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1、LOGO各期梅毒各期梅毒实验诊断方法断方法广广东省皮肤病医院省皮肤病医院广广东省皮肤性病防治中心省皮肤性病防治中心郑和平和平PhDLOGO“广东疮”LOGO广东与全国梅毒比较1995-2011(incidence/100,000)年份年份广东广东全国全国199519951.781.780.960.96199619966 61.811.81199719979.939.932.782.781998199813.7913.794.374.371999199915.0715.076.56.52000200013.4713.476.436.432001200113.8913.896.116.112002
2、200214.2514.255.85.82003200311.211.25.635.632004200412.9412.947.77.72005200514.4614.4610.9610.962006200619.6919.6914.2414.242007200723.1323.1317.1617.162008200837.1137.1121.0621.062009200940.5840.5824.6624.662010201047.147.128.928.92011201148.9448.9432.0432.04LOGO1995-2011年广东省各期梅毒发病情况GD STD LG Yang2
3、011年，全省年，全省21个地市报告梅毒个地市报告梅毒51,051例，报告数占全国例，报告数占全国报告总数的报告总数的11.88%，位居全国第一，位居全国第一 梅毒诊断的准确性如何？某省疾控中心共核某省疾控中心共核查后天梅毒后天梅毒164164例，其中，例，其中，未做未做RPRRPR定性的定性的4343例，未例，未进行行RPRRPR定量的定量的6464例，例，根据根据临床表床表现但无症状但无症状记录的的9292例。核例。核实7 7例例先天梅毒均不符合国家确先天梅毒均不符合国家确诊标准。准。 诊断技断技术的掌握和正确的掌握和正确应用很重要用很重要 先天梅毒血清学的随访研究先天梅毒血清学的随访研究
4、5 5年上海市年上海市9999例报道先天梅毒患儿例报道先天梅毒患儿TPPATPPA随访随访 转阴率转阴率 累计阴转率累计阴转率 1 1个月个月 3 3个月个月 6 6个月个月 39.91% 44.57%39.91% 44.57% 12 12个月个月 4040 18-2418-24月月 11顾伟鸣等，先天梅毒的血清学随访，顾伟鸣等，先天梅毒的血清学随访，中中华传染病染病杂志志2007，25（2）：）：117-119 误诊率？误诊率？ 检测能力差！检测能力差！梅毒诊断的准确性如何？梅毒诊断的准确性如何？2011年梅毒诊断试剂临床评估结果v中国性病控制中心，广西皮肤病防治研究所、北京市中国性病控制中
5、心，广西皮肤病防治研究所、北京市CDC、云南省、云南省CDC、甘、甘肃省省CDC、浙江省皮肤病防治研究所等、浙江省皮肤病防治研究所等中国预防与控制梅毒规划 （2010-2020年）v加加强梅毒梅毒检测质量控制和量控制和实验室能力建室能力建设，充分，充分利用利用现有有资源，开展梅毒源，开展梅毒检测实验室室质量考量考评和和技技术指指导，提高梅毒，提高梅毒实验室室检测的准确性和梅毒的准确性和梅毒确确证检测的可及性的可及性”LOGO各期梅毒各期梅毒实验诊断方法断方法 未经治疗的梅毒病人的自然病程感染梅毒螺旋体感染梅毒螺旋体一期梅毒一期梅毒二期梅毒二期梅毒潜伏梅毒潜伏梅毒三期梅毒三期梅毒梅毒树胶肿梅毒树
6、胶肿脊髓痨脊髓痨, 麻痹性痴呆麻痹性痴呆心血管梅毒心血管梅毒72%30%终生潜伏梅毒终生潜伏梅毒中枢神经系统感染中枢神经系统感染28%感染梅毒螺旋体感染梅毒螺旋体2-62-6周周1-3月月 1-3月月2-50年年2Gjestland, T. 1955. The Oslo study of untreated syphilis; an epidemiologic investigation of the natural course of the syphilitic infection based upon a re-study of the Boeck-Bruusgaard material
