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1、多糖分离纯化及含量测评方法多糖的提取方法l1. 溶剂提取法溶剂提取法 水水提提醇醇沉沉法法、酸酸提提法法、碱碱提提法法、超超临临界界流体萃取法流体萃取法l2. 酶解提取法酶解提取法 单一酶解法、复合酶解法单一酶解法、复合酶解法l3. 强化提取法强化提取法 超超声声波波辅辅助助提提取取法法、微微波波辅辅助助提提取取法法、高压脉冲法高压脉冲法 1. 溶剂法：水提醇沉法l多多糖糖是是极极性性大大分分子子化化合合物物，提提取取时时应应选选择择水水、醇醇等等极极性性强强的的溶溶剂剂。水水提提醇醇沉沉法法是提取多糖最常用的一种方法。是提取多糖最常用的一种方法。l用用水水作作溶溶剂剂来来提提取取多多糖糖时时
2、，可可以以用用热热水水浸浸煮煮提提取取，也也可可以以用用冷冷水水浸浸提提渗渗漉漉，然然后后将将提提取取液液浓浓缩缩后后，在在浓浓缩缩液液中中加加乙乙醇醇，使使其其最最终终体体积积分分数数达达到到70 %左左右右，利利用用多多糖糖不不溶溶于于乙乙醇醇的的性性质质，使使多多糖糖从从提提取取液液中中沉沉淀淀出出来来，室室温温静静置置一一定定的的时时间间，多糖的质量分数和得率均较高。多糖的质量分数和得率均较高。l影影响响多多糖糖提提取取率率的的因因素素有有：水水的的用用量量、提提取取温温度度、浸浸提提固固液液比比、提提取取时时间间以以及及提取次数等。提取次数等。l该该种种方方法法提提取取多多糖糖不不需
3、需特特殊殊设设备备，生生产产工工艺艺成成本本低低，安安全全，适适合合工工业业化化大大生生产产，是一种可取的提取方法。是一种可取的提取方法。l但但由由于于水水的的极极性性大大，容容易易把把蛋蛋白白质质、苷苷类类等等水水溶溶性性的的成成分分浸浸提提出出来来，从从而而使使提提取取液液存存放放时时腐腐败败变变质质，为为后后续续的的分分离离带带来来困困难难，且且该该法法提提取取比比较较耗耗时时，提提取取率率也不高。也不高。溶剂法：酸提法l为为了了提提高高多多糖糖的的提提取取率率，在在水水提提醇醇沉沉法法的基础上发展了酸提取法。的基础上发展了酸提取法。l如如某某些些含含葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸等等酸酸性性基基
4、团团的的多多糖糖在较低在较低pH 值下难以溶解；值下难以溶解；l含含有有胺胺基基的的多多糖糖可可使使用用乙乙酸酸或或盐盐酸酸调调节节提提取取液液成成酸酸性性进进行行提提取取，然然后后再再加加乙乙醇醇使使多多糖糖沉沉淀淀析析出出，也也可可加加入入铜铜盐盐等等生生成成不溶性络合物或盐类沉淀而析出不溶性络合物或盐类沉淀而析出。l影影响响多多糖糖提提取取率率的的因因素素有有：水水的的用用量量、pH值值、提提取取温温度度、浸浸提提固固液液比比、提提取取时时间以及提取次数等。间以及提取次数等。l由由于于H的的存存在在抑抑制制了了酸酸性性杂杂质质的的溶溶出出，稀稀酸酸提提取取法法提提取取得得到到的的多多糖糖
5、产产品品纯纯度度相相对较高；对较高；l但但在在酸酸性性条条件件下下可可能能引引起起多多糖糖中中糖糖苷苷键键的的断断裂裂，且且酸酸会会对对容容器器造造成成腐腐蚀蚀，除除弱弱酸酸外外，一一般般不不宜宜采采用用。 因因此此酸酸提提法法也也存存在一定的不足之处在一定的不足之处。溶剂法：碱提法l有有的的酸酸性性多多糖糖, 或或分分子子量量较较大大的的多多糖糖, 在在热热水水中中溶溶解解度度不不大大, 一一般般在在稀稀碱碱溶溶液液中中溶溶解解度度较较大大, 所所以以常常用用稀稀的的NaOH 溶溶液液或或Na2CO3 溶溶液液提提取取。不不过过用用稀稀碱碱溶溶液液提提取取时时, 提提取取温温度度必必须须保保
