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1、实验二实验二细菌革兰氏染色细菌革兰氏染色一、实验目的一、实验目的n n学习微生物制片、染色的基本技术学习微生物制片、染色的基本技术学习微生物制片、染色的基本技术学习微生物制片、染色的基本技术n n掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术n n进一步观察细菌的基本形态进一步观察细菌的基本形态进一步观察细菌的基本形态进一步观察细菌的基本形态（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。二、实验原理二、实验原理 革兰氏染色革兰氏染色1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
2、初染2、用碘溶液进行、用碘溶液进行媒染媒染，其作用是提高染料和细，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。3、用乙醇或丙酮冲洗进行、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色脱色。在经历脱色后。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。胞呈无色。4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行涂片进行复染复染。例如沙黄，它使原来无色的。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌
3、最后呈现桃红到红色，而革革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色兰氏阳性细菌继续保持深紫色三、实验材料三、实验材料1 1、菌种：大肠杆菌（）、枯草杆菌（）、菌种：大肠杆菌（）、枯草杆菌（）2 2、染料：结晶紫、复红、碘液等、染料：结晶紫、复红、碘液等3 3、材料：、材料：95%95%酒精等酒精等n n涂片涂片涂片涂片 风干风干风干风干 固定固定固定固定 初染初染初染初染 水洗水洗水洗水洗 媒染媒染媒染媒染 水洗水洗水洗水洗 脱色脱色脱色脱色 水洗水洗水洗水洗 复染复染复染复染 水洗水洗水洗水洗 干燥干燥干燥干燥 镜检镜检镜检镜检四、实验方法四、实验方法（一）革兰氏染色
4、（一）革兰氏染色菌悬液菌悬液菌悬液菌悬液涂片涂片涂片涂片干燥干燥干燥干燥滴加无滴加无滴加无滴加无菌水菌水菌水菌水固定固定固定固定取菌苔取菌苔取菌苔取菌苔涂片涂片涂片涂片Smear preparation Heat fixingcrystal violet stain wash with water Staining Counterstain with Safranin 注意事项：注意事项：（1 1 1 1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不
5、易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（2 2 2 2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革足，革足，革足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。兰
6、氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。（3 3 3 3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。（4 4 4 4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。五、思考题五、思考题1 1、讲述革兰氏染色的原理，并指出和分别属于革兰氏阳、讲述革兰氏染色的原理，并指出和分别属于革兰氏阳性或阴
7、性？性或阴性？2 2、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色成败的关键一步是什么？成败的关键一步是什么？3 3、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色、当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色技术和结果的正确性？技术和结果的正确性？实验三实验三真菌形态观察及真菌形态观察及微生物菌落形态比较微生物菌落形态比较 一、实验目的一、实验目的n n学习自制水浸片观察真菌形态的方法学习自制水浸片观察真菌形态的方法学习自制水浸片观察真菌形态的方法学习自制水浸片观察真菌形态的方法n n观察丝状真菌和酵母菌的形态观察丝状真菌和酵母菌的形态观察
8、丝状真菌和酵母菌的形态观察丝状真菌和酵母菌的形态n n比较细菌、真菌和放线菌的菌落形态比较细菌、真菌和放线菌的菌落形态比较细菌、真菌和放线菌的菌落形态比较细菌、真菌和放线菌的菌落形态二、实验原理二、实验原理 真菌形态结构比细菌复杂。习惯上，真真菌形态结构比细菌复杂。习惯上，真菌可分为酵母菌和霉菌。菌可分为酵母菌和霉菌。 霉菌由粗大、有隔或无隔分支状菌丝构霉菌由粗大、有隔或无隔分支状菌丝构成，菌丝分为基内菌丝、气生菌丝。气生菌成，菌丝分为基内菌丝、气生菌丝。气生菌丝特化结构上产生多种无性、有性孢子，孢丝特化结构上产生多种无性、有性孢子，孢子着生部位、排列方式以及孢子形态可作为子着生部位、排列方式
