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1、SDS-PAGE凝胶电泳及凝胶电泳及Westernblot检测技术检测技术SDS-PAGE凝凝胶胶电电泳泳实验原理实验原理实验步骤实验步骤本卷须知本卷须知电印迹电印迹SDS-PAGESDS-PAGE的优点的优点SDS-PAGESDS-PAGE的缺陷的缺陷实验常见问题及处置实验常见问题及处置小技巧小技巧实验原理实验原理l背景背景l根本原理根本原理l分类分类l分别范围分别范围l实验中各成分作用实验中各成分作用背景背景l1967年由Shapiro建立。l1969年由Weber和Osborn进一步完善。l 他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中参与离子去污剂SDS以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分
2、子量的大小,电荷要素可以忽视.丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-亚亚甲基双丙甲基双丙烯酰烯酰胺胺聚丙聚丙烯酰胺胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)过硫酸胺硫酸胺(AP)(AP)激活作用激活作用激活作用激活作用共聚合共聚合根本原理之一根本原理之一l阴离子去阴离子去污剂SDS破坏蛋白破坏蛋白质分子分子之之间及与其它物及与其它物质分子之分子之间的非共的非共价价键，使蛋白量，使蛋白量变性而改性而改动其原有其原有的构象，并同蛋白的构象，并同蛋白质分子充分分子充分结合合构成构成带负电荷的蛋白荷的蛋白质-SDS复合物。复合物。l强复原复原剂巯基乙醇如今常用二基乙醇如今常用二巯基基苏糖醇，糖醇，DTT
3、翻开蛋白翻开蛋白质分子分子内的二硫内的二硫键使使这种种结合更加充分。合更加充分。根本原理之二根本原理之二l结合了合了SDSSDS的蛋白的蛋白质在水溶液中的外形在水溶液中的外形类似于似于长椭圆棒，不同的蛋白棒，不同的蛋白质-SDS-SDS复合物其复合物其椭圆棒的短棒的短轴长度恒定，而度恒定，而长轴的的长度那么与蛋白度那么与蛋白质分子量的大分子量的大小成正比。小成正比。l这样的蛋白的蛋白质-SDS-SDS复合物在复合物在电场作用下，其迁移率作用下，其迁移率便不再受蛋白便不再受蛋白质原有的原有的净电荷及外形等要素的影荷及外形等要素的影响，而主要取决于其分子量大小响，而主要取决于其分子量大小这一要素。
4、根据一要素。根据这一特点，就可以将各蛋白一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分分按分子量大小分开。开。分类分类 PAGE根据其有无浓缩效应，分为延续系统和不延续系统两大类. 延续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。电电泳槽泳槽泳槽泳槽不延续系统不延续系统l不延续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不延续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其分别条带明晰度及分辨率均较前者佳。浓缩胶浓缩胶l浓缩胶的作用是有堆胶的作用是有堆积作用，凝胶作用，凝胶浓度度较小，小，孔径孔径较大，把大，把较稀的稀的
5、样品加在品加在浓缩胶上，胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的至一个狭窄的区区带。l当当样品液和品液和浓缩胶胶选Tris/HClTris/HCl缓冲液，冲液，电级液液选Tris/Tris/甘氨酸。甘氨酸。电泳开泳开场后，后，HClHCl解离成解离成氯离离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一同向正极挪荷，因此一同向正极挪动，其中，其中氯离离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。浓缩胶浓缩胶l电泳开场时氯离子泳动率最大，超越蛋白，因此在后面构成低电导区，而电场强度与低
6、电导区成反比，因此产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速挪动，构成以稳定的界面，使蛋白聚集在挪动界面附近，浓缩成一中间层。l Gly- Pro- Cl-+分别胶分别胶l孔径较小孔径较小, ,经过选择适宜的凝胶浓度经过选择适宜的凝胶浓度, ,可以使样品很好的分别可以使样品很好的分别. .当样品当样品进入分别胶进入分别胶,pH,pH,凝胶孔径改动凝胶孔径改动, ,使慢离子的泳动率变大使慢离子的泳动率变大, ,超越蛋白超越蛋白, ,高高强度电厂消逝强度电厂消逝. .因此蛋白在均一的因此蛋白在均一的pH,pH,和电场强度下经过分别胶和电场强度下经过分别胶. .假设假设蛋白质分子量不同蛋白质分子量