6、持持在在10 以以下下, 否否则则多糖容易发生降解反应。多糖容易发生降解反应。 l多多糖糖在在碱碱性性溶溶液液中中稳稳定定，例例如如粘粘多多糖糖的的提取多采用碱提取法。提取多采用碱提取法。l多多糖糖碱碱法法提提取取虽虽然然可可提提高高多多糖糖的的收收率率, 且且可可缩缩短短提提取取时时间间, 但但提提取取液液中中含含有有其其它它杂杂质质如如蛋蛋白白质质, 粘粘度度过过大大, 过过滤滤困困难难, 且且有有些些多糖在碱性较强时会水解。多糖在碱性较强时会水解。l通通常常先先用用热热水水法法提提取取, 然然后后残残渣渣再再用用稀稀碱碱溶溶液液提提取取, 这这样样可可将将大大部部分分多多种种类类型型的的
7、多多糖提取出来。糖提取出来。溶剂法：超临界流体萃取法l超超临临界界流流体体是是指指物物质质处处于于临临界界温温度度和和临临界界压压力力以以上上时时的的状状态态，这这种种流流体体兼兼有有液液体体和和气气体体的的特特点点，即即密密度度大大，粘粘稠稠度度小小，有有极极高高的的溶溶解解，渗渗透透到到提提取取材材料料的的基基质质中中，发发挥挥非非常常有有效效的的萃萃取取功功能能。而而且且这这种种溶溶解解能能力力随随着着压压力力的的升升高高而而增增大大，提提取取结结束束后后，再再通通过过减减压压将将其其释释放放出出来来，具具有有保保持持有有效效成成分分的的活活性性和和无无溶溶剂剂残残留留等优点。等优点。l
8、超超临临界界流流体体萃萃取取技技术术是是近近年年来来发发展展起起来来的的一一种种新新的的提提取取分分离离技技术术。由由于于CO2 的的超超临临界界条条件件（TC31.26 ，Tp7.38 MPa）容容易易达达到到，常常作作为为超超临临界界萃萃取取的的溶溶剂剂，在在压压力力为为840 MPa 时时的的超超临临界界CO2 足足以以溶溶解解任任何何非非极极性性、中中极极性性化化合合物，在加入夹带剂后则可溶解极性化物。物，在加入夹带剂后则可溶解极性化物。l由由于于糖糖类类的的化化合合物物分分子子量量较较大大、羟羟基基多多、极极性性大大，用用纯纯二二氧氧化化碳碳提提取取产产率率较较低低，加加入入夹夹带带
9、剂剂或或加加大大压压力力则则可可提提高高提提取取率率。该该法法的的缺缺点点是是设设备备复复杂杂，运运行行成成本本高高，提取范围有限。提取范围有限。2. 酶解法：单一酶解法l单单一一酶酶解解法法是是指指使使用用一一种种酶酶来来提提取取多多糖糖，从从而而提提高高提提取取率率的的生生物物技技术术。其其中中经经常常使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。使用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。l 蛋蛋白白酶酶对对植植物物细细胞胞中中游游离离的的蛋蛋白白质质具具有有分分解解作作用用，使使其其结结构构变变得得松松散散；蛋蛋白白酶酶还还会会使使糖糖蛋蛋白白和和蛋蛋白白聚聚糖糖中中游游离离的的蛋蛋白白质质水水解解，降降低低它它们
10、们对对原原料料的的结结合合力力，有有利于多糖的浸出。利于多糖的浸出。l纤纤维维素素酶酶则则能能特特异异性性地地降降解解纤纤维维素素，使使植植物物细细胞胞的的细细胞胞壁壁破破裂裂，有有利利于于多多糖糖易易从胞内释放。从胞内释放。l影影响响因因素素：酶酶种种类类和和添添加加量量、酶酶解解温温度度()、酶酶解解pH 值值、水水解解时时间间、料料液液比比有有直接关系。直接关系。酶解法：复合酶解法l复复合合酶酶解解法法采采用用一一定定比比例例的的果果胶胶酶酶、纤纤维维素素酶酶及及中中性性蛋蛋白白酶酶，主主要要利利用用纤纤维维素素酶酶和和果果胶胶酶酶水水解解纤纤维维素素和和果果胶胶，使使植植物物组组织织细
11、细胞胞的的细细胞胞壁壁破破裂裂，释释放放细细胞胞壁壁内内的的活活性性多多糖糖，多多糖糖释释放放的的多多少少和和复复合合酶酶的的加加入入量量、酶酶解解温温度度、酶酶解解时时间间、酶酶解解pH 值及料液比有直接的关系。值及料液比有直接的关系。l酶酶解解法法提提取取的的实实质质是是通通过过酶酶解解反反应应强强化化传传质质过过程程。该该法法具具有有条条件件温温和和、杂杂质质易易除和得率高等优点。除和得率高等优点。3. 物理强化法：超声波辅助提取法l超超声声波波是是频频率率高高于于20kHz的的声声波波，它它方方向向性性好好，穿穿透透能能力力强强，易易于于获获得得较较集集中中的的声能。声能。 l超超声声
