第八章第八章 酶催化反应机制酶催化反应机制 第一节第一节 前言前言一一 两个专一性假说：两个专一性假说： 1 锁钥（锁钥（lock and key)结合假说：结合假说： 由由Fisher早期早期(1894)提出的理论提出的理论 整个酶分子的构象是完整无缺的（刚性），酶整个酶分子的构象是完整无缺的（刚性），酶和底物之间是紧密配合的和底物之间是紧密配合的 2 诱导契合学说诱导契合学说(induced-fit hypothesis)：： 1958年，年，Koshland 提出提出酶活性中心的可提出提出酶活性中心的可变性（挠性）底物和酶结合时由于诱导和契合使变性（挠性）底物和酶结合时由于诱导和契合使酶活性中心变化和底物紧密结合酶活性中心变化和底物紧密结合 二二 酶与底物相互作用酶与底物相互作用——过渡态过渡态•E + S ES* E+P 酶通过与底物形成过渡态中间物，酶通过与底物形成过渡态中间物， 降低反应活化能而加速反应降低反应活化能而加速反应。
•过渡态中间物的维持力主要是一过渡态中间物的维持力主要是一 些次级键：氢键、离子键、疏水力等，些次级键：氢键、离子键、疏水力等， 形成过程中放出大量能量，抵消了部分活化能形成过程中放出大量能量，抵消了部分活化能•处于过渡态的酶与底物的具有很高的亲和力，比底物处于过渡态的酶与底物的具有很高的亲和力，比底物或产物高出几个数量级或产物高出几个数量级•底物过渡态类似物：底物过渡态类似物： 例如天然具有半椅式结构的环内酯作为溶菌酶的例如天然具有半椅式结构的环内酯作为溶菌酶的底物，对酶的亲和力比一般糖环高底物，对酶的亲和力比一般糖环高3600倍 PS(S*)能量能量ΔEΔE 三三 酶催化反应机制（高效性影响因素）：酶催化反应机制（高效性影响因素）： (一一) 邻近、定向效应及分子内催化：邻近、定向效应及分子内催化：• 邻近效应邻近效应(approximation, proximity) ：： 酶活性中心的特定构象使两底物残基互相靠近，酶活性中心的特定构象使两底物残基互相靠近，使底物在活性中心有效浓度提高从而加速反应使底物在活性中心有效浓度提高从而加速反应•定向效应定向效应( orientation effect) ：： 酶使底物的构象固定，使分子轨道正确交叉酶使底物的构象固定，使分子轨道正确交叉•分子内催化：分子内催化： 由于邻近和定向效应的存在，使原本处于游离由于邻近和定向效应的存在，使原本处于游离 状态的底物反应，转变成分子内反应。
状态的底物反应，转变成分子内反应 (二二) 底物形变与诱导楔合底物形变与诱导楔合•底物形变底物形变(distortion)和诱导契合和诱导契合(induced fit)：： 酶与底物在构象上相互诱导以便更好配酶与底物在构象上相互诱导以便更好配合，作用力的产生往往导致底物形变，使被作合，作用力的产生往往导致底物形变，使被作用的底物敏感键极易断裂用的底物敏感键极易断裂•例如：溶菌酶催化时使底物糖环由椅式转变为例如：溶菌酶催化时使底物糖环由椅式转变为半椅式半椅式 (三三) 广义酸碱催化及共催化：广义酸碱催化及共催化：•广义酸碱催化：质子供体或受体的催化广义酸碱催化：质子供体或受体的催化•例如：葡萄糖变旋反应：例如：葡萄糖变旋反应： 广义碱催化：广义碱催化： 广义酸催化：广义酸催化：OHOHOHO-O- CHOOH CHOOHOHOHCHO - HOH CHO:BHB+ HBHB:B •共催化（多元催化）：是酸和碱的共同参与催化的机制共催化（多元催化）：是酸和碱的共同参与催化的机制•电荷中继网电荷中继网（（charge relay network）或）或质子转移通路质子转移通路：： H-O O- …… H-N N …… H-O O …… H+ C P O- O- 羧基羧基 咪唑基咪唑基 磷酸基磷酸基 电子云由左向右移动，质子由右向左传递电子云由左向右移动，质子由右向左传递•质子转移通路上的各个基团都是广义酸，同时又是广义碱质子转移通路上的各个基团都是广义酸，同时又是广义碱 (四四) 共价催化共价催化:•标志：催化过程中形成共价中间物标志：催化过程中形成共价中间物1 亲核催化亲核催化: 带有多余电子对的基团或原子攻击缺少电子带有多余电子对的基团或原子攻击缺少电子而带有部分正电性的原子或基团并形成不稳定的而带有部分正电性的原子或基团并形成不稳定的共价中间物的催化方式。