9、以及孢子形态可作为真菌鉴定的重要依据。真菌鉴定的重要依据。1 1、根霉、根霉、根霉、根霉菌丝特化形成假根等特化菌丝菌丝特化形成假根等特化菌丝菌丝特化形成假根等特化菌丝菌丝特化形成假根等特化菌丝1 1、根霉、根霉孢囊孢子（无性繁殖）孢囊孢子（无性繁殖）2 2、曲霉、青霉、曲霉、青霉分生孢子（无性繁殖）分生孢子（无性繁殖）3 3 3 3、犁头霉、犁头霉、犁头霉、犁头霉接合孢子（有性繁殖）接合孢子（有性繁殖）接合孢子（有性繁殖）接合孢子（有性繁殖）4 4、酵母菌、酵母菌 酵母菌是单细胞构造，个体形态多为卵圆形、圆柱形，酵母菌是单细胞构造，个体形态多为卵圆形、圆柱形，但有时某些酵母菌可形成假菌丝。酵母
10、菌无性繁殖以出芽但有时某些酵母菌可形成假菌丝。酵母菌无性繁殖以出芽方式生殖。方式生殖。微生物的菌落形态微生物的菌落形态 菌落：单个菌体在固体平面培养基上生长繁殖形成的肉菌落：单个菌体在固体平面培养基上生长繁殖形成的肉眼可见的群体。眼可见的群体。 区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态胞形态（个体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态的集中反映，因此每一大类微生物都有其一定的菌落特征，的集中反映，因此每一大类微生物都有其一定的菌落特征，可通过这些特征差异区分和识别。可通过这些特征差异区
11、分和识别。 特征描述：特征描述：形状、大小、颜色、边缘、隆起、光泽、质形状、大小、颜色、边缘、隆起、光泽、质地等地等。微生物在固体培养基上的群体生长微生物在固体培养基上的群体生长细菌菌落特征：细菌菌落特征：细菌菌落特征：细菌菌落特征：凝胶状、表面较光滑、湿润、与培养基结合不紧密，凝胶状、表面较光滑、湿润、与培养基结合不紧密，易挑取，正反颜色一致。易挑取，正反颜色一致。酵母菌菌落特征（与细菌相似酵母菌菌落特征（与细菌相似酵母菌菌落特征（与细菌相似酵母菌菌落特征（与细菌相似) ) ) ) ：比细菌大而厚，不透明，表面光滑、湿润、粘稠，比细菌大而厚，不透明，表面光滑、湿润、粘稠，易用针挑起。多呈乳白
12、色易用针挑起。多呈乳白色。放线菌菌落特征放线菌菌落特征放线菌菌落特征放线菌菌落特征: : : :致密、坚硬、多皱、不易用针挑起，不透明。孢致密、坚硬、多皱、不易用针挑起，不透明。孢子成熟后，表面粉末状，干燥子成熟后，表面粉末状，干燥( (常有土腥味常有土腥味) )。三、实验材料三、实验材料1 1 1 1、制片观察：曲霉、根霉、青霉、犁头霉、酿酒酵母、制片观察：曲霉、根霉、青霉、犁头霉、酿酒酵母、制片观察：曲霉、根霉、青霉、犁头霉、酿酒酵母、制片观察：曲霉、根霉、青霉、犁头霉、酿酒酵母2 2 2 2、菌落观察：、菌落观察：、菌落观察：、菌落观察：（1 1 1 1）霉菌：曲霉、根霉、青霉、犁头霉）
13、霉菌：曲霉、根霉、青霉、犁头霉）霉菌：曲霉、根霉、青霉、犁头霉）霉菌：曲霉、根霉、青霉、犁头霉（2 2 2 2）酵母菌：红酵母、酿酒酵母）酵母菌：红酵母、酿酒酵母）酵母菌：红酵母、酿酒酵母）酵母菌：红酵母、酿酒酵母（3 3 3 3）细菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）细菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）细菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）细菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（4 4 4 4）放线菌：）放线菌：）放线菌：）放线菌：S11S11S11S11、S14S14S14S14（平板一套可打开用于显微观察，一套不用打开用于菌（平板一套可打开用于显微观察，一套不用打开用于菌（平板一套可打开用于显微观察，一套不用打
14、开用于菌（平板一套可打开用于显微观察，一套不用打开用于菌落形态观察）落形态观察）落形态观察）落形态观察）四、实验方法四、实验方法（一）水浸片观察真菌形态（一）水浸片观察真菌形态（一）水浸片观察真菌形态（一）水浸片观察真菌形态1 1 1 1、根霉、曲霉、青霉和犁头霉、根霉、曲霉、青霉和犁头霉、根霉、曲霉、青霉和犁头霉、根霉、曲霉、青霉和犁头霉在载玻片上滴加一滴蒸馏在载玻片上滴加一滴蒸馏水，用接种针以无菌操作方式挑取少许菌丝于蒸馏水中充分水，用接种针以无菌操作方式挑取少许菌丝于蒸馏水中充分展开（借助另一接种针），盖上盖玻片（从一边向另一边覆展开（借助另一接种针），盖上盖玻片（从一边向另一边覆盖，避
15、免产生气泡）。盖，避免产生气泡）。2 2、酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌用吸管吸取一滴酵母细胞悬液，盖上盖玻片。用吸管吸取一滴酵母细胞悬液，盖上盖玻片。p镜检：用低、高倍镜观察细胞形态。镜检：用低、高倍镜观察细胞形态。（二）观察比较各种微生物菌落（二）观察比较各种微生物菌落（二）观察比较各种微生物菌落（二）观察比较各种微生物菌落 分别观察各类微生物的菌落的大小，表面粗糙及分别观察各类微生物的菌落的大小，表面粗糙及含水分状况，边缘，致密程度、透明程度及厚度等特含水分状况，边缘，致密程度、透明程度及厚度等特征，并填写记录表。征，并填写记录表。五、思考题五、思考题1 1 1 1、绘图表示观察到的四种霉菌及酵母菌的形态，并标注其、绘图表示观察到的四种霉菌及酵母菌的形态，并标注其、绘图表示观察到的四种霉菌及酵母菌的形态，并标注其、绘图表示观察到的四种霉菌及酵母菌的形态，并标注其中的特征性结构。中的特征性结构。中的特征性结构。中的特征性结构。2 2 2 2、列表比较各种微生物菌落的形态特征。（格式可参考书、列表比较各种微生物菌落的形态特征。（格式可参考书、列表比较各种微生物菌落的形态特征。（格式可参考书、列表比较各种微生物菌落的形态特征。（格式可参考书P74P74P74P74）
