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1、实验四实验四 革兰氏染色法革兰氏染色法一、目的要求一、目的要求 n1 学习革兰氏染色原理，理解着色机理。n2 掌握革兰氏染色的方法，并能正确染色。n3 巩固无菌操作技术n4 巩固显微镜油镜的使用方法二、基本原理二、基本原理 革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是根据革兰氏阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而使用一系列的染色处理使之差别显色。其染色方法是先将细菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂复染。最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色的是革兰氏阳性细菌。革兰氏染色原理：革兰氏染色原理：n第一步：第一步：结晶紫使菌体着上紫色结晶紫使菌体着上紫色n第二步：第
2、二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。能被细胞壁阻留在细胞内。n第三步：第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。不同的反应。nG+ G+ 菌：菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫- -碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。仍呈紫色。nG G菌：菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使肽聚糖层薄，
3、交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高其结构收缩，因其含脂量高, ,乙醇将脂溶解，缝隙乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫加大，结晶紫- -碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。三、实验材料n大肠杆菌（24h培养）斜面菌种n枯草杆菌（12h培养）斜面菌种四、方法步骤四、方法步骤n1涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。n2初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。3媒染：滴加碘液染色1-2min，后用水冲洗，甩尽残余水n4脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度），然后立即用水冲洗。n5复染
4、：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染2-3min，如果石炭酸复红染1min。水洗，晾干。n6镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察1实验实验5. 微生物细胞大小测定微生物细胞大小测定一、实验目的一、实验目的n学学习习用用镜镜台台测测微微尺尺校校正正目目镜镜测测微微尺尺的的方方法法n学学习习并并掌掌握握用用目目镜镜测测微微尺尺测测定定细细菌菌细细胞胞大小的方法大小的方法n巩固显微镜油镜的使用方法巩固显微镜油镜的使用方法二、实验原理n测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测定微生物细胞大小是在显微镜下利用测微尺测微尺进行。测微尺可分为进行。测微尺可分为目镜测微尺目镜测微尺和和镜台测微尺镜台测微尺。
5、目镜测微尺目镜测微尺是特制的圆形玻片，中央有一刻度是特制的圆形玻片，中央有一刻度尺（尺（100100等分等分），可放入目镜镜筒内，用于测），可放入目镜镜筒内，用于测定细胞大小。定细胞大小。镜台测微尺镜台测微尺为一载玻片，上贴有为一载玻片，上贴有圆形盖片，中央有总长度为圆形盖片，中央有总长度为1mm(1001mm(100等分等分) )，每，每小格长小格长0.01mm0.01mm(10um) (10um) 。目镜测微尺每小格大目镜测微尺每小格大小随显微镜放大倍数不同而改变，小随显微镜放大倍数不同而改变，使用目镜测使用目镜测微尺进行测量之前必须用镜台测微尺标定微尺进行测量之前必须用镜台测微尺标定，以
6、，以求出在某一放大倍数下目镜测微尺每小格所代求出在某一放大倍数下目镜测微尺每小格所代表的长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测表的长度，然后用标定好的目镜测微尺进行测量。量。三、三、 实验材料n枯草杆菌标本片四、实验方法步骤1）用镜台测微尺标定目镜测微尺。2）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小。（1）用镜台测微尺标定目镜测微尺。n放置目尺：取出目镜，旋开接目镜，将目尺放在目镜镜筒的中间隔板上（有刻度的一面朝下），旋上接目镜，并插入镜筒。n放置台尺：将台尺放置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。n标定目尺：先用低倍镜观察，找到台尺刻度，转动目镜使目尺与台尺的刻度轴线相平行，移动台尺使目尺与台尺某一区间的两
7、对刻度线完全重合，然后计数出两重合线间各自所占格数，通过如下公式计算： n数标定低倍镜目尺每小格所代表的实际长度目尺每小格长度（um）=两对重合刻度线之间台尺所占格数10两对重合刻度线之间目尺所占格数（2）用目镜测微尺测定枯草杆菌大小n取下台尺，将染色片放在载物台上，先取下台尺，将染色片放在载物台上，先用低倍镜观察，后换油镜观测，计量细用低倍镜观察，后换油镜观测，计量细菌菌长和宽长和宽所占小格数，将测得格数乘以所占小格数，将测得格数乘以已标定的目尺每小格长，即得菌体实际已标定的目尺每小格长，即得菌体实际大小。测定大小。测定20个菌体求出平均值。个菌体求出平均值。 实验报告：（1）目镜测微尺标定结果记录（2）在油镜下测量枯草杆菌大小结果记录下次实验：6-8