共价中间物的催化方式 亲核试剂亲核试剂: Glu-COO- Asp-COO- His-咪唑基咪唑基2 亲电催化亲电催化: 由缺少电子的亲电试剂从带负电的基团上夺由缺少电子的亲电试剂从带负电的基团上夺取一对电子并形成共价中间物的催化方式取一对电子并形成共价中间物的催化方式 亲电试剂：亲电试剂： -NH3+ (五五) 微环境催化：微环境催化： ①① 酶活性中心提供一个低介电区酶活性中心提供一个低介电区: 低介电环境有利于电荷间相互作用，而极性低介电环境有利于电荷间相互作用，而极性环境往往对电荷有屏蔽作用环境往往对电荷有屏蔽作用 ②② 局部环境差异使催化基团的解离状态不一样局部环境差异使催化基团的解离状态不一样, 例如：例如： 溶菌酶的两个催化羧基：溶菌酶的两个催化羧基： Glu35-COOH Asp52-COO- (六六) 作为辅助因子的金属离子的催化作为辅助因子的金属离子的催化•金属酶类：酶和金属结合牢固金属酶类：酶和金属结合牢固 被金属激活酶类：在分离纯化过程中不带金属，被金属激活酶类：在分离纯化过程中不带金属， 人为加入来激活酶类人为加入来激活酶类•金属离子的功能金属离子的功能: 1. 维持酶的活性构象，使酶处于催化有利状态维持酶的活性构象，使酶处于催化有利状态 2. 对底物有定位作用，如：对底物有定位作用，如： Metal 丙酮酸激酶丙酮酸激酶 ATP 丙酮酸丙酮酸 3. 作为超酸催化剂参与催化作为超酸催化剂参与催化 ：： 金属离子所带电荷可以不止一个；并且金属离子所带电荷可以不止一个；并且 荷电情况不受荷电情况不受PH环境变化的影响环境变化的影响 第二节第二节 几种酶作用机制举例几种酶作用机制举例 一一 溶菌酶溶菌酶(Lysozyme EC 3.2.1.17 )：：•存在于鸡蛋清和动物分泌物中，单肽链存在于鸡蛋清和动物分泌物中，单肽链129个个aa，，14,600，折，折叠成近球状叠成近球状(4.5 3 3nm)，， 底物为底物为NAG和和NAM相间相间 排列或排列或NAG的单聚物的单聚物•催化过程：催化过程： ①①与底物结合与底物结合: 6个糖环第个糖环第 3个必须是个必须是NAG；其它；其它 糖环和酶形成氢键放能糖环和酶形成氢键放能 并导致第并导致第4个糖环个糖环D由由 椅式转变为半椅式椅式转变为半椅式 （（4kcal/mol) ② ② 催化：催化： 2 催化特征催化特征: ①① 有明显的底物形变过程有明显的底物形变过程 ②② 微环境催化微环境催化 ③ ③ 广义酸碱催化广义酸碱催化Glu35COHOABNAGOOC1HNACOEFAsp52-COO-OHH 二二 胰凝乳酶胰凝乳酶 (EC 3.4.4.5)•活性中心三个基团活性中心三个基团: Asp102 His57 Ser195构成质子转移通路构成质子转移通路•水解分为两个步骤：水解分为两个步骤： ① ① 酰化：形成四联体中间物酰化：形成四联体中间物酰化酶酰化酶 His57 HN NAsp102 C-O-OSer195H-OHHR’NH – C - RO四联体中间物四联体中间物酰化酶酰化酶 ②②水解脱酰水解脱酰: •催化特性：催化特性： 亲核催化；亲核催化； 质子传递通路质子传递通路His57 HN NAsp102 C-O-OSer195 OR’NH – C - ROHH OHR’NH2H- H H 三三 