12、波波提提取取是是利利用用超超声声波波的的机机械械效效应应、空化效应及热效应。空化效应及热效应。l机机械械效效应应可可增增大大介介质质的的运运动动速速度度及及穿穿透透力力，能能有有效效的的破破碎碎生生物物细细胞胞和和组组织织，从从而使提取的有效成分溶解于溶剂之中；而使提取的有效成分溶解于溶剂之中；l空空化化作作用用, 形形成成高高温温和和高高压压的的环环境境, 增增加加物物质质分分子子运运动动的的频频率率和和速速度度、溶溶剂剂的的穿穿透透力力, 从从而而加加速速目目标标成成分分进进入入溶溶剂剂, 提提高高提取率。提取率。 l热热效效应应增增大大了了有有效效成成分分的的溶溶解解速速度度，这这种种热
13、热效效应应是是瞬瞬间间的的，可可使使被被提提取取成成分分的的生物活性尽量保持不变。生物活性尽量保持不变。l影影响响因因素素有有：超超声声波波的的频频率率、功功率率、温温度度、时时间间、料料液液比比、超超声声波波发发生生器器的的型型式。式。l超超声声提提取取可可极极大大地地提提高高提提取取效效率率, 节节约约溶溶剂剂, 避避免免高高温温对对提提取取成成分分的的影影响响, 与与常常规规提提取取法法相相比比, 具具有有提提取取时时间间短短、产产率率高高、无需加热等优点。无需加热等优点。l值值得得注注意意的的是是超超声声时时间间不不宜宜过过长长,否否则则提提取取量量反反而而下下降降, 原原因因可可能能
14、是是由由于于超超声声处处理理时时间间过过长长, 导导致致多多糖糖结结构构发发生生变变化化, 糖糖链链断裂断裂, 使多糖提取含量下降。使多糖提取含量下降。物理强化法：微波辅助提取法l微微波波是是指指波波长长在在1mm到到1m范范围围（相相对对频频率率为为300 300000MHz）的的电电磁磁波波，介介于于红外与无线电波之间。红外与无线电波之间。l微微波波协协助助萃萃取取植植物物药药材材时时，一一方方面面是是利利用用微微波波透透过过萃萃取取剂剂到到达达物物料料内内部部，由由于于物物料料腺腺细细胞胞系系统统含含水水量量高高，水水分分子子吸吸收收微微波波能能，产产生生大大量量的的热热量量，所所以以能
15、能快快速速被被加加热热，使使胞胞内内温温度度迅迅速速升升高高，液液态态水水汽汽化化产产生生的的压压力力将将细细胞胞膜膜和和细细胞胞壁壁冲冲破破，形成微小的孔洞。形成微小的孔洞。l进进一一步步加加热热，导导致致细细胞胞内内部部和和细细胞胞壁壁水水分分减减少少，细细胞胞收收缩缩，表表面面出出现现裂裂纹纹。孔孔洞洞或或裂裂纹纹的的存存在在使使胞胞外外溶溶剂剂容容易易进进入入细细胞胞内内，溶溶解解并并释释放放出出胞胞内内有有效效成成分分，再再扩散到萃取剂中；扩散到萃取剂中；l另另一一方方面面，在在固固液液萃萃取取过过程程中中，固固体体表表面面的的液液膜膜通通常常是是由由极极性性强强的的萃萃取取剂剂所所
16、组组成成，在在微微波波辐辐射射作作用用下下，强强极极性性分分子子将将瞬瞬时时极极化化，并并以以每每秒秒2.45109次次的的速速度度做做极极性性变变换换运运动动，这这就就可可能能对对液液膜膜层层产产生生一一定定的的微微观观“扰扰动动”影影响响，使使附附在在固固相相周周围围的的液液膜膜变变薄薄，溶溶剂剂与与溶溶质质之之间间的的结结合合力力受受到到一一定定程程度度的的削削弱弱，从从而而使使固固液液浸浸取取的的扩扩散散过过程程所所受受的的阻阻力力减减小小，促促进进扩散过程的进行。扩散过程的进行。l在在微微波波协协助助浸浸取取过过程程中中，萃萃取取剂剂种种类类、微微波波剂剂量量、物物料料含含水水量量、
17、温温度度、萃萃取取时时间间及及pH值值等等都都对对萃萃取取效效果果产产生生影影响响。其其中中，萃萃取取剂剂种种类类、微微波波作作用用时时间间和和温温度度对萃取效果影响较大。对萃取效果影响较大。l微微波波辅辅助助提提取取多多糖糖和和其其他他的的萃萃取取方方法法比比较较，微微波波萃萃取取效效率率高高，操操作作简简单单，且且不不会会引引入入杂杂质质，多多糖糖纯纯度度高高，能能耗耗小小，操操作作费费用用低低，符符合合环环境境保保护护要要求求，是是很很好好的多糖提取方法。的多糖提取方法。物理强化法：高压脉冲法l高高压压脉脉冲冲法法是是对对两两电电极极间间的的流流态态物物料料反反复复施施加加高高电电压压的