7、不同, ,经过分别胶遭到的阻力不同，泳动率也不同经过分别胶遭到的阻力不同，泳动率也不同, ,因此因此可以根据蛋白的分子量不同而分开可以根据蛋白的分子量不同而分开. .l Pro1- Pro2 Gly- Cl-Pro1- Pro2 Gly- Cl-+ 积层胶分别胶 凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分别胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便构成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不延续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只需极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点普通在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，
8、这3种离子同向阳极挪动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。浓缩效应浓缩效应电泳开场后，快离子在前，在它后面构成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速挪动。在快离子和慢离子之间构成一个稳定而不断向阳极挪动的界面。由于蛋白质的有效挪动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 样品进入分别胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超越蛋白质，高电压梯度随即消
9、逝。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而构成一条条区带。分别胶内的电荷分别胶内的电荷效应效应 与与SDSSDS结合的蛋白质的构型也发生变化，结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中在水溶液中SDS-SDS-蛋白质复合物都具有类似的蛋白质复合物都具有类似的外形，使得外形，使得SDS-PAGESDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与外形的影响。因此，各种白质原有电荷与外形的影响。因此，各种SDS-SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。反映了蛋
10、白质分子量的不同。 但在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离子外表活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超越了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别； 此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位留意SDS结合蛋白质的前提条件是有复原剂DTT，就能更好结合，这是由于SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。lSDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分别范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺构成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所添加，并构成SDS蛋白质复合物必需
11、经过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺 比率的添加而变小，比率接近 1：20 时孔径到达最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺为1：29 配制，实验阐明它能分别大小相差只需3% 的蛋白质。分别范围分别范围l凝凝胶胶的的筛筛分分特特性性取取决决于于它它的的孔孔径径，而而孔孔径径又又是是灌灌胶胶时时所所用用丙丙烯烯酰酰胺胺和和双双丙丙烯烯酰酰胺胺绝绝对对浓浓度度的的函函数数。用用5 515%15%的的丙丙烯烯酰酰胺胺所所灌灌制制凝凝胶胶的的线线性性分分别别范范围围如下表：如下表：丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度% %线性分性分别范范围kDkD1512431016687.53
