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1、石蜡制片技术: :三、实验原理三、实验原理 石蜡切片的原理是利用石蜡的熔点是58C左右和对不同化学物质溶解性不同，经过透明剂，在石蜡熔点以上，将石蜡浸透进入植物组织和细胞之间，当温度降低到石蜡熔点以下时，凝结成固态固定组织和细胞以利于切片。: :一、石蜡制片技术的优点石蜡切片法是一种最常用的显微制片方法，它的优点是可切出大量极薄的延续切片，且本钱教低。 石蜡切片技术顺应细胞程度的研讨。 : :二、实验目的二、实验目的 了解石蜡切片的根本原理，掌握石蜡切片的根本过程和制造方法，学会制造石蜡切片中一些常用试剂的配制方法，认识石蜡切片的适用范围。: :四、实验器材、试剂四、实验器材、试剂 手摇切片机
2、、展片台、温箱、镊子、解剖刀、酒精灯、盖玻片、指形管等。番红染色液、固绿染色液、FAA固定液、二甲苯、各级酒精、石蜡、加拿大树胶、蛋白胶等: :五、石蜡制片的操作流程五、石蜡制片的操作流程 一一 取材取材二固定和抽气二固定和抽气三脱水、透明及渗蜡三脱水、透明及渗蜡四四 包埋包埋五修块五修块 、切片和烫片、切片和烫片六烘干六烘干七脱蜡、染色、脱水、透明七脱蜡、染色、脱水、透明 八封片八封片 : :一取材 选取经过本人设计实验的对照和处置的资选取经过本人设计实验的对照和处置的资料，根据不同的要求，从植物体上选取有代料，根据不同的要求，从植物体上选取有代表性的器官或组织，取材力求新颖，以防止表性的器
3、官或组织，取材力求新颖，以防止组织发生死后变化。取材时要用快刀切割资组织发生死后变化。取材时要用快刀切割资料，不能挤压，所取的资料不宜过大，在不料，不能挤压，所取的资料不宜过大，在不影响察看的情况下应尽能够小些，这样有利影响察看的情况下应尽能够小些，这样有利于药剂透入组织和细胞中。于药剂透入组织和细胞中。: :二固定和抽气二固定和抽气 一将切取的植物资料放入固定液中，使其细胞原生质在极短的时间内停顿生命活动，尽量坚持细胞原有的细微构造，也可使某些柔软的资料适当硬化，便于切片。资料的长和宽最大不超越1cm。固定液为资料的20倍左右。固定时间24小时，其间要放入抽真空机中抽气15-30分钟至资料完
4、全沉浸在固定液下面。并用铅笔写好标签。: :固定剂的种类 1.1.福福尔马尔马林林醋酸醋酸酒精固定酒精固定剂剂FAAFAA70%70%或或50%50%酒精酒精 90CC 90CC冰醋酸冰醋酸 5CC 5CC福福尔马尔马林林 5CC 5CC2.2.醋酸醋酸酒精固定酒精固定剂剂卡卡诺诺固定固定剂剂 此固定此固定剂剂的主要成分是冰醋酸和的主要成分是冰醋酸和纯纯酒精，也可参与酒精，也可参与氯氯仿。仿。 纯纯酒精酒精95%95%酒精酒精 3 3份份 冰醋酸冰醋酸 1 1份份: :三脱水、透明及渗蜡三脱水、透明及渗蜡将资料从固定液中取出后，其详细流程如下：A：酒精 X：二甲苯 70%A2h85%A2h95
5、%A2h100%A2h100%A2h3/4A+1/4X2h1/2A+1/2X2-3h、过夜1/4A+3/4X2hX2h1/2X+1/2蜡过夜渗蜡12h渗蜡22h渗蜡32h : :四 包埋 将渗蜡后的资料和石蜡一同倒入小纸盒，用加热的镊子迅速把资料按需求的切面和一定的间隔陈列整齐并使其竖直，倒入纯蜡进展包埋。略微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固。 : :五修块五修块 、切片和烫片、切片和烫片 1 1、 修修块块 将包埋好的将包埋好的资资料切割成小料切割成小块块，每个小，每个小块块包含一个包含一个资资料，并修成梯形，切面在梯形的上部。留意上部矩形料，并修成梯形，切面在梯形的上部。留意上部矩形对边对
6、边平行，梯形底部用平行，梯形底部用烧热烧热的蜡将其固定在木的蜡将其固定在木块块上。上。 2 2、 切片切片 将粘有蜡将粘有蜡块块的小木的小木块块至于切片机上，至于切片机上，调调整切距到整切距到适当大小，适当大小，转动调转动调理器条切片厚度理器条切片厚度12m12m左右左右进进展切片。留展切片。留意切片意切片时时要一手要一手转动转动切片机，另一手切片机，另一手执执毛笔将切下来的片子毛笔将切下来的片子摊摊开以构成一开以构成一长长条蜡条蜡带带。 3 3、 烫烫片片 滴一滴蛋白胶于干滴一滴蛋白胶于干净载净载玻片中央，用干玻片中央，用干净净的手指的手指涂抹均匀后，滴上清水，将取下的蜡涂抹均匀后，滴上清水