18、的短短脉脉冲冲（典典型型为为2080 kV/cm）进行处理。）进行处理。l动动物物、植植物物、微微生生物物的的细细胞胞，在在外外加加电电场场作作用用下下，产产生生横横跨跨膜膜电电位位，绝绝缘缘的的生生物物膜膜由由于于电电场场形形成成了了微微孔孔，通通透透性性发发生生变变化化，当当整整个个膜膜电电位位达达到到极极限限值值(约约为为1V)时时，膜膜破破裂裂，膜膜结结构构变变成成无无序序状状态态，形形成成细细孔孔，渗渗透透能能力力增增强强。电电位位差差达达到到临临界界点点，细细胞胞破破裂裂。从从而而有有利利于于多多糖糖的的提取。提取。二、多糖的分离纯化l1. 除蛋白除蛋白 Sevage 法法、三三氯
19、氯乙乙酸酸法法、三三氟氟三三氯氯乙乙烷烷法法l2. 色素的去除色素的去除 吸吸附附法法（DEAE-纤纤维维素素、硅硅藻藻土土等等）、氧化法（过氧化氢）、离子交换法氧化法（过氧化氢）、离子交换法 l3. 多糖的纯化多糖的纯化 超超滤滤法法、季季胺胺盐盐沉沉淀淀法法、柱柱层层析析法法和和色色谱法等谱法等1. 除蛋白l采采用用醇醇沉沉或或其其它它溶溶剂剂沉沉淀淀得得到到的的粗粗多多糖糖中常含有较多的蛋白质中常含有较多的蛋白质, 需要除蛋白。需要除蛋白。l除除蛋蛋白白的的方方法法传传统统上上有有Sevage 法法、三三氯氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等。乙酸法、三氟三氯乙烷法等。 Sevage 法l根根据据
20、蛋蛋白白质质在在氯氯仿仿等等有有机机溶溶剂剂中中变变性性的的特特点点，用用V(氯氯仿仿) V(戊戊醇醇或或正正丁丁醇醇)为为5 1 或或4 1，混混合合物物剧剧烈烈振振摇摇2030 min，蛋蛋白白质质变变性性生生成成凝凝胶胶，离离心心分分离离，分分去去水水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。层和溶剂层交界处的变性蛋白质。l一般按多糖水溶液的一般按多糖水溶液的1/51/4体积加入。体积加入。l此此种种方方法法只只能能除除去去少少量量蛋蛋白白质质，须须反反复复多多次次，多多糖糖有有损损失失，得得率率不不高高, 且且氯氯仿仿对对人体也有一定毒性人体也有一定毒性, 操作时应注意。操作时应注意。l该该法法优
21、优点点是是条条件件温温和和, 可可避避免免多多糖糖的的降降解解。利利用用蛋蛋白白酶酶可可水水解解蛋蛋白白质质的的特特性性, 在在多多糖糖样样品品溶溶液液中中加加入入一一些些蛋蛋白白质质水水解解酶酶如如中中性性蛋蛋白白酶酶和和糜糜蛋蛋白白酶酶, 再再用用Sevage 法法效效果果更佳。更佳。 l此此法法不不能能除除去去脂脂蛋蛋白白，因因为为脂脂蛋蛋白白溶溶于于氯仿。氯仿。三氯乙酸法l三三氯氯乙乙酸酸是是一一种种有有机机酸酸，使使多多糖糖提提取取液液中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。中的蛋白质与有机酸作用而变性沉淀。l该该法法是是在在多多糖糖水水提提液液中中滴滴加加5%10%与与多多糖糖水水提提取
22、取液液等等体体积积的的三三氯氯乙乙酸酸，混混匀匀静静置置过过夜夜，离离心心除除去去胶胶状状沉沉淀淀，重重复复以以上上的的操操作作直直至至溶溶液液不不再再继继续续混混浊浊为为止止，得无蛋白质的多糖。得无蛋白质的多糖。l三三氯氯乙乙酸酸浓浓度度越越大大，除除蛋蛋白白质质效效果果越越好好，但但对对多多糖糖的的影影响响也也越越大大，可可能能是是三三氯氯乙乙酸酸对对多多糖糖结结构构具具有有破破坏坏作作用用，使使多多糖糖降降解解，而而且且这这种种破破坏坏作作用用随随着着三三氯氯乙乙酸酸浓浓度增大而增强。度增大而增强。三氟三氯乙烷法l将将多多糖糖溶溶液液与与三三氟氟三三氯氯乙乙烷烷等等体体积积混混合合，低低