12、6945.057212双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29电转移电转移 经过电泳分别后蛋白质在凝胶中难于进展进一步分析 如氨基酸序列分析、氨基酸组成分析等，需将它们转移至有一定韧性并且化学惰性的高分子支持物上,目前最常用的是PVDF(聚偏氟乙烯)一类膜，其中Perkin-Elmer公司提供的ProBlott膜具有吸附蛋白质才干强的特性，特别适宜于氨基酸组成分析和序列分析。 下面引见两种电印迹方法。水浴式电印迹方法水浴式电印迹方法l采用采用Bio-Rad公司的公司的Mini-ProteanIII系列系列l1将转移膜剪成和凝胶一样大小。将转移膜剪成和凝胶一样大小。l2将将
13、PVDF膜在膜在100%甲醇中均匀润湿约甲醇中均匀润湿约2-3秒秒，再在水中漂洗，再在水中漂洗2-3min，然后在转移缓冲液中，然后在转移缓冲液中平衡至少平衡至少15min。l3电泳终了后，将凝胶在转移缓冲液中平衡电泳终了后，将凝胶在转移缓冲液中平衡5min。l4将凝胶置于也在缓冲液中浸泡过的将凝胶置于也在缓冲液中浸泡过的Whatman3mm滤纸上，然后将滤纸上，然后将PVDF膜覆于膜覆于凝胶上，再盖上一张浸湿的滤纸防止在每一凝胶上，再盖上一张浸湿的滤纸防止在每一层间留有气泡，最后将它们一同夹入转移盒层间留有气泡，最后将它们一同夹入转移盒中。中。l5根据需求转移的蛋白质的分子量设定恒定根据需求
14、转移的蛋白质的分子量设定恒定任务电流及转移时间，普通分子量任务电流及转移时间，普通分子量20KD的蛋的蛋白质从白质从0.5mm厚的凝胶上转移可设电压厚的凝胶上转移可设电压50V，时间约需时间约需10-30min，分子量大的蛋白质转移需，分子量大的蛋白质转移需求的时间相应添加，但是在实验中可以发现，求的时间相应添加，但是在实验中可以发现，蛋白质的分子量蛋白质的分子量100KD时，即使转移时，即使转移45-60min膜上吸附的蛋白质的量仍不理想。另外，膜上吸附的蛋白质的量仍不理想。另外，假设用假设用Tris-甘氨酸缓冲液，电压为甘氨酸缓冲液，电压为40V，需，需1-4h。l6转移终了后将膜去下在超
15、纯水中漂洗转移终了后将膜去下在超纯水中漂洗23次，每次次，每次5min，以洗去膜上沾有的在电泳和电印迹过程中运用，以洗去膜上沾有的在电泳和电印迹过程中运用的缓冲液。的缓冲液。l假设用做氨基酸分析：转移缓冲液首选假设用做氨基酸分析：转移缓冲液首选CAPS，这是，这是由于由于CAPS对以后的氨基酸组成分析、蛋白质序列测定对以后的氨基酸组成分析、蛋白质序列测定影响小，另外影响小，另外CAPS在在pH11时有很好的缓冲才干，并时有很好的缓冲才干，并保证绝大多数蛋白质都带负电荷向正极挪动。保证绝大多数蛋白质都带负电荷向正极挪动。lWesternblot：通常用：通常用Tris-甘氨酸系统也可以进展电印甘
16、氨酸系统也可以进展电印迹，但转移终了后需对膜漂洗更完全以去除能够沾附迹，但转移终了后需对膜漂洗更完全以去除能够沾附的缓冲液离子及其他杂质。的缓冲液离子及其他杂质。半干式转移半干式转移Semi-drytransfer 1、将膜和滤纸剪成和凝胶一样大小。 2、预备转移缓冲液。 阳极阳极缓冲液冲液：0.3MTris,10%甲醇，甲醇，pH10.4;阳极阳极缓冲液冲液：25mMTris,10%甲醇，甲醇，pH10.4;阴极阴极缓冲液：冲液：25mMTris,40mM6-氨基己酸，氨基己酸，10%甲醇，甲醇，pH9.4(也可以用也可以用40mM甘氨酸替代甘氨酸替代)。水浴式水浴式转移用的移用的CAPS缓
17、冲液：也可用于半干式冲液：也可用于半干式转移，但移，但转移效率不及上述系移效率不及上述系统，尤其当蛋白含量甚少，尤其当蛋白含量甚少时，希望，希望蛋白蛋白质尽量多地尽量多地转移至膜上以便下一步分析。移至膜上以便下一步分析。我我们实验室：室：25mMTris192mM甘氨酸甘氨酸,无无SDSl 3、将PVDF膜在100%甲醇中润湿2-3 s，再用超纯水漂洗2-3min，然后在阳极缓冲液中平衡至少15min。l 4、电泳终了后将凝胶在阴极缓冲液中平衡5min。l5 在在转转移槽的阳极板上按以下移槽的阳极板上按以下顺顺序放置：在阳极序放置：在阳极缓缓冲液冲液中浸中浸过过的的Whatman3mm滤纸滤纸
18、，PVDF膜，膜，凝胶，在阴凝胶，在阴缓缓冲液中浸冲液中浸过过的的Whatman3mm滤纸滤纸。l6 根据需根据需转转移蛋白移蛋白质质的特性的特性设设置适宜的置适宜的电电流及流及时时间间，普通原那么，普通原那么为为1.8mA/cm2,1h。由于半干式。由于半干式转转移不易散移不易散热热，电电印迹宜在印迹宜在4环环境中境中进进展展 冰柜冰柜或冰或冰库库中中 。l7转移终了后，将膜在超纯水中漂洗转移终了后，将膜在超纯水中漂洗23次，次，每次每次5min，除去，除去Tris和甘氨酸。然后将膜置于和甘氨酸。然后将膜置于滤纸上将其自然晾干后，再在滤纸上将其自然晾干后，再在20%甲醇溶液略甲醇溶液略微润湿