7、. Acta Derm. Venereol. 35:3368; Annex I-LVI.一期梅毒的临床表现与实验室诊断v入入v侵侵v部部v位位临床表现一期梅毒实验室诊断临床特点临床特点取材部位取材部位检查方法检查方法硬下疳硬下疳腹股沟淋巴结病腹股沟淋巴结病溃疡、淋巴结血液病原检测：（暗示野、 镀银染色、荧光染色、PCRPCR）同上血清学试验致病性螺旋体致病性螺旋体 螺旋体属名螺旋体属名螺旋体名螺旋体名疾病疾病细（钩端）螺旋体属疏（包柔）螺旋体属密螺旋体属钩端螺旋体回归热螺旋体奋森螺旋体伯氏疏螺旋体梅毒螺旋体雅司螺旋体品他螺旋体地方性梅毒螺旋体钩端螺旋体病回归热奋森咽峡炎莱姆病梅毒雅司品他地方性
8、梅毒一，梅毒病原学检测1 1，病原学检测：，病原学检测：1 1）暗示野镜检：）暗示野镜检：方法：渗出液混于盐水中，暗示野镜观察方法：渗出液混于盐水中，暗示野镜观察结果：可见典型梅毒螺旋体和特殊运动方式结果：可见典型梅毒螺旋体和特殊运动方式 5R. Heymans, et al. J. CLIN. MICROBIOL.2010 48(2):4972）暗示野与PCR检测. 5 Clinical Value of Treponema pallidum Real-Time PCR for Diagnosis of Syphilis 6Molecular Characterization of Syph
9、ilis in Patients in Canada: Detection of Treponema pallidum DNA in Whole-Blood Samples versus Ulcerative Swabs J. CLIN. MICROBIOL. 2009,47（6）：1668v病人病人8787例例:41:41梅毒（梅毒（1919例一期例一期,9,9例二期例二期,10,10例潜伏例潜伏,3,3例先天）例先天）v靶基因：靶基因：T. pallidum T. pallidum tpp47, tpp47, bmpbmp, , polApolA，23S rRNA gene23S rRNA
10、 genev结果：果：v结论：溃疡拭子拭子样本适合于一期梅毒的本适合于一期梅毒的PCRPCR检测 二期血液二期血液样本中本中50%50%活活动性梅毒可性梅毒可检测到到TP-DNATP-DNAvWHOWHO推荐暗示野镜检诊断早期梅毒，早于抗体出推荐暗示野镜检诊断早期梅毒，早于抗体出现前数日至数周现前数日至数周vorganisms/mLrequiredforvisualization敏感性敏感性80%80%，但阴性不能排除，但阴性不能排除梅毒梅毒3LarsenS,etal.Laboratorydiagnosisandinterpretationoftestsforsyphilis.ClinMicr
11、obiolRev1995;8:121.v假阳性假阳性: :与口腔肛周其他螺旋体相似，不推荐口与口腔肛周其他螺旋体相似，不推荐口腔肛周标本腔肛周标本4TramontE.Syphilisinadults:fromChristopherColumbustoSirAlexanderFlemingtoAIDS.ClinInfectDis1995;21:136171vPCRPCR敏感性特异性高敏感性特异性高. .适宜早期诊断。适宜早期诊断。 病原体检测二、血清学检查二、血清学检查1.1.非梅毒螺旋体抗原血清学试验非梅毒螺旋体抗原血清学试验 VDRL VDRL、USRUSR、RPRRPR、TRUSTTRUS
12、T2. 2. 梅毒螺旋体抗原血清学试验梅毒螺旋体抗原血清学试验 FTA-ABS FTA-ABS、TPHATPHA、 TPPATPPA、ELISAELISA、TP-RTTP-RT IgM IgM1.1.非梅毒螺旋体抗原血清学试验：非梅毒螺旋体抗原血清学试验：v原理：梅毒螺旋体破坏宿主细胞释放以及其螺旋体细胞表面释放原理：梅毒螺旋体破坏宿主细胞释放以及其螺旋体细胞表面释放的类脂物质，刺激机体产生抗类脂抗体（反应素）。在体外该抗的类脂物质，刺激机体产生抗类脂抗体（反应素）。在体外该抗体与心磷脂、卵磷脂和胆固醇组成的抗原反应，形成凝集反应。体与心磷脂、卵磷脂和胆固醇组成的抗原反应，形成凝集反应。v方法
13、：方法：VDRL VDRL (venereal disease research laboratory test)(venereal disease research laboratory test) USR ( USR (unheated serum reagin testunheated serum reagin test) ) RPR RPR (rapid plasma reagin circle card test) (rapid plasma reagin circle card test) TRUST ( TRUST (tolulized red unheated serum te