7、，将取下的蜡带带切成小段置于切成小段置于载载玻片玻片上放上两至三段，然后将上放上两至三段，然后将载载玻片放到展片台上玻片放到展片台上( (坚坚持持4040) )烫烫片。片。 待充分待充分烫烫平后用吸水平后用吸水纸纸吸去多余的水。吸去多余的水。 : :六烘干六烘干 将烫好的片子自然烘干，或45烤片箱枯燥12天，留意防尘。 : :七脱蜡、染色、脱水、七脱蜡、染色、脱水、透明透明将玻片将玻片标标本放于本放于100%X100%X15-30min)100%X(1-15-30min)100%X(1-2min)50%X+50%A(1-2min)100%A(1-2min)50%X+50%A(1-2min)10
8、0%A(1-2min)95%A(1-2min)85%A(1-2min)2min)95%A(1-2min)85%A(1-2min)番番红红85%A85%A配制配制(2-4h)85%A(3-5s(2-4h)85%A(3-5s95%A(3-5s95%A(3-5s固固绿绿100%A100%A配制配制(30s)95%A(1-(30s)95%A(1-2min)100%A(1-2min)100%A(1-2min2min)100%A(1-2min)100%A(1-2min50%X+50%A(1-2min)100%X(1-50%X+50%A(1-2min)100%X(1-2min)100%X(1-2min)2m
9、in)100%X(1-2min)留意番留意番红红染色染色时间时间要要长长些至少些至少3h3h以上，随后的两以上，随后的两次次经过经过酒精的酒精的时间时间都都应应很短，以免洗掉染上的番很短，以免洗掉染上的番红红，固固绿绿的染色的染色时间时间大大约约在在20-30s,20-30s,其他各步的其他各步的时间时间大大约约1 1至至2 2分分钟钟，均要，均要视详细视详细情况而定。情况而定。: :番红固绿染色法 此法运用甚广，是研讨植物普通形状构造的重要方法。番红为碱性染料，常用的是混合物二甲基酚番红，三甲基酚番红，可将细胞核、染色体、核仁等染成红色，对木化、栓化、角化的细胞壁也有很好的染色效果。固绿为酸
10、性染料，能对细胞质、纤维素细胞壁染色。番红与固绿对染，效果很好。 : :番红染液配法配方配方配方配方药药品品品品I IIIII III III IV IV番番番番红红1g1g1g1g1g1g1g1g蒸蒸蒸蒸馏馏水水水水100cc100cc5%5%酒精酒精酒精酒精95cc95cc70%70%酒精酒精酒精酒精100cc100cc95cc95cc苯胺油苯胺油苯胺油苯胺油5cc5cc5cc5cc: : 固绿染液配法 配配配配方方方方药药品品品品 I I II II III III IV IV V V VI VI固固固固绿绿0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-1g0.5-
11、1g0.5-1g0.3-0.3-0.5g0.5g1-2g1-2g95%95%酒精酒精酒精酒精100cc100cc无水无水无水无水酒精酒精酒精酒精100cc100cc50-50-60cc60cc95cc95cc80cc80cc苯胺苯胺苯胺苯胺油油油油5cc5cc20cc20cc丁香丁香丁香丁香油油油油100cc100cc40-40-50cc50cc: :铁矾苏木精染色法 次法在细胞学及胚胎学上广为运用，是显示细胞普通构造及细胞分裂的良好染色方法，它能将细胞核、细胞分裂时的染色体染成蓝黑色，且能长久坚持颜色。苏木精C16H14O6不能直接染色，必需氧化成熟为氧化苏木精，同时还要经过媒剂的作用，才干
12、染上颜色，所以这种染色法必需配制两种溶液。: :染液的配制甲液：4%铁矾硫酸铁胺水溶液，这是一种媒染剂，冲淡成2%的浓度时，又可作分色剂运用，临用时配用较好。乙液：苏木精10g+无水酒精100CC，这是母液，要经12个月才干氧化成熟，染色时，将此母液5CC参与100CC蒸馏水，冲淡运用。: :染色过程玻片资料经脱蜡、各级酒精、蒸馏水，进入4%铁矾媒染054小时，水洗约5分钟，换蒸馏水2次，每次23分钟，然后05%苏木精染色14小时或更长，蒸馏水换洗数次，再用2%铁矾分色，普通大约半分钟至数分钟。在分色时，要随时在低倍镜下检查，直到称心为止。然后，用水冲洗30分钟，最后换蒸馏水数分钟。: :八封片、枯燥、贴标签八封片、枯燥、贴标签 1、 从二甲苯中取出然好色的片子，用中性树胶进展封片。留意封片用的该玻片要清洁，封片时要留意不要产生气泡。 2 、普通一个月以上，树胶才干枯燥，如加热烤片，可缩短干片时间，在载玻片的一端贴上标签，注明资料称号、制片时间等，最后将制成后的玻片置于切片盒中保管。 : :六、思索题为什么固定资料时最好抽气，资料中有气泡对切片有何影响？ 为什么制造营养器官的石蜡切片常用番红固绿染色，而制造生殖器官的切片那么多用苏木精固绿染色？ : :