19、一下即可在白光如日光灯下看到灰微润湿一下即可在白光如日光灯下看到灰白色的蛋白质带印迹，因此可省去染色步骤，白色的蛋白质带印迹，因此可省去染色步骤，切下此印迹进一步分析。但是当电泳前样品中切下此印迹进一步分析。但是当电泳前样品中含有较多的杂蛋白及盐时，用此法不易分辨，含有较多的杂蛋白及盐时，用此法不易分辨，仍需染色。仍需染色。实验中各成分作用实验中各成分作用l聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺lSDSl甘氨酸甘氨酸l上样缓冲液上样缓冲液l固定液固定液l染色剂染色剂l 被激活的单体和未被激活的单体反响开场了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地经过bis的作用进展交叉互联成为网状构造，最终多聚物聚合成凝胶状
20、，而其孔径大小等特征由聚合条件及单体浓度决议。十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)l SDS是阴离子型外表活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与PAGE技术结合，那么谱带差别更加明显、明晰，并可测定蛋白质分子量。lSDS带有大量负电荷，当其与蛋带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超越白质结合时，所带的负电荷大大超越了蛋白质原有的负电荷，因此消除或了蛋白质原有的负电荷，因此消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差别，使蛋白质均带有一样密度的负差别，使蛋白质均带有一样密度的负电荷，因此可利用分子量的差别将各电荷，因此可利用分
21、子量的差别将各种蛋白质分开。种蛋白质分开。 当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。 因此经过知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。 样品和浓缩胶中的氯离子构成挪动界面的先导边样品和浓缩胶中的氯离子构成挪动界面的先导边境境, ,而甘氨酸分子那么组成尾随边境，在挪动界面的而甘氨酸分子那么组成尾随边境，在挪动界面的两边境之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域两边境之间是一电导
22、较低而电位滴度较陡的区域, , 它它推进样品中的蛋白质前移并在分别胶前沿积聚。推进样品中的蛋白质前移并在分别胶前沿积聚。甘氨酸甘氨酸l此处此处pH值较高，值较高，有利于甘氨酸的离子化，有利于甘氨酸的离子化，所构成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随所构成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分别胶泳动。从挪动界面中解氯离子之后，沿分别胶泳动。从挪动界面中解脱后，脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和蛋白质复合物成一电位和pH值均匀值均匀的区带泳动穿过分别胶，并被筛分而依各自的的区带泳动穿过分别胶，并被筛分而依各自的大小得到分别。大小得到分别。上样缓冲液上样缓冲液为什么要上什么要上样缓冲液
23、？冲液？蛋白上蛋白上样缓冲液冲液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一种以溴酚是一种以溴酚蓝为染料，染料，5倍倍浓缩的的SDS-PAGE凝胶凝胶电泳上泳上样缓冲液冲液,用于常用于常规的的SDS-PAGE蛋白蛋白电泳泳样品上品上样。本本产品分品分为复原型和非复原型两种，复原型上复原型和非复原型两种，复原型上样缓冲液中的冲液中的巯基可使蛋白分子的基可使蛋白分子的链内二硫内二硫键和和链间二硫二硫键断裂，使断裂，使经过二硫二硫键衔接的各接的各亚单位彼此分位彼此分别，在，在电泳凝胶泳凝胶上上显现多个蛋白条多个蛋白条带，选购和运用和运用时请务必注明，仔必注明，仔细区分。区分。l本卷本卷须知知l
