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1、实验七实验七-1细胞荧光染色观察细胞荧光染色观察(gunch)与荧光显微镜的使用与荧光显微镜的使用（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）第一页，共三十一页。细胞荧光染色观察与实验实验(shyn)目的与教学要求目的与教学要求1.掌握荧光掌握荧光(ynggung)显微镜的成像基本原理及显微镜的成像基本原理及其使用；其使用；2.掌握暗视野显微镜的成像基本原理及其使掌握暗视野显微镜的成像基本原理及其使用。用。第二页，共三十一页。细胞荧光染色观察与荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长
2、的激发光对样品进行激发，使之产生理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性性(dng xng)、定位、定量观察检测。、定位、定量观察检测。一、荧光一、荧光(ynggung)显微镜的成像原理显微镜的成像原理第三页，共三十一页。细胞荧光染色观察与什么什么(shn me)(shn me)是荧光是荧光 ? ?n物质中的电子吸收光的能量物质中的电子吸收光的能量(nngling)(nngling)由低能状由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。出的光。
3、n即：物质吸收短波光，发射出的长波光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。第四页，共三十一页。细胞荧光染色观察与n保持固有的荧光保持固有的荧光(ynggung)(ynggung)特性特性n荧光波长激发波长荧光波长激发波长n荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度n有不同程度的衰减有不同程度的衰减n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光荧光(ynggung)的性质的性质第五页，共三十一页。细胞荧光染色观察与优点：优点：n检出能力高检出能力高n对细胞的刺激小对细胞的刺激小n能进行多重染色能进行多重染色用途用途：n物体构造的观察物
4、体构造的观察n荧光的有无、色调比较进行物质判别荧光的有无、色调比较进行物质判别n发荧光量的测定发荧光量的测定(cdng)对物质定性、定量分析对物质定性、定量分析荧光荧光(ynggung)显微镜的优点和用途显微镜的优点和用途第六页，共三十一页。细胞荧光染色观察与第七页，共三十一页。细胞荧光染色观察与荧光荧光(ynggung)(ynggung)素的特性素的特性第八页，共三十一页。细胞荧光染色观察与1.对细胞结构或组分的定性、定位、半定对细胞结构或组分的定性、定位、半定量研究。量研究。2.作为生物大分子筛选作为生物大分子筛选(shixun)与鉴定的标记与鉴定的标记物。物。荧光荧光(ynggung)显
5、微镜技术在生命科学研究中的应显微镜技术在生命科学研究中的应用用第九页，共三十一页。细胞荧光染色观察与第十页，共三十一页。细胞荧光染色观察与二、暗视野显微镜的成像原理二、暗视野显微镜的成像原理(yunl)通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改变通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照射到途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照射到样品样品(yngpn)上，由样品上，由样品(yngpn)表面的绕射光线表面的绕射光线入射到物镜内，产生样品入射到物镜内，产生样品(yngpn)的衍射图象。的衍射图象。第十一页，共三十一页。细胞荧光染色观察与三、试剂三、试剂(shj)与器材与器材青
6、蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）染色）甲醇、甲醇、1 丫啶橙、滤纸丫啶橙、滤纸(lzh)、吸管、载玻片、吸管、载玻片荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜第十二页，共三十一页。细胞荧光染色观察与四、实验四、实验(shyn)内容和实验内容和实验(shyn)步骤步骤1.蛙血细胞染色观察：取少许蛙血蛙血细胞染色观察：取少许蛙血 常规血涂片常规血涂片 凉干凉干 甲醇甲醇固定固定10 min 1 丫啶橙染色丫啶橙染色5 min 水洗水洗 室温干燥室温干燥（滤纸擦干玻片底面）（滤纸擦干玻片底面）
7、荧光显微镜观察（先低倍后高倍观察）荧光显微镜观察（先低倍后高倍观察） （可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞）（可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞）2.取洋葱取洋葱撕取一小片内表皮撕取一小片内表皮平面平面(pngmin)单层铺展于玻片上单层铺展于玻片上室温凉干室温凉干1丫啶橙染色丫啶橙染色5min 水洗（用吸管，小心掉片）水洗（用吸管，小心掉片） 室温干燥（或用室温干燥（或用滤纸擦干）滤纸擦干） 荧光显微镜观察荧光显微镜观察3.暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范）暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范）4.观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）染色）第十三
8、页，共三十一页。细胞荧光染色观察与1.荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察(gunch)。2.使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛。发光源，保护眼睛。3.暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下观暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。察。 五、注意事项五、注意事项第十四页，共三十一页。细胞荧光染色观察与六、作业与思考题：六、作业与思考题：1.描述在荧光显微镜下所观察到的描述在荧光显微镜下所观察到的实验现象实验现象(xinxing)。2.绘图比较人正常肝组织细胞和脂肪肝绘图比较人正常肝组织细胞和脂肪肝组织细胞。组