14、st)tolulized red unheated serum test)特点：非特异性反应特点：非特异性反应 2、梅毒螺旋体抗原血清试验v原理：原理：基于基于TPTP特异性抗原，检测特异性抗原，检测TPTP抗体抗体v方法：方法：1.1.凝集法：凝集法：TPHATPHA， TPPATPPA2.2.FTAFTAABSABS3.3.ELISAELISA4.4.19sIgM19sIgM5.5.TP-RTTP-RT（胶体金法）（胶体金法）19S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 200
15、5;16(1):45-51.1）TPPA/TPHAv原理：原理：v超声裂解超声裂解TPTP抗原或基因工程抗原，致敏明胶颗粒抗原或基因工程抗原，致敏明胶颗粒/ /家家禽禽RBCRBC，与血清中抗，与血清中抗TPTP抗体结合，发生凝集反应。抗体结合，发生凝集反应。v临床：梅毒确证临床：梅毒确证v注意注意v存在交叉（存在交叉（1 1：8080）v低滴定时候，低滴定时候，FTA-ABSFTA-ABS确证确证2）FTA-ABS(fluoresenttreponemalantibodyabsorptiontest)v原理：原理：血清经吸收剂（血清经吸收剂（Reiter)Reiter)去非特异性抗去非特异性
16、抗体，与体，与TPTP反应，形成反应，形成Ab+AgAb+Ag复合物；再加复合物；再加TITCTITC标标记的抗人记的抗人IgG/IgMIgG/IgM抗体，形成荧光复合物，荧光抗体，形成荧光复合物，荧光镜下，镜下，TPTP呈苹果绿色荧光。呈苹果绿色荧光。v临床：最可靠确证试验临床：最可靠确证试验v特点：高度特异，特点：高度特异， 3 3）ELISAELISA：v原理：原理：TPTP特异性抗原包备酶标板，与血清中特异性抗原包备酶标板，与血清中TPTP抗体结合，加入酶标抗体，底物显色。抗体结合，加入酶标抗体，底物显色。v临床：用于梅毒筛查。临床：用于梅毒筛查。v注意：注意： 高敏感性，特异较差。高
17、敏感性，特异较差。4) 19sIgM:4) 19sIgM:v原理：原理：ELISAELISA， WBWB等等v临床：早期梅毒诊断临床：早期梅毒诊断v 先天梅毒诊断先天梅毒诊断v 5）TP-RT胶体金法：胶体金法：v原理（原理（见图）见图）v临床：筛查临床：筛查v注意：注意： 高敏感性，特异较差。高敏感性，特异较差。11Reactivity of Microhemagglutination, Fluorescent Treponemal Antibody bsorption, and Venereal Disease Research Laboratory Tests in Primary Sy
18、philis11 JOHN D. DYCKMAN, J. CLIN. MICROBIOL. 1980,12（4）：629 VDRL、FTA-ABS、TPHA关系v12SRatnam.Thelaboratorydiagnosisofsyphilis.CanJInfectDisMedMicrobiol2005;16(1):45-51.梅毒螺旋体血清学检测用试剂的敏感性和特异性 2011年国家公布v一期梅毒血清学一期梅毒血清学v非梅毒螺旋体抗体常非梅毒螺旋体抗体常为阴性或弱阳性阴性或弱阳性(1:8)(1:8)v梅毒螺旋体抗体常梅毒螺旋体抗体常为阴性或弱阳性（阴性或弱阳性（1:3201:320) )v
19、单次阳性次阳性结果果应结合合临床病史慎重床病史慎重诊断，阴性并不断，阴性并不能排除梅毒，需能排除梅毒，需连续观察抗体滴度察抗体滴度。vIgMIgM抗体早于抗体早于IgGIgG抗体，常抗体，常为阳性反阳性反应18Baughn,R.E.,andR.F.Schell.2001.ImmuneresponsestoTreponema pallidum andBorrelia burgdorefi,p.27.127.7.In R.R.Rich(ed.),Principlesandpracticeofclinicalimmunology,2nded.Mosby,St.Louis,Mo.二，梅毒血清学筛查策略
20、：v梅毒梅毒筛查策略策略IvRPR/TRUST阳性阳性TPPA/FTA阳性阳性v梅毒梅毒v特点：特点：传统方法，漏方法，漏检高（高（15%），），现症。症。梅毒筛查策略 II：vTP-ELISA阳性阳性TPPA阳性确阳性确证（阳性）（阳性）TRUST阳性阳性梅毒梅毒特点：批量特点：批量检测，敏感性高，敏感性高，需，需现症症鉴别梅毒筛查策略 III：vTP-RT阳性阳性TPPA阳性确阳性确证（阳性）（阳性）TRUST阳性阳性梅毒梅毒特点：特点：简便快速，敏感性高便快速，敏感性高，需，需现症症鉴别互为确证试验vRPR阳性阳性TPPA阳性阳性梅毒梅毒vTPPA阳性阳性RPR阳性阳性梅毒梅毒梅毒确梅毒
