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1、实验三、细菌的革兰氏染色和显微实验三、细菌的革兰氏染色和显微镜油镜的运用镜油镜的运用一、实验目的一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和运用方法；了解并掌握油镜的原理和运用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在油镜下察看细胞和识别细菌的形状特征。在油镜下察看细胞和识别细菌的形状特征。;二、实验资料二、实验资料 1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘液、碘液、95乙醇、乙醇、0.5%沙黄染色液沙黄染色液 4、资料：载玻片、香柏油、二甲苯
2、、擦镜、资料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸纸;三、实验原理三、实验原理一普通光学显微镜一普通光学显微镜p.21-231.光学部分光学部分:接目镜接目镜 、 接接物镜物镜 、 照明安装照明安装(聚光聚光镜、镜、 虹彩光圈、虹彩光圈、 反光反光镜等镜等)。 它使检视物放它使检视物放大大,呵斥物象。呵斥物象。2.机械部分机械部分:镜座、镜臂、镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、物台、载物台转移器、粗调理器、细调理器等粗调理器、细调理器等部件。它起着支持、调部件。它起着支持、调理、固定等作用。理、固定等作用。;图图1-1-2 光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原
3、理倒立的虚像倒立的虚像;n n1.1.放大倍数放大倍数放大倍数放大倍数= =接物接物接物接物镜镜放大倍数放大倍数放大倍数放大倍数 接目接目接目接目镜镜放放放放大倍数大倍数大倍数大倍数 2. 2. 显显微微微微镜镜的分辨率的分辨率的分辨率的分辨率 是表示是表示是表示是表示显显微微微微镜镜辨析辨析辨析辨析物体两端两点之物体两端两点之物体两端两点之物体两端两点之间间间间隔的才干，可隔的才干，可隔的才干，可隔的才干，可用公式表示用公式表示用公式表示用公式表示为为： D=0.61/nSin/2 D=0.61/nSin/2n n式中式中式中式中D D：物：物：物：物镜镜分辨出物体两点分辨出物体两点分辨出物
4、体两点分辨出物体两点间间的最短的最短的最短的最短间间隔。隔。隔。隔。 ：可：可：可：可见见光的波光的波光的波光的波长长平均平均平均平均0.550.55m) m) n: n: 物物物物镜镜和被和被和被和被检标检标本本本本间间介介介介质质的折射率。的折射率。的折射率。的折射率。 ：镜镜口角即入射角。口角即入射角。口角即入射角。口角即入射角。显微镜的放大倍数和分辨率D值越小，分辨率越高，看到的物象越明晰越小，分辨率越高，看到的物象越明晰;二油二油镜运用的原理运用的原理 油油镜，即油浸接物，即油浸接物镜。当光当光线由反光由反光镜经过玻片与玻片与镜头之之间的空的空气气时，由于空气与玻，由于空气与玻片的密
5、度不同，使光片的密度不同，使光线遭到曲折，遭到曲折，发生散生散射，降低了射，降低了视野的照野的照明度。假明度。假设中中间的介的介质是一是一层油其折射油其折射率与玻片的相近，率与玻片的相近，那么几乎不那么几乎不发生折射，生折射，添加了添加了视野的野的进光量，光量，从而使物象更加明晰。从而使物象更加明晰。u根据公式根据公式D=0.61/nSin/2 ，增大分母，使得，增大分母，使得D值减小，分辨率增大。减小，分辨率增大。;1.1.不准擅自装配不准擅自装配不准擅自装配不准擅自装配显显微微微微镜镜的任何部件的任何部件的任何部件的任何部件, ,以免以免以免以免损损坏。坏。坏。坏。2.2.镜镜面只能用擦面
6、只能用擦面只能用擦面只能用擦镜纸镜纸擦，不能用手指或粗布，以擦，不能用手指或粗布，以擦，不能用手指或粗布，以擦，不能用手指或粗布，以保保保保证证光光光光洁洁度度度度3.3.察看察看察看察看标标本本本本时时，必需依次用低、中、高倍，必需依次用低、中、高倍，必需依次用低、中、高倍，必需依次用低、中、高倍镜镜，最，最，最，最后用油后用油后用油后用油镜镜。当目。当目。当目。当目视视接目接目接目接目镜时镜时，特，特，特，特别别在运用油在运用油在运用油在运用油镜时镜时，切不可运用粗，切不可运用粗，切不可运用粗，切不可运用粗调调理器，以免理器，以免理器，以免理器，以免压压碎玻片碎玻片碎玻片碎玻片或或或或损伤