9、织细胞。第十五页，共三十一页。细胞荧光染色观察与实验七实验七-2 激光扫描共聚焦激光扫描共聚焦(jjio)显微镜在生命科学中的应用显微镜在生命科学中的应用 第十六页，共三十一页。细胞荧光染色观察与实验目的实验目的(md)与要求与要求1. 掌握激光扫描共聚焦掌握激光扫描共聚焦(jjio)显微镜的成像基本显微镜的成像基本原理及其在生命科学中的应用。原理及其在生命科学中的应用。第十七页，共三十一页。细胞荧光染色观察与Laser Scanning Confocal Microscope第十八页，共三十一页。细胞荧光染色观察与1.普通荧光显微镜的不足普通荧光显微镜的不足2. 使用荧光物质标记细胞中的特定
10、成分或结构，不仅图像与对比度使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（提高了分辩率（=0.61 / NA ）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自(li z)焦平面上方或焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自(li z)焦平面以外的荧光使观焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即
11、焦平面以外的荧光结构模糊、察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。一、激光扫描一、激光扫描(somio)共聚焦显微镜的成像基本原理共聚焦显微镜的成像基本原理第十九页，共三十一页。细胞荧光染色观察与2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的照射后发出的荧光被物镜收集，并
12、沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为孔，分别称为(chn wi)照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射
13、光都被挡在探以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。第二十页，共三十一页。细胞荧光染色观察与Confocal Principle第二十一页，共三十一页。细胞荧光染色观察与第二十二页，共三十一页。细胞荧光染色观察与每一幅焦平面图像实际上是标本
14、的光学横切面，这每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平平面（焦平面）扫描与面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过轴（光轴）扫描相结合，通过累
15、加连续层次的二维图像，经过累加连续层次的二维图像，经过(jnggu)专门的计算机专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。软件处理，可以获得样品的三维图像。第二十三页，共三十一页。细胞荧光染色观察与观察方式：以荧光为主观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）光源：激光（紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测输出：实时观测(gunc),数字化图像，可以进行图像处理和定量分析数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察多重染色样品的观察LSCM的基本(jbn)特点第二
16、十四页，共三十一页。细胞荧光染色观察与3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等等细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞内氧自由基活性细胞内氧自由基活性细胞内钙离子浓度细胞内钙离子浓度(nngd)变化变化膜电位膜电位第二十五页，共三十一页。细胞荧光染色观察与第二十六页，共三十一页。细胞荧光染色观察与三、试剂三、试剂(shj)与器材与器材青蛙青蛙冷丙酮、冷丙酮、 D
17、API 、甘油、甘油/PBS封片剂封片剂(pin j)、滤纸、吸管、载、滤纸、吸管、载玻片、盖玻片玻片、盖玻片激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜第二十七页，共三十一页。细胞荧光染色观察与四、实验步骤四、实验步骤1.取涂有细胞取涂有细胞(xbo)的载玻片（细胞的载玻片（细胞(xbo)涂在中间），冷丙酮涂在中间），冷丙酮40C固定固定10 min;2.PBS漂洗漂洗2次，每次次，每次3 min; 3.滴加滴加DAPI溶液溶液100 ul室温孵育室温孵育30 min; 4.PBS漂洗漂洗3次，每次次，每次5min; 5.滴一小滴甘油滴一小滴甘油/PBS封片剂封片剂(pH8.5，PBS:甘油甘油
18、=1:9，v/v)封片封片;6.激光扫描共聚焦显微镜观察。激光扫描共聚焦显微镜观察。第二十八页，共三十一页。细胞荧光染色观察与五、注意事项五、注意事项注意染色时间注意染色时间(shjin)注意避光注意避光第二十九页，共三十一页。细胞荧光染色观察与六、作业与思考题：六、作业与思考题：试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理，并描试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理，并描述实验中所观察的现象述实验中所观察的现象思考题：思考题：激光扫描共聚焦显微镜观察到的图象激光扫描共聚焦显微镜观察到的图象(t xin)为什为什么比普通的荧光显微镜的清晰度、层次感要强许多？么比普通的荧光显微镜的清晰度、层次感要强许多？第三十页，共三十一页。细胞荧光染色观察与内容(nirng)总结实验七-1。物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。荧光波长激发波长。荧光强度(qingd)极小于激发光的强度(qingd)。1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理及其在生命科学中的应用。照明方式：点照明、逐点扫描。成像方式：共聚焦、逐点成像。试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理，并描述实验中所观察的现象第三十一页，共三十一页。细胞荧光染色观察与