21、确诊v一期梅毒血清学一期梅毒血清学v非梅毒螺旋体抗体常非梅毒螺旋体抗体常为阴性或弱阳性阴性或弱阳性(1:8)(1:8)v梅毒螺旋体抗体常梅毒螺旋体抗体常为阴性或弱阳性（阴性或弱阳性（1:3201:32v梅毒螺旋体抗体梅毒螺旋体抗体100%敏感性与敏感性与98%特异性，特异性，且滴度且滴度640,v大量抗体的大量抗体的产生可能生可能导致前致前带现象。象。v皮皮损暗暗视野野检测绝大多数可大多数可检测到螺旋体，但由到螺旋体，但由于血清学方法的于血清学方法的简单性，而性，而检测较少。少。v20RobertE.BaughnandDanielM.Musher.SecondarySyphiliticLesi
22、onsCLINICALMICROBIOLOGYREVIEWS,2005,205216二期梅毒三期梅毒的临床表现与实验室诊断临床表现晚期12S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 2005;16(1):45-51.三期梅毒实验室诊断v晚期梅毒的皮晚期梅毒的皮损中，极中，极难找到找到TP。v非梅毒螺旋体抗体非梅毒螺旋体抗体71%阳性，梅毒螺旋体抗体阳性，梅毒螺旋体抗体96%阳性。阳性。v脑脊液脊液WBC、蛋白、蛋白、VDRL阳性。阳性。v未治疗早期梅毒孕妇的胎儿感染率未治疗早期梅毒孕
23、妇的胎儿感染率75-9575-95四、先天梅毒的临床表现与实验室诊断孕期孕期胎儿感染的危险性胎儿感染的危险性母亲感染梅毒母亲感染梅毒2 2年内：年内：早期和二期梅毒早期和二期梅毒早期潜伏梅毒早期潜伏梅毒70-10070-1004040母亲感染梅毒母亲感染梅毒2 2年后：年后：晚期潜伏梅毒晚期潜伏梅毒三期梅毒三期梅毒1010孕妇梅毒的后果v约约8 83737周早产周早产v约约1111低体重儿低体重儿v约约5 5为产期死亡为产期死亡v约约4 4胎儿死亡胎儿死亡v约约1.5%1.5%新生儿死亡新生儿死亡v约约2 2先天畸形先天畸形先天梅毒分期v早期先天性梅毒：早期先天性梅毒：2 2岁以内岁以内v晚期
24、先天性梅毒：晚期先天性梅毒：2 2岁以上岁以上 临床表现孕妇梅毒的筛查-预防和发现先天梅毒的关键孕妇梅毒筛查：妊娠期或分娩时至少做一次孕妇梅毒筛查：妊娠期或分娩时至少做一次梅毒血清学试验。梅毒血清学试验。 28% of positive RPR in pregnant women are biological false positives. 21Tosanna W. Peeling and Htun Ye. Diagnostic tools for preventing and managing maternal and congenital syphilis: an overview. B
25、ulletin of the WHO 2004 82(6):438先天梅毒实验室诊断WHOWHO和美国和美国CDCCDC推荐应符合四项之一：推荐应符合四项之一： 在新生儿体内查到梅毒螺旋体；在新生儿体内查到梅毒螺旋体； 抗心磷脂抗体滴度持续上升；抗心磷脂抗体滴度持续上升； 出生时患儿抗心磷脂抗体滴度高于其母亲出生时患儿抗心磷脂抗体滴度高于其母亲4 4倍倍 检测抗梅毒的检测抗梅毒的IgMIgM特异性抗体阳性。特异性抗体阳性。 v22Saloojee H, et al. The prevention and management of congenital syphilis: an overvie
26、w and 22Saloojee H, et al. The prevention and management of congenital syphilis: an overview and recommendations. Bull World Health Organ, 2004, 82:424-430. recommendations. Bull World Health Organ, 2004, 82:424-430. v23Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Congenital syphilis-United Sta