7、镜损伤镜面。面。面。面。4.4.拿拿拿拿显显微微微微镜时镜时，一定要右手拿，一定要右手拿，一定要右手拿，一定要右手拿镜镜臂，左手托臂，左手托臂，左手托臂，左手托镜镜座，座，座，座，不可不可不可不可单单手拿，更不可手拿，更不可手拿，更不可手拿，更不可倾倾斜拿。斜拿。斜拿。斜拿。5.5.显显微微微微镜应镜应存放在阴凉枯燥存放在阴凉枯燥存放在阴凉枯燥存放在阴凉枯燥处处，以免，以免，以免，以免镜镜片繁殖霉片繁殖霉片繁殖霉片繁殖霉菌而腐菌而腐菌而腐菌而腐蚀镜蚀镜片。片。片。片。三显微镜保养和运用中的本卷须知三显微镜保养和运用中的本卷须知;1、实验原理、实验原理p.29革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色
8、法。革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及一切的放线有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及一切的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反响；菌和真菌都呈革兰氏阳性反响；弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现阴性反响。呈现阴性反响。四、革兰氏染色原理及操作四、革兰氏染色原理及操作;经典法，四步法经典法，四步法p.29-31;2、实验操作、实验操作n np.30，采用三区涂片法，采用三区涂片法;大肠杆菌大肠杆菌葡萄球菌葡萄球菌;n n1涂片：载玻片要干净无油迹；滴生涂片：载玻片要干净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不理盐水和取
9、菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓重可过于浓重;2 2固定：固定：染色前必需固定细菌，其目的是：染色前必需固定细菌，其目的是：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。二是添加其对染料的亲和力。常用加热固定二是添加其对染料的亲和力。常用加热固定法。固定时尽量维持细胞原有的形状。法。固定时尽量维持细胞原有的形状。 留意：不可留意：不可过热，以，以载玻片不玻片不烫手手为宜，宜，温度温度过高会改高会改动甚至破坏甚至破坏细胞形状。胞形状。;3染色先阅读染色先阅读p.31的本卷须知的本卷须知 革兰氏染色结果能否正确，乙醇脱色革兰氏染色结果能否正确，乙醇脱色是整个操作的关键环节，
10、脱色缺乏，阴性是整个操作的关键环节，脱色缺乏，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。误染成阴性菌。 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应摔去细胞上的残水，以免染色液洗后，应摔去细胞上的残水，以免染色液被稀释。被稀释。;4镜检(p.24，用低倍、高倍、油，用低倍、高倍、油镜分分别察看察看细菌菌)以分散开的以分散开的细菌的革菌的革兰氏染色反响氏染色反响为准，准，过于密集的于密集的细菌，菌，经常呈假阳性。常呈假阳性。5显微微镜用用毕后的后的处置置p.25 油油镜运用运用终了后一定要用二甲苯擦了后一定要用二甲苯擦拭
11、拭镜头，但二甲苯量不可，但二甲苯量不可过多！多！;n n本实验每人做一张。本实验每人做一张。n n实验报告中要画图表示结果低倍、高倍、实验报告中要画图表示结果低倍、高倍、油镜。油镜。3、实验报告、实验报告;实验思索题回答在实验实验思索题回答在实验报告上报告上1.1.涂片涂片涂片涂片为为何要固定？固定加何要固定？固定加何要固定？固定加何要固定？固定加热时间过长热时间过长会怎会怎会怎会怎样样2.2.运用油运用油运用油运用油镜时镜时，为为什么必需用香柏油？什么必需用香柏油？什么必需用香柏油？什么必需用香柏油？3.3.镜检标镜检标本本本本时时，为为什么先用低倍什么先用低倍什么先用低倍什么先用低倍镜镜察看，而不是察看，而不是察看，而不是察看，而不是直接用高倍直接用高倍直接用高倍直接用高倍镜镜或油或油或油或油镜镜察看？察看？察看？察看？4 4、革、革、革、革兰兰氏染色中哪一步是关氏染色中哪一步是关氏染色中哪一步是关氏染色中哪一步是关键键，为为什么？他如什么？他如什么？他如什么？他如何控制何控制何控制何控制这这一步？一步？一步？一步？;