其它其它Ser蛋白酶的催化机制蛋白酶的催化机制:•胰酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶的活性中心都有胰酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶的活性中心都有 Asp、、His、、Ser的质子传递通路，只是底物专一性不同：的质子传递通路，只是底物专一性不同： Gly216Gly226SerOHCAspOO-Gly216Gly226SerOHVal216Thr226胰酶：作用胰酶：作用于碱性大侧于碱性大侧链链aa弹性蛋白酶：只水弹性蛋白酶：只水解如解如Ala小侧链小侧链aa糜蛋白酶：糜蛋白酶：水解中性大水解中性大侧链侧链aa 四四 羧肽酶羧肽酶A (EC 3.4.2.1)1 酶的结构：酶的结构：•由胰腺分泌的一个含由胰腺分泌的一个含Zn的蛋白水解酶的蛋白水解酶•水解蛋白质或肽的水解蛋白质或肽的C-端，产生游离端，产生游离aa，对芳香族或大侧，对芳香族或大侧 链的脂肪族链的脂肪族aa 作用较强作用较强•307aa构成，含构成，含 有有38% -helix , 17% β-sheet, 分子椭球形，分子椭球形， 表面有长裂隙，表面有长裂隙， Zn位于其中位于其中 2 底物与酶的配合：以甘氨酰酪氨酸为底物（钝化二肽底物）底物与酶的配合：以甘氨酰酪氨酸为底物（钝化二肽底物）•酶与底物之间形成酶与底物之间形成5个相互作用力个相互作用力 ①① Arg145正电荷与底物正电荷与底物Tyr羧基形成离子键羧基形成离子键 ②② 底物底物Tyr侧链非极性口袋并和酶形成疏水键，并至少置换侧链非极性口袋并和酶形成疏水键，并至少置换 出出4个个H2O ③③ Tyr248的酚羟基的酚羟基和和 待作用底物敏感肽待作用底物敏感肽 键的键的NH形成氢键形成氢键 ④④底物敏感肽键的底物敏感肽键的 C=O代替原来的代替原来的 H2O与与Zn2+ 配位配位 ⑤⑤底物末端底物末端-NH2通过通过 一个一个H2O与与Glu270 的侧链形成氢键的侧链形成氢键Arg145HO-Tyr248Glu270COO-ZnHis196Glu72His69OHCHCH2CH-COO-NHO=CNH2①①4H2O②②④④③③HOH⑤⑤ •酶与底物作用过程中构象发生极大变化：酶与底物作用过程中构象发生极大变化：① ① Arg145和和Glu270各移动各移动2A°② ② Tyr248 向内移动向内移动12A°—— 相当于整个相当于整个酶酶分子分子 直径的直径的1/4③ ③ 由于上述变化，底物口袋中的许多水分子被赶由于上述变化，底物口袋中的许多水分子被赶出，形成一个利于催化的疏水口袋。
出，形成一个利于催化的疏水口袋•上述变化以上述变化以Arg145与底物羧基结合开始，然后与底物羧基结合开始，然后触发触发Tyr248 进入催化活性位置，因此底物羧基进入催化活性位置，因此底物羧基是酶识别的至关重要的基团是酶识别的至关重要的基团 3 催化机制催化机制:Arg145HO-Tyr248Glu270COO-Zn2+His196Glu72His69OHCHCH2CH-COO-NHO=CNH2①①③③HOHH -②②4 催化特点催化特点:①①底物诱导及形变底物诱导及形变②②金属离子催化金属离子催化O- H | H 蛋白质部分蛋白质部分•简述蛋白质的结构层次以及各层次主要的特点简述蛋白质的结构层次以及各层次主要的特点和存在类型和存在类型•蛋白质一级结构测定的基本步骤和方法蛋白质一级结构测定的基本步骤和方法•研究蛋白质空间结构的主要方法有哪些？简述研究蛋白质空间结构的主要方法有哪些？简述其原理•举例说明各种膜蛋白及纤维蛋白的结构特点举例说明各种膜蛋白及纤维蛋白的结构特点•试述细胞内各种蛋白质跨膜运输的机理和途径试述细胞内各种蛋白质跨膜运输的机理和途径•述肌肉收缩的分子机理。
述肌肉收缩的分子机理•简述肽人工合成的思路和常用方法简述肽人工合成的思路和常用方法。