已知基因序列的获取策略——兼谈引物设计与序列分析黄黄 钢钢第三军医大学遗传教研室第三军医大学遗传教研室2006.11.1. 获取序列信息，设计合适的引物选取相应的组织或细胞相应的组织或细胞，提取RNA并RTPCR扩增获得全长cDNA装入合适的克隆或表达载体，菌落菌落PCR、酶切与测序证实根据需要进一步进行亚克隆RNase H消化（可选） 一、如何获取已知目的基因的序列信息n先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能（）n进一步查找其核酸相关序列信息，常用数据库：Genebank、EBI、DDBJ 二、目的基因cDNA序列的获取方法ncDNA文库扫描nRT-PCRn人工合成 组织RNA的提取n在匀浆器中加工冷冻的组织n通过注射器加工冷冻的组织n在液氮中将组织研磨成粉末在液氮中将组织研磨成粉末n在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解更完全，产量比前二者多一倍n合适的合适的RNA提取方法加上合适的组织处提取方法加上合适的组织处理方法，才能够获得最佳的提取效果理方法，才能够获得最佳的提取效果 RNA提取两要素n忌讳贪多忌讳贪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上组织，一般50mg用1mlTrizol较合适n速战速决速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话，可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即高速离心（14,000rpm,5min），..... 总之尽量快速！ 尽量减少RNAase污染nRNase的危害主要集中在将RNA pellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。
n注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备n长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶解总RNA沉淀 如何确认RNA的质量nRNA的电泳图谱的电泳图谱n检测RNA溶液的吸光度n保温试验n荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生物分析仪分析 28S18S5S RT引物的选用nGSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR但是引物设计质量影响RT的结果在扩增低丰度的转录本时是最好的nOligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；n随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录 RT中提高合成全长cDNA的效率n消除mRNA 二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA 模板进行短暂的热变性, 可破坏mRNA 二级结构, 促进锚定引物与模板的正确配对n选用RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶： Thermoscript、Superscript Ⅲ等，RT后建议进行RNase H消化处理n锚定RT引物的选用：5'–(T)25V N–3‘n热启动RTn有条件者选用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA 小于小于5微克微克可自己找公司合成可自己找公司合成建议用热盖建议用热盖PCR仪仪或空气浴孵箱保温或空气浴孵箱保温建议选用建议选用RNase H消化消化 高保真DNA 多聚酶的选用n常用高保真DNA 多聚酶：如Pfu、Deep Vent、Vent、Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等nPCR过程中HotStart与Touchdown的使用n高保真DNA 多聚酶与普通rTaq的混合使用nPCR产物加A尾进行T-A克隆：循环即将结束时加入rTaq 5U 72 ℃保温20～30 minn两步变温法PCR 载体构建中的常见问题n利用单酶切位点将片段插入载体n双酶切中的问题n对过长cDNA片段:可分段扩增，再利用RE位点或重叠延伸融合成全长cDNAn酶切位点甲基化的问题 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC 真核表达载体的选择nPromoter Conventional/Tissue-Specific/InduciblenPoly (A) tailnKozak序列：－9GCCGCCA/GCCAUGG＋4 一个载体内的多基因表达nIRES系统n加linker直接融合表达n多个独立的表达 cassettes：优于共转染表达 SOE技术与基因人工合成及多基因融合技术与基因人工合成及多基因融合n基因设计与人工合成中的密码子优化nDNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002) SOE：：Spliced by overlapping extension 搭桥技术融合基因搭桥技术融合基因 三、引物设计引物设计的引物设计的3条基本原则：条基本原则：n引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补n引物与引物之间避免形成稳定的二聚体引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，或发夹结构，n引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应聚合反应(即错配即错配)。
引物设计注意事项n引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp n引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配n引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响 n5’端序列的修饰与标记端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5‘端限制酶位点外再加1-3个保护碱基n简并引物简并引物：应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3’端应不存在简并性端应不存在简并性否则可能由于产量低而看不见扩增产物n同源性或互补性同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性nGC含量：含量：一般为40-60%另外，上下游引物的GC含量不能相差太大 nTm值：值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳有多种计算方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) n△△G值：值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。
应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行 n引物设计n限制性内切酶位点分析nDNA基元(motif)查找n同源性分析 四、测序图比对、拼接与虚拟克隆(in silico cloning)n常用本地软件：Clone manager、Vector NTI、DNAstar和ds-Gene等n工具：BLAST等 常用序列拼接软件nDNAstar 的SeqMan模块nVectorNTI程序的Contig Express模块nSequencher 开始开始→所有程序所有程序→DNAstar →SeqMan新的拼接任务新的拼接任务 添加序列添加序列打开保存序列的文件夹打开保存序列的文件夹选择序列选择序列导入导入 整理一下末端整理一下末端用鼠标拖动手用鼠标拖动手动更改末端动更改末端用鼠标点击更改序用鼠标点击更改序列方向和形式列方向和形式选择载体选择载体 自动查找自动查找拼接拼接看看结果看看结果 点开测序图点开测序图6种阅读框种阅读框选择的序选择的序列的位置列的位置NCBI查询所选择的序列查询所选择的序列 保存结果保存结果打印成打印成PDF文文件也是一个不件也是一个不错的选择错的选择 运行运行VNTI 程序程序Contig Express程序窗口，可以设定参数，程序窗口，可以设定参数，一般用默认值即可。
一般用默认值即可 导入测序结果（文导入测序结果（文件扩展名件扩展名ab1改成改成abi）相关软件）相关软件 EditView for Macs ；；Chroma for Windows] 也可以用鼠标右键也可以用鼠标右键 导入后可以双击查看和编辑各个测序结果导入后可以双击查看和编辑各个测序结果 选择序列，根据实际情况调整序列末端选择序列，根据实际情况调整序列末端 选择序列拼接选择序列拼接 双击查看结果双击查看结果 输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧 开始开始→所有程序所有程序导入序列导入序列选择序列选择序列此界面调整参数此界面调整参数详细说明详细说明 拼接拼接双击查看结果双击查看结果 输出结果输出结果 。