24、分分为复原型和非复原型两种，复复原型和非复原型两种，复原型上原型上样缓冲液中含一定量的冲液中含一定量的DTT或或巯基乙醇，有基乙醇，有细微刺激性气味，微刺激性气味，较易区分；易区分；l含含巯基的基的试剂有一定的毒性，有一定的毒性，为了您的平安和安康，了您的平安和安康，请穿穿实验服并服并戴一次性手套操作。戴一次性手套操作。运用运用阐明明 1. 1.按每按每4 l4 l蛋白蛋白样品参与品参与1l1l蛋白上蛋白上样缓冲液冲液的比例，混合蛋白的比例，混合蛋白样品和蛋白上品和蛋白上样缓冲液冲液(5X)(5X)。 2.1002.100或沸水浴加或沸水浴加热3 35min5min，以充分，以充分变性蛋白。性
25、蛋白。 3.3.冷却到室温后离心数秒冷却到室温后离心数秒钟假假设长时间离心会离心会导致甘油分致甘油分层，需求重新混匀，混均后，需求重新混匀，混均后再离再离30 s30 s，取上清直接上，取上清直接上样到到SDS-PAGESDS-PAGE胶加胶加样孔内孔内即可。即可。 4.4.通常通常电泳泳时染料到达胶的底端附近染料到达胶的底端附近0.5 0.5 1cm)1cm)即可停即可停顿电泳。泳。 添加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，普通上样缓冲液中参与一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以添加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起添加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中分散出来到电泳缓冲液中。 指示剂检
26、测电泳的行进过程，普通参与泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。 单纯的固定液普通难以到达这些要求，因此在实单纯的固定液普通难以到达这些要求，因此在实验中运用两种混和的固定液。验中运用两种混和的固定液。CarnoyCarnoy固定液甲醇固定液甲醇: :冰乙酸冰乙酸=3:l=3:l每次运用前需暂时配制，长时间放置影每次运用前需暂时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间响固定效果，固定时间15min15min至至24 h24 h，冰箱、室温均，冰箱、室温均可。可。 甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋酸固定液甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，可以
27、固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差但对核蛋白固定效果较差( (亲和力亲和力小且易自溶小且易自溶) )。冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即构成冰晶，所以又称为冰醋酸。常构成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用用0.30.30.50.5的浓度作为固定液。的浓度作为固定液。冰醋酸对资料有膨胀作用，对核蛋冰醋酸对资料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。合。 染色剂染色剂l 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色l常用染色方法常用染色方法 银染法银染法l 金属离子染色法金属离子染色法5电泳操作 将聚合好的凝胶板安顿于电泳槽中，上样，选
28、择适当的电压进展电泳。垂直板垂直板电泳安装电泳安装加样加样样品迁样品迁移方向移方向程度式电泳安装程度式电泳安装电泳缓冲液电泳缓冲液凝胶凝胶程度电泳安装程度电泳安装电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶按分子按分子大小分别大小分别电泳方向电泳方向电泳电泳小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶电泳电泳缓冲液缓冲液电泳电泳缓冲液缓冲液加在槽中的经加在槽中的经SDS处置的样品处置的样品分子量小
29、分子量小分子量大分子量大电源电源染色和脱色染色和脱色 电泳终了需经过染色和脱色评定其结果的优劣，此外根据不同的研讨目的，也可将凝胶直接进展放射自显影及电印迹。电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片脱色后的凝胶照片.结果处置结果处置l1 1丈量并计算分子量如今曾经很少用到丈量并计算分子量如今曾经很少用到l蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经3737种蛋白的测定得到种蛋白的测定得到以下的关系式以下的关系式l Mw Mw K(10 K(10bm) (1)bm) (1)l lgMw = lgK lgMw = lg