23、温温搅搅拌拌10 min 左左右右，离离心心分分离离得得上上层层水水层层，水水层层继继续续用用上上述述方方法法反反复复处处理理几几次次，得得无无蛋蛋白白质质的的多多糖糖溶溶液液，此此法法效效率率较较Seavg 法法高高，但但溶溶剂剂沸沸点点低低，易易挥挥发发，不宜大量应用。不宜大量应用。2. 色素的去除l中中草草药药来来源源的的多多糖糖, 可可能能含含有有酚酚型型化化合合物物而而颜颜色色较较深深, 这这类类色色素素大大多多呈呈负负性性离离子子,不不能能用用活活性性炭炭吸吸附附剂剂脱脱色色, 可可以以用用弱弱碱碱性性树树脂脂DEAE-纤纤维维素素来来吸吸附附色色素素，这这样样不不仅仅可可以以达达
24、到到脱脱色色的的目目的的, 而而且且可可以以进进行行多多糖糖的分离。的分离。l若若多多糖糖与与色色素素结结合合, 易易被被DEAE 纤纤维维素素吸吸附附, 不不能能被被水水洗洗脱脱, 这这类类色色素素可可用用低低温温氧氧化化法法脱脱色色，温温度度较较高高下下氧氧化化易易引引起起多多糖糖的降解。的降解。 l对对于于同同时时含含有有游游离离蛋蛋白白质质和和色色素素的的多多糖糖, 可可通通过过生生成成金金属属络络合合物物的的方方法法以以同同时时除除去去蛋蛋白白和和色色素素, 方方法法是是加加入入菲菲林林试试剂剂、氯氯化化铜铜、氢氢氧氧化化钡钡和和醋醋酸酸铅铅等等与与多多糖糖生生成成不不溶溶性性络络合
25、合物物, 经经分分离离后后用用阴阴离离子子交交换换树树脂分解络合物得到多糖。脂分解络合物得到多糖。 3. 多糖的纯化l 超滤法超滤法 l 季胺盐沉淀法季胺盐沉淀法 l 柱层析法柱层析法 l 色谱法色谱法 l 其他方法其他方法超滤法 l膜膜 分分 离离 技技 术术 （ membrane separation technology，MST）是是一一种种高高效效分分离离技技术术，分分离离过过程程以以选选择择透透过过性性膜膜作作为为分分离离介介质质，通通过过在在膜膜两两侧侧施施加加某某种种推推动动力力（压压力力差差、化化学学位位差差、电电位位差差等等），使使原原料料液液中中组组分分有有选选择择性性的的
26、通通过过膜膜。目目前前应应用用较较多多的的是是超超滤滤和和微微滤滤技技术术。如如采采用用中中空空纤纤维维超超滤滤膜膜, 对对多多糖糖去去蛋蛋白白质质后后的的提提取取液液通通过过超超滤去除小分子杂质。滤去除小分子杂质。季胺盐沉淀法l季季铵铵盐盐及及其其氢氢氧氧化化物物是是一一类类乳乳化化剂剂, 可可与与酸酸性性糖糖形形成成不不溶溶性性沉沉淀淀, 常常用用于于酸酸性性多多糖糖的的分分离离。当当溶溶液液的的pH 值值增增高高或或加加入入硼硼砂砂缓缓冲冲液液使使糖糖的的酸酸度度增增高高, 也也会会与与中中性性多多糖糖形成沉淀。形成沉淀。l常常用用的的季季铵铵溴溴化化物物(CTAB) 及及其其氢氢氧氧化
27、化物物(CTA-OH) 和和十十六六烷烷基基氯氯化化吡吡啶啶 (CPC) , 其其浓浓度度一一般般为为1% 10% (W /V ), 它它们们可可在在酸酸性性、中中性性、微微碱碱性性和和碱碱性性中中分分级级沉沉淀分离出酸性多糖。淀分离出酸性多糖。 柱层析方法 l纤维素柱层析纤维素柱层析 l阴离子交换柱层析阴离子交换柱层析 l凝胶柱层析凝胶柱层析 l亲和层析亲和层析 纤维素柱层析l柱柱中中的的载载体体是是纤纤维维素素。先先用用乙乙醇醇液液将将柱柱内内纤纤维维素素平平衡衡好好, 然然后后将将多多糖糖混混合合物物全全部部沉沉淀淀于于惰惰性性的的纤纤维维素素上上面面。用用不不同同浓浓度度乙乙醇醇水水溶
28、溶液液(如如80%, 60%, 40%, 20% ) 梯梯度度洗洗脱脱, 则则不不同同多多糖糖就就依依次次洗洗脱脱出出来来。先先洗洗脱脱的的是是分分子子量量最最小小的的多多糖糖, 最最终终洗洗脱脱的的是是分分子子量量最最大大的的多多糖糖。在在洗洗脱脱过过程程中中, 由由于于各各种种多多糖糖在在柱柱上上进进行行无无数数次次的的溶溶解解和和沉淀过程沉淀过程, 最终将各种多糖分离开来。最终将各种多糖分离开来。l这这种种方方法法实实质质上上与与分分步步沉沉淀淀法法相相反反, 可可称称其其为为分分步步溶溶解解法法。其其理理论论塔塔板板数数较较高高, 所所以流出液的纯度高。以流出液的纯度高。l 但但该该法
