 7对酶免疫技术的应用评价如何？对酶免疫技术的应用评价如何？思考题思考题o酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的特异性反应完成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可成后，通过酶对底物的作用进一步提高敏感性。酶免疫技术可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两大类, ,后者根据抗原抗后者根据抗原抗体反应后是否需要分离结合与游离的酶

25、标记物而分为均相和非体反应后是否需要分离结合与游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型。均相两种类型。o均相酶免疫测定主要用于小分子物质和半抗原的测定，非均相酶均相酶免疫测定主要用于小分子物质和半抗原的测定，非均相酶免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免免疫测定根据是否使用固相支持物，又可分为液相和固相酶免疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体疫测定两种类型。最常用的是以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（的酶联免疫吸附试验（ELISAELISA）, ,其原理可以有夹心法、竞争法、其原理可以有夹心法、竞争法、间接法和捕获法等。间接法和捕获法等。小小 结结