30、Kbm = K1bm = K1bm (2)bm (2)l 其中其中MWMW是蛋白质分子量；是蛋白质分子量；K K和和K1K1为常数为常数l b b为斜率，为斜率，m m是电泳迁移率，实践运用的是相对迁移率是电泳迁移率，实践运用的是相对迁移率mRmR。lmR=dpr/dBPB mR=dpr/dBPB l2 2灰度扫描和分析灰度扫描和分析规范蛋白分子量规范蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以经线性关系，所以可以经过规范曲线求未知多肽过规范曲线求未知多肽链分子量。链分子量。
31、相对迁移率相对迁移率实验本卷须知实验本卷须知 1. 构成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是构成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺能够混有的影响凝胶构成的杂质有：丙烯酰胺、线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。2. 留意不能随意倾倒单体溶液，应参与过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。l3.TEMED中混有氧化试剂后其本身中混有氧化试剂后其本身极易被氧化而失去催化才干，另外极易被氧化而失去催化才干，另外TEMED的氧化产物呈黄色，以此可的氧化产物呈黄色，以此可以鉴定以鉴定TEMED的质量。假设无法获的质量。假设无法获得无色透明的得无色透明的TEMED，只
32、能适当添，只能适当添加用量以保证聚胶速度。加用量以保证聚胶速度。l4.过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化才干，因于水后很快降解失去催化才干，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保管固体过硫酸铵应密闭枯燥。性。保管固体过硫酸铵应密闭枯燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否那么会使蛋白质在电泳过过量，否那么会使蛋白质在电泳过程中被氧化程中被氧化(主要指天然无变性剂凝主要指天然无变性剂凝胶胶)。l5.激活剂的用量激活剂的用量:激活剂的
33、浓度适激活剂的浓度适当与否不仅可以决议凝胶聚合的速当与否不仅可以决议凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。添加过度，也将影响凝胶的质量。添加过硫酸铵或硫酸铵或TEMED的用量，将使丙的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，至一定程度时，聚合链长度过短，将不会构成肉眼可见的凝胶，这些将不会构成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。较聚合前高一些。 6. 温度的影响聚胶的最正确温度为2325 ，需求留意灌胶前单体溶液(通
34、常置于4冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。7.氧气的影响氧气会与被激活的单体自在基作用氧气的影响氧气会与被激活的单体自在基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。假设省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更脱气。假设省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的反复性，充分多的激活剂，并且不能保证很好的反复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最正确聚合去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最正确聚合效果。通常在较好的真空度
35、效果。通常在较好的真空度(125torr)脱气至少脱气至少15min。8.凝胶添加剂：凝胶中经常参与凝胶添加剂：凝胶中经常参与SDS、尿素、尿素、TritonX-100等添加剂。等添加剂。SDS参与后不会对参与后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分别小分子蛋白质或变小，这一特性可用来分别小分子蛋白质或多肽。多肽。 9. 聚胶时间：虽然运用过硫酸铵TEMED催化后灌胶1520 min即可察看到凝胶的构成，但至少需90 min才干保证95以上的单链聚合生长短以及具有适宜的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它普通用于等电聚焦即