29、法的的缺缺点点是是流流速速慢慢, 纯纯化化周周期期长长, 特特别别是是对对于于粘粘度度较较大大的的酸酸性性多多糖糖, 更更显显得得流流速过慢。速过慢。 阴离子交换柱层析 l至至今今应应用用最最广广泛泛的的阴阴离离子子交交换换剂剂有有二二乙乙基基氨氨基基乙乙基基纤纤维维素素(DEAE-cellulose) , DEAE-葡葡 聚聚 糖糖 (DEAE-Sephadex) 及及DEAE-琼琼脂脂糖糖(DEAE-Sepharose) 三三种种, 其其中中以以DEAE-cellulose 应应用用得得最最广广泛泛。DEAE-cellulose 具具有有开开放放性性的的骨骨架架, 多多糖糖能能自自由由进进
30、入入载载体体中中并并进进行行迅迅速速扩扩散散。它它有有较较大大的的比比表表面面积积, 虽虽然然其其离离子子交交换换容容量量仅仅为为0.70 0.75 mmol/g, 但但其其对对多多糖糖的的吸吸附量较离子交换树脂大许多。附量较离子交换树脂大许多。 l阴阴离离子子交交换换柱柱层层析析是是目目前前多多糖糖纯纯化化中中（也也是是柱柱层层析析中中）应应用用最最普普遍遍的的一一种种方方法法, 特特别别是是对对于于体体积积较较大大的的多多糖糖溶溶液液, 大大多多数数首首先先采采用用阴阴离离子子交交换换柱柱层层析析。通通过过柱柱层层析析, 多多糖糖溶溶液液得得到到浓浓缩缩及及初初步步纯纯化化(有有的的多多糖
31、糖通通过过该该步步骤骤即即可可得得到到各各种种均均一一多多糖组分糖组分)。 l由由于于纤纤维维素素上上的的离离子子交交换换基基团团较较少少, 排排列列疏疏散散且且呈呈弱弱碱碱性性, 所所以以对对大大分分子子的的吸吸附附较较弱弱, 用用一一定定离离子子浓浓度度的的盐盐就就可可将将其其洗洗脱脱下下来。来。 l阴阴离离子子交交换换柱柱层层析析适适合合于于分分离离各各种种酸酸性性、中中性性多多糖糖及及粘粘多多糖糖。它它的的分分离离机机理理包包括括离离子子交交换换, 而而更更重重要要的的是是吸吸附附与与解解吸吸附附, 所所以以其其不不仅仅可可应应用用于于中中性性多多糖糖与与酸酸性性多多糖糖的的分分离离,
32、 也也可可应应用用于于不不同同中中性性多多糖糖的的分分离。离。 凝胶柱层析 l根根据据多多糖糖分分子子的的大大小小和和形形状状的的不不同同即即按按分分子子筛筛的的原原理理进进行行分分离离的的。凝凝胶胶柱柱层层析析在在多多糖糖的的分分离离纯纯化化上上应应用用得得很很普普遍遍。通通常常在在获获得得粗粗多多糖糖后后, 先先用用阴阴离离子子交交换换柱柱层层析、透析、干燥析、透析、干燥, 溶解后再用凝胶柱层析。溶解后再用凝胶柱层析。l凝胶柱层析是目前植物多糖最常用的高凝胶柱层析是目前植物多糖最常用的高级纯化方法。级纯化方法。l常常用用的的凝凝胶胶有有各各种种型型号号的的交交联联葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶(Se
33、phadex)、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶(Sepharose) 和和聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶(Bio-gel)三三大大类类，以以及及后后来来在在这这些些凝凝胶胶上上进进行行性性能能改改良良的的新新一一代代 凝凝 胶胶 , 如如 Sephacryl、 Superdex 和和Superose 等等。展展开开剂剂为为各各种种浓浓度度的的盐盐溶溶液液及及缓缓冲冲溶溶液液, 离离子子强强度度最最好好不不低低于于0.2 mol/L (否则拖尾严重否则拖尾严重)。 亲和层析 l某某些些特特定定多多糖糖具具有有和和某某些些相相对对应应的的专专一一分分子子可可逆逆结结合合的的特特性性, 如如一一种种凝凝集集素素