27、tes, 23Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Congenital syphilis-United States, 2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 20042002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2004，5353：716-719. 716-719. 1.病原体病原体检测：1）暗示野）暗示野检查：Darkfieldexaminationsofamnioticfluidobtainedbyamniocentesishavebeenshowntobeofvalueinth
28、ediagnosisofcongenitalsyphilisv5例例发生死胎的未治生死胎的未治疗梅毒孕梅毒孕妇v羊水暗示野羊水暗示野检查100%可可见螺旋体螺旋体v活活检组织中中2/5镀银染色阳性。染色阳性。v24WendelG,MaberryM,ChristmasJ,etal.Examinationofamnioticfluidindiagnosingcongenitalsyphiliswithfetaldeath.ObstetGynecol1989;74:96770.2）PCR检测TPv25UseofPolymeraseChainReactionandRabbitInfectivityTe
29、stingToDetectTreponemapalliduminAmnioticFluid,FetalandNeonatalSera,andCerebrospinalFluidvGRIMPRELE,etal.J.CLIN.MICROBIOL.1991,29:1711然而：然而：v许多先天梅毒患儿出生多先天梅毒患儿出生时通常无通常无临床症状。床症状。v15月的新生儿由于母月的新生儿由于母亲抗体的被抗体的被动转移而至移而至IgG检测无法无法鉴别先天梅毒。先天梅毒。v通常新生儿通常新生儿RPR滴度大于母滴度大于母亲4倍倍时强烈支持先烈支持先天梅毒。但研究天梅毒。但研究发现5WBC5个个/mm3/mm
30、3，总蛋白，总蛋白400mg/L.400mg/L.表明表明CSFCSF炎症炎症 可能为活动性神经梅毒，判断疗效可能为活动性神经梅毒，判断疗效:WBC:WBC降低降低2 2、脑脊液、脑脊液VDRLVDRL试验试验: CSF: CSF标准血清学试验。标准血清学试验。 特异性强，敏感性较低。特异性强，敏感性较低。 阳性时考虑神经梅毒，但有假阴性。阳性时考虑神经梅毒，但有假阴性。sensitivity was 50%sensitivity was 50%？ and specificity 90.6% using positive CSF- and specificity 90.6% using pos
31、itive CSF-VDRL as the gold standard for neurosyphilis. VDRL as the gold standard for neurosyphilis. Sensitivity was 61.5% and specificity was 83.6% using both the Sensitivity was 61.5% and specificity was 83.6% using both the CSF-VDRL and CSF-WBC criteria, CSF-VDRL and CSF-WBC criteria, 32Cerebrospi
32、nal fluid treponemal antibodies in untreated early syphilis1.39cases，其中，其中15HIV阳性阳性.2.测定：定：CSF-WBC,蛋白蛋白,VDRL，TPHA，FTA-ABS，白蛋白，白蛋白比例，比例，IgGindex.3.结果：果：4.结论：VDRLCSFtreponemaltestsmayhelptoexcludeadiagnosisofneurosyphilisinpatientswithearlysyphilis.Marra CM, et al. Arch Neurol. 1995 Jan;52(1):68-72.33
33、Clinical significance of cerebrospinal fluid tests for neurosyphilis.v1665例例CSF，1978-1987年年间.vFTA-ABS检测48例阳性例阳性,其中其中15例例诊断神断神经梅毒。梅毒。vVDRL检测4例阳性，例阳性，VDRL特异性特异性100%，但敏，但敏感性感性27%。vFTA-ABS敏感性高，但特异性差无法区敏感性高，但特异性差无法区别活活动性性神神经梅毒与以往梅毒。梅毒与以往梅毒。Davis LE, et al. Ann Neurol, 1989,25:503 3，鞘内，鞘内IgGIgG测定：测定：鉴别鞘内生