36、根据蛋白质的电荷性质进展分别，对孔径大小要求不高，因此不用等很长时间(完全聚合需8 h)。10. 单体的浓度：是指单体总分量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可选择的范围为330，单体浓度添加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。 11. SDS与蛋白质的结合按质量成比例即：1.4g SDS/g蛋白质，蛋白质含量不可以超标，否那么SDS结合量缺乏。l12.用用SDS-聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳法泳法测测定蛋白定蛋白质质相相对对分子量分子量时时，必需同，必需同时时作作规规范曲范曲线线。不能利用。不能利用这这次的次的规规范曲范曲线线作作为为下次用。并且下次用。并且SDS
37、-PAGE测测定分定分子量有子量有10误误差，不可完全信任。差，不可完全信任。l13.有的蛋白有的蛋白质质 如：如：电电荷异常或构造荷异常或构造异常的蛋白异常的蛋白质质；带带有有较较大大辅辅基的蛋白基的蛋白质质 不能采用不能采用该该法法测测相相对对分子量。分子量。14.有些蛋白有些蛋白质质由由亚亚基基 如血如血红红蛋白蛋白 或或两条以上两条以上肽链肽链 -胰凝乳蛋白胰凝乳蛋白酶酶 组组成成的，它的，它们们在在巯巯基乙醇和基乙醇和SDS的作用下的作用下解离成解离成亚亚基或多条基或多条单肽链单肽链。因此，。因此，对对于于这这一一类类蛋白蛋白质质，SDS-聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胺凝胶胶电电泳法泳法测测
38、定的只是它定的只是它们们的的亚亚基或是基或是单单条条肽链肽链的相的相对对分子量。分子量。常见问题及处置方法常见问题及处置方法 纹理和拖尾景象 由于样品溶解不佳引起的，抑制的方法可以在加样前离心，添加一些增溶辅助试剂如尿素。蛋白带过宽，与临近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。电泳泳时间比正常要比正常要长能能够由于凝胶由于凝胶缓冲系冲系统和和电极极缓冲系冲系统的的pH选择错误。指示指示剂成浅笑符号指示成浅笑符号指示剂前沿呈前沿呈现向上的向上的曲曲线形：形：阐明凝胶的不均匀冷却，中明凝胶的不均匀冷却，中间部分部分冷却不好，冷却不好，导致分子有不同的迁移率。致分子有不同的迁移率。5.凝
39、胶凝胶时间时间不不对对通常胶在通常胶在30min内凝聚假内凝聚假设设凝聚得太慢，能凝聚得太慢，能够够是是TEMED，APS剂剂不不够够或者失效或者失效l6.出出现现“皱皱眉眉 两两边边向下中向下中间间鼓起鼓起 l主要出如今蛋白主要出如今蛋白质质垂直垂直电电泳槽中，普通是泳槽中，普通是两板之两板之间间的底部的底部间间隙气泡未排除干隙气泡未排除干净净。处处置方置方法：可在两板法：可在两板间间参与适量参与适量缓缓冲液，以排除气泡。冲液，以排除气泡。l7.7.出出现现“鬼鬼带带 如何如何处处置？置？l “ “鬼鬼带带就是在跑大分子构就是在跑大分子构象复象复杂杂的蛋白的蛋白质质分子分子时时，常会出如今，
40、常会出如今泳道泳道顶顶端端 有有时时在在浓缩浓缩胶中胶中 的一些大分的一些大分子未知条子未知条带带或加或加样样孔底部有沉淀，主孔底部有沉淀，主要由于复原要由于复原剂剂在加在加热热的的过过程中被氧化程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白而失去活性，致使原来被解离的蛋白质质分子重新折叠分子重新折叠结结合和合和亚亚基重新基重新缔缔合，合，聚合成大分子，其分子量要比目的条聚合成大分子，其分子量要比目的条带带大，有大，有时时不能不能进进入分入分别别胶。但它却胶。但它却于目的条于目的条带带有一有一样样的免疫学活性，在的免疫学活性，在WBWB反响中可反响中可见见其能与目的条其能与目的条带对应带对应的的抗
41、体作用。抗体作用。处处置方法：在加置方法：在加热热煮沸后，煮沸后，再添加适量的再添加适量的DTTDTT或或BetaBeta巯巯基乙醇，以基乙醇，以补补充缺乏的复原充缺乏的复原剂剂；或可加适量；或可加适量EDTAEDTA来阻止复原来阻止复原剂剂的氧化。的氧化。l 8.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ l 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的景象。主要与缓冲液和分别胶的浓度有关。处置方法：改换正确pH值的Buffer；降低分别胶的浓度。SDS-PAGE的优点的优点l设备简单l快速l分辨率和灵敏度高 l特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定 SDS-PAGE的缺陷的