34、(刀刀豆豆球球蛋蛋白白) 能能专专一一地地与与分分支支多多糖糖结结合合。分分子子之之间间的的这这种种结结合合能能力力称称为为亲亲和和力力, 使使它它们们结合后再将其解离结合后再将其解离, 可以纯化多糖。可以纯化多糖。l把把欲欲分分离离的的可可亲亲和和的的一一对对分分子子的的一一方方作作为为配配基基(ligand)与与不不溶溶性性载载体体结结合合使使固固定定化化, 装装入入色色谱谱柱柱(亲亲和和柱柱), 然然后后把把含含有有欲欲分分离离的的多多糖糖溶溶液液作作流流动动相相, 这这时时溶溶液液中中只只有有能能和和配配基基具具有有亲亲和和力力的的多多糖糖分分子子被被结结合合而而吸吸附附, 其其他他多
35、多糖糖则则流流出出柱柱外外, 然然后后再再改改变变流流动动相相的的离离子子强强度度及及pH, 使使配配基基与与多多糖糖解离解离, 则被纯化的多糖就流出柱外。则被纯化的多糖就流出柱外。 其他方法l分分级级沉沉淀淀法法 大大多多数数活活性性多多糖糖可可溶溶于于水水，3 个个碳碳以以下下的的多多糖糖还还可可溶溶于于乙乙醇醇，随随着着聚聚合合度度的的增增大大，多多糖糖在在乙乙醇醇中中的的溶溶解解度度逐逐渐渐降降低低。根根据据这这一一性性质质可可在在多多糖糖的的浓浓缩缩水水溶溶液液中中分分批批加加入入乙乙醇醇，使使乙乙醇醇的的体体积积浓浓 度度 逐逐 渐渐 增增 加加 到到 50， 100， 200，
36、900 mL/L，从从而而使使不不同同聚聚合合度度的的多多糖糖分分别别沉沉淀析出。淀析出。l如如在在五五味味子子多多糖糖提提取取液液中中加加入入无无水水乙乙醇醇，使使其其体体积积分分数数分分别别达达到到10 %，30 %，45 %，65 %，进进行行分分级级沉沉淀淀，最最后后将将剩剩余余的的母母液液直直接接蒸蒸发发浓浓缩缩，得得到到5 个个分分级级的的五五味子多糖组分。味子多糖组分。三、多糖含量的测定方法l多多糖糖含含量量测测定定常常规规方方法法是是以以无无水水葡葡萄萄糖糖为为对对照照品品, 采采用用苯苯酚酚-硫硫酸酸法法, 或或者者蒽蒽酮酮-硫硫酸法酸法 。l上上述述两两种种方方法法由由于于
37、操操作作简简单单, 试试剂剂容容易易获获得而在多糖含量测定中被广泛采用。得而在多糖含量测定中被广泛采用。苯酚-硫酸法的原理l多多糖糖在在硫硫酸酸存存在在下下先先水水解解成成单单糖糖, 再再脱脱水水生生成成具具有有呋呋喃喃环环结结构构的的化化合合物物。由由五五碳碳糖糖生生成成的的是是糠糠醛醛, 甲甲基基五五碳碳糖糖生生成成的的是是5-甲甲糠糠醛醛, 六六碳碳糖糖生生成成的的是是5-羟羟甲甲糠糠醛醛。糠糠醛醛酸酸在在此此条条件件下下往往往往脱脱羧羧, 并并生生成成糠糠醛醛。糠糠醛醛及及其其衍衍生生物物和和苯苯酚酚缩缩合合成成有有色色物物质质, 在在480 nm 处处有有最最大大吸吸收收, 吸吸收收
38、值值与与糖糖的的含量呈线性关系。含量呈线性关系。蒽酮-硫酸法的原理l蒽蒽酮酮-硫硫酸酸法法其其原原理理是是糖糖类类与与浓浓硫硫酸酸在在沸沸水水浴浴中中迅迅速速脱脱水水生生成成糠糠醛醛或或其其衍衍生生物物, 再再与与蒽蒽酮酮试试剂剂缩缩合合, 形形成成蓝蓝绿绿色色溶溶液液, 在在620 nm 处处有有最最大大吸吸收收, 吸吸收收值值与与糖糖的的含含量量呈呈线性关系。线性关系。l这两种方法也存在较为严重的缺陷这两种方法也存在较为严重的缺陷: l首首先先, 葡葡萄萄糖糖是是单单糖糖, 而而植植物物多多糖糖的的组组成成是多样的是多样的, 只用葡萄糖作为参照不确切只用葡萄糖作为参照不确切; l其其次次,