34、成或源自血清？鉴别鞘内生成或源自血清？ 活动性神经梅毒时，活动性神经梅毒时，CSFCSF的梅毒的梅毒IgGIgG抗体增高抗体增高1 1，白蛋白系数，白蛋白系数CSFCSF白蛋白白蛋白/ /血清白蛋白。血清白蛋白。 判断血脑屏障功能，正常为判断血脑屏障功能，正常为 2 2，IgGIgG指数指数 CSFCSF总总IgG xIgG x血清白蛋白血清白蛋白 血清总血清总IgG x CSFIgG x CSF白蛋白白蛋白 时表示鞘内生成时表示鞘内生成IgGIgG。4，鞘内，鞘内TPTP特异性特异性IgGIgG生成判断；生成判断；1 1）TPHATPHA指数指数CSFTPHACSFTPHA滴度滴度/ /白蛋
35、白系数白蛋白系数X10X103 3 70 500500表明鞘内生成表明鞘内生成TPTP特异性特异性IgGIgG和活动性神经梅毒和活动性神经梅毒2 2）改良）改良TPHATPHA指数指数CSFTPHACSFTPHA滴度滴度/ /血清血清TPHATPHA滴度滴度 白蛋白系数白蛋白系数 为正常鞘内生成为正常鞘内生成TPTP特异性特异性IgGIgG； 22神经梅毒。神经梅毒。3 3）鞘内）鞘内TPTP抗体抗体 CSFTPHACSFTPHA滴度滴度X X血清血清IgGIgG 血清血清TPHATPHA滴度滴度XCSFXCSF总总IgGIgG为正常；为正常；22活动性神经梅毒。活动性神经梅毒。36Signi
36、ficance of laboratory findings for the diagnosis of neurosyphilis. v4545神经梅毒，神经梅毒，6767例对照病例。例对照病例。 假阴性率假阳性率TPHATPHA指数指数00改良TPPA指数2.252.2鞘内鞘内TPTP抗体指数抗体指数13.344.7Luger AF, et al. Int J STD AIDS. 2000 Apr;11(4):224-34.CSF-IgM测定37Detection of Immunoglobulin M in Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patient
37、s by ELISA. LEE JB,et al. CLIN. MICROBIOL.1986,24:736CSF-IgM测定37Detection of Immunoglobulin M in Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patients by ELISA.v特异性：特异性：98%testspecificityLEE JB,et al.Detection of Immunoglobulin M in Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patients by Enzyme-Linked Immunosorbent Assa
38、y. CLIN. MICROBIOL.1986,24:736检测脑脊液TPv29例有症状和无症状神例有症状和无症状神经梅毒梅毒CSFvPCR检测：治：治疗前、治前、治疗中、治中、治疗后后v结果：治果：治疗前前7例急性患者中例急性患者中5例阳性，例阳性，4例慢性例慢性患者均阴性，患者均阴性，16例无症状神例无症状神经梅毒中梅毒中2例阳性，例阳性，不幸的是不幸的是，DNA检测在治在治疗中和治中和治疗后后3年仍年仍为阳性。阳性。vNOORDHOEKJT,etal.CLIN.MICROBIOL.1991,29:197639 Detection by Polymerase Chain Reaction
39、of Treponema pallidum DNA in Cerebrospinal Fluid from Neurosyphilis Patients before and after Antibiotic Treatment19-SIgM19-SIgM测定：（文献较少）测定：（文献较少） 由于血脑屏障作用，是诊断神经梅毒较特由于血脑屏障作用，是诊断神经梅毒较特异的指标，但敏感性尚待探讨。异的指标，但敏感性尚待探讨。TP-DNATP-DNA检测敏感性高，但不适于判断病程检测敏感性高，但不适于判断病程及疗效。及疗效。 谢 谢 He who knows syphilis, knows medicine Sir William Osler