42、缺陷 1. 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等，他们在变性剂和强复原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完好蛋白质的分子量。 SDS-PAGE的缺陷的缺陷l2. 还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质如组蛋白F1，含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多的蛋白质，以及一些构造蛋白如胶原蛋白等，它们在SDS-凝胶系统中，电泳的迁移率与分子量的对数不呈线性关系。因此，为了测得真实和完好的蛋白质分子量，通常可采用多种方法进展测定和相互验证。 小技巧小技巧l1 1： 电泳缓冲液的运用：电泳缓冲
43、液的运用：l 电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但电泳缓冲液是完全可以回收再用的，但前提是每次的内层缓冲液必需是新配的。每次前提是每次的内层缓冲液必需是新配的。每次在电泳完成后内外层缓冲液一同回收到一个瓶在电泳完成后内外层缓冲液一同回收到一个瓶里，作为下次的外层缓冲液运用。就是配制新里，作为下次的外层缓冲液运用。就是配制新的缓冲液只作为内层运用配制的缓冲液只作为内层运用配制1L1L可以用很久可以用很久的，每次都用回收的缓冲液作外层，效果一的，每次都用回收的缓冲液作外层，效果一点都不差，即节省了试剂，又节省了时间。点都不差，即节省了试剂，又节省了时间。 2： 电泳条件的选那么 电泳不采用先低压再高
44、压的常用方法，每次都是上样后直接采用200V恒压电泳，普通BioRad的胶板，39min即可跑到头，电泳结果一点都没有影响。电压和电流的选择的规范是发热缺乏以影响到电泳的进展。l3 3： 染色与脱色染色与脱色l 分子克隆上引见的方法耗时太分子克隆上引见的方法耗时太长，如今用长，如今用CrystalCrystal的方法曾经相当快的方法曾经相当快了，稍做改动：染色时参与染液后，了，稍做改动：染色时参与染液后，在微波炉中煮沸一次即可，切记不要在微波炉中煮沸一次即可，切记不要喷了，这个过程大约喷了，这个过程大约20203030秒，在摇秒，在摇床上染色，这时可以去处置胶板，电床上染色，这时可以去处置胶板
45、，电泳槽，台面，待拾掇干净后染色也就泳槽，台面，待拾掇干净后染色也就终了了不要觉得染色时间太短了，终了了不要觉得染色时间太短了，曾经足够了，太长了脱色也费事，曾经足够了，太长了脱色也费事，此过程大约需求此过程大约需求3 35min5min；回收染液，；回收染液，用自来水清洗几次胶，再参与适量自用自来水清洗几次胶，再参与适量自来水，放入微波炉中煮沸，条件与染来水，放入微波炉中煮沸，条件与染色时一致，摇床脱色，此时他就可以色时一致，摇床脱色，此时他就可以做其他实验了，做其他实验了， 3 35min5min后可以再换后可以再换一次清水，煮沸脱色，我的阅历是一一次清水，煮沸脱色，我的阅历是一次用水脱色
46、就可以看到次用水脱色就可以看到MarkerMarker条带了，条带了，两次以后就可以清析的看到他的结果两次以后就可以清析的看到他的结果了，假设觉得结果不错可以留存备用，了，假设觉得结果不错可以留存备用，再参与脱色液，脱干净了就行了。再参与脱色液，脱干净了就行了。WesternBlotl l原理原理l l 蛋白蛋白质样品品经 SDS-PAGE电泳后，凝泳后，凝胶所含的胶所含的样品蛋白品蛋白质区区带经过电泳方法泳方法转移、移、固定到固定到载体如尼体如尼龙膜、硝酸膜、硝酸纤维素膜、素膜、PVDF膜上，以膜上的蛋白或多膜上，以膜上的蛋白或多肽为抗原，抗原，与相与相应的第一抗体和的第一抗体和酶标志的第二
47、抗体反响，志的第二抗体反响，用适当的溶液漂洗去未用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物合抗体后，置含底物的溶液中培育，的溶液中培育，显出出谱带，即可，即可检测出出样品中品中的特异蛋白抗原的特异蛋白抗原组分。分。 检测原理图检测原理图Westernblot转移膜的选择转移膜的选择l1. 孔径的选择: 通常当目的分子量小于20kD时，采用孔径为0.22um的膜。普通用0.45um孔径。l2. 膜资料的选择l 1硝酸纤维素膜(NC)：纯度很重要，纯度越高，结合蛋白越强。背景低，价钱廉价。缺陷是结合蛋白量比PVDF膜低。l 2PVDF膜：结合蛋白质的量大，几乎是NC膜的6倍。缺陷是背景高，价钱贵，操作费事。l 3尼龙膜：结合蛋白的量大，缺陷是：背景高，如今很少运用。l 3. 不同膜转移缓冲液的选择：NC膜，SDS要少。