39、 显显色色试试剂剂的的不不专专属属, 单单糖糖的的干干扰扰严严重重, 实实际际上上测测得得的的结结果果是是总总糖糖的的结结果果。在在未未严严格格纯纯化化的的植植物物多多糖糖样样品品中中, 这这种种情情况况更为普遍。更为普遍。l为为排排除除还还原原性性单单糖糖的的干干扰扰, 可可采采用用DNS( 3, 5-二二硝硝基基水水杨杨酸酸)比比色色法法测测定定还还原原糖糖含含量量。其其原原理理是是在在碱碱性性溶溶液液中中, 3, 5-二二硝硝基基水水杨杨酸酸与与还还原原糖糖共共热热后后被被还还原原成成棕棕红红色色氨氨基基化化合合物物, 在在一一定定范范围围内内还还原原糖糖的的量量与与反应液的颜色强度呈比
40、例关系。反应液的颜色强度呈比例关系。l再再将将通通过过硫硫酸酸-苯苯酚酚法法或或者者蒽蒽酮酮-硫硫酸酸法法得得到到的的总总糖糖结结果果减减去去还还原原糖糖, 即即得得较较准准确确的的多糖含量。多糖含量。糖醛酸含量测定l糖醛酸含量测定则以咔唑糖醛酸含量测定则以咔唑-硫酸法多见。硫酸法多见。l该法的原理在于糖醛酸在硫酸存在下会该法的原理在于糖醛酸在硫酸存在下会与咔唑反应生成含羰基的紫红色产物。与咔唑反应生成含羰基的紫红色产物。该产物在该产物在530 nm下有最大吸收下有最大吸收, 吸收值与吸收值与糖含量呈线性关系。糖含量呈线性关系。四、纯度与相对分子质量的检测l纯度鉴定纯度鉴定l分子量的测定分子量
41、的测定l结构测定结构测定 包包括括多多糖糖一一级级结结构构测测定定、多多糖糖高高级级结结构构测定测定纯度鉴定l多多糖糖是是高高分分子子化化合合物物，其其纯纯品品微微观观上上是是不不均均一一的的，通通常常所所说说的的多多糖糖纯纯品品实实质质上上是一定分子量范围的均一组分。是一定分子量范围的均一组分。l 多多糖糖纯纯度度鉴鉴定定的的常常用用方方法法：超超离离心心、高高压电泳、凝胶层析、压电泳、凝胶层析、HPLC 法等。法等。 l现现在在应应用用较较多多的的是是HPLC 法法，旋旋光光度度测测定也是纯度测定的一种方法。定也是纯度测定的一种方法。分子量的测定l多多糖糖分分子子量量的的测测定定是是研研究
42、究多多糖糖性性质质的的一一项重要工作。项重要工作。l常常用用方方法法：渗渗透透压压法法、蒸蒸气气压压渗渗透透剂剂法法、端端基基法法、粘粘度度法法、光光散散射射法法、凝凝胶胶色色谱谱法法、超超过过率率法法、沉沉淀淀法法、凝凝胶胶电电泳泳法法、HPLC 法法、超超离离心心分分析析法法、分分子子筛筛色色谱谱法法、GPC（凝凝胶胶渗渗透透色色谱谱）法法、MALDITOFMS （基基质质辅辅助助激激光光解解吸吸电电离离飞飞行时间质谱）法。行时间质谱）法。结构测定多糖一级结构测定l多多糖糖的的一一级级结结构构分分析析，主主要要是是分分析析组组成成多多糖糖的的单单糖糖类类型型、数数目目、连连接接方方式式及及
43、苷苷建构型。常用化学法和仪器分析法。建构型。常用化学法和仪器分析法。l多多糖糖组组分分与与分分子子比比例例测测定定法法：部部分分酸酸解解法、完全酶解法、色谱法；法、完全酶解法、色谱法；l吡吡喃喃、呋呋喃喃环环形形式式结结构构的的分分析析：红红外外光光谱；谱；l连接次序：选择性光谱法、糖苷键顺序连接次序：选择性光谱法、糖苷键顺序水解、核磁共振法水解、核磁共振法l、异头异构体：糖苷酶水解、核异头异构体：糖苷酶水解、核磁共振；磁共振；l羟基被取代情况：甲基化反应、气相色羟基被取代情况：甲基化反应、气相色谱、过碘酸氧化、谱、过碘酸氧化、Smith 降解法和测硫酸降解法和测硫酸基法基法(terho 法法
44、)、核磁共振法、质谱法、核磁共振法、质谱法;l糖链、肽链连接方式：单糖与氨基酸组糖链、肽链连接方式：单糖与氨基酸组成、稀碱水解法、肼解反应；成、稀碱水解法、肼解反应；l多多糖糖结结构构的的分分析析方方法法很很多多，迄迄今今没没有有一一种种方方法法可可以以单单独独完完成成多多糖糖结结构构的的分分析析。仪仪器器分分析析与与化化学学方方法法相相结结合合是是常常用用的的多多糖结构测定方法。糖结构测定方法。l近近年年来来，以以精精确确三三维维结结构构知知识识为为基基础础揭揭示示重重要要生生命命活活动动的的规规律律已已达达到到前前所所未未有有的的深深度度和和广广度度，多多糖糖作作为为一一类类重重要要的的生生物物活活性性大大分分子子其其结结构构的的研研究究势势必必推推动动对对多糖的认识向深层次发展。多糖的认识向深层次发展。
