兽药残留研究课件

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1、第第6 6章章 兽药残留研究兽药残留研究兽药残留研究主要内容主要内容 第第1 1节节 残留概述残留概述 第第2 2节节 残留毒理学评价残留毒理学评价 第第3 3节节 残留化学评价残留化学评价 第第4 4节节 各国兽药残留监各国兽药残留监控控兽药残留研究学习要点学习要点 残留的概念及发生原因。残留的概念及发生原因。 残留的安全性评价程序。残留的安全性评价程序。 最高残留限量与休药期的确定方法。最高残留限量与休药期的确定方法。 残留分析方法原理与步骤残留分析方法原理与步骤兽药残留研究第第1 1节节 残留概述残留概述兽药残留研究 残留(残留(Drug residue)Drug residue):动物

2、动物可食性组织可食性组织和和产产品品中出现的中出现的外源化合物及其代谢物或杂质外源化合物及其代谢物或杂质。是外。是外源物质与动物机体相互作用的结果。源物质与动物机体相互作用的结果。 兽兽 药药 饲料添加剂饲料添加剂 工农业废弃物工农业废弃物 环境污染物环境污染物 生物毒素等生物毒素等一、概一、概 念念兽药残留研究1 1、残留危害人体健康、残留危害人体健康n急性毒性急性毒性 瘦肉精中毒瘦肉精中毒n变态反应与过敏反应变态反应与过敏反应 青霉素过敏青霉素过敏n慢性、累积性、不可逆毒性慢性、累积性、不可逆毒性 氯霉素再障贫血氯霉素再障贫血 硝基呋喃、己烯雌酚致癌硝基呋喃、己烯雌酚致癌n耐药性:耐药性:

3、n激素样作用:激素样作用:同化剂同化剂美国美国新闻周刊新闻周刊报道报道: : 仅仅19921992年全美就有年全美就有1330013300名患者死于抗名患者死于抗生素耐药性细菌感染生素耐药性细菌感染二、危二、危 害害兽药残留研究2 2、残留影响国民经济发展、残留影响国民经济发展l养养 殖殖 业业: : 销毁产品销毁产品 承担检测和调查费用承担检测和调查费用 丢失市场丢失市场 受到处罚和谴责受到处罚和谴责l食食 品品 业业: : 肉、蛋、奶加工生产受到影响肉、蛋、奶加工生产受到影响l国际贸易:国际贸易:鳗鱼事件鳗鱼事件(1989) (1989) 克球粉事件克球粉事件(1990(19901993)

4、1993) 蜂蜜事件蜂蜜事件(1996) (1996) 氯霉素事件氯霉素事件(1996(1996、2002)2002) 中国是畜禽养殖的第一大国,但仅中国是畜禽养殖的第一大国,但仅1 1产品可出口产品可出口兽药残留研究3、残留影响社会稳定、残留影响社会稳定意大利和波多黎哥的性早熟事件意大利和波多黎哥的性早熟事件Bongiovanni WH. An Epidemic of Premature Thelarche in Puerto Rico. J Pediatr 1983; 103: 245-246比比利利时时二二恶恶英英事事件件消费者消费者: : 我们还能吃我们还能吃什么什么?!?!中国瘦肉精

5、事件中国瘦肉精事件兽药残留研究三、残留发生的原因三、残留发生的原因n不遵守休药期不遵守休药期n标签外用标签外用n药品标签或处方指示不明药品标签或处方指示不明n疏忽大意或无意残留疏忽大意或无意残留n饲养管理不当饲养管理不当n不明原因不明原因兽药残留研究1、残留化合物种类多、残留化合物种类多/性质迥异性质迥异n人工使用的人工使用的400400余种,加上余种,加上污染物有数千种污染物有数千种n这些物质结构及理化性质这些物质结构及理化性质迥异迥异莫能菌素氯霉素己烯雌酚瘦肉精四、残留的特点四、残留的特点兽药残留研究2 2、7070外源物在体内发生广泛代谢外源物在体内发生广泛代谢, ,残残 留通常不是异物

6、本身。留通常不是异物本身。残留化合物残留化合物不下万种不下万种!兽药残留研究3. 残留的形态与数量存在着十分明显的种属差异残留的形态与数量存在着十分明显的种属差异猪猪鸡鸡狗狗奶牛奶牛山羊山羊骆驼骆驼兽药残留研究4、残留通常是痕量或超痕量水平、残留通常是痕量或超痕量水平, 存在于复杂的存在于复杂的 基质中。基质中。n多数化合物为多数化合物为ppbppb水平,氯霉素水平,氯霉素/ /硝基呋喃等在硝基呋喃等在ppbppb以下,二恶英等为以下,二恶英等为pptppt水平水平n要求分析方法高度灵敏要求分析方法高度灵敏/ /特异特异/ /可靠可靠n组织中的内组织中的内/ /外源性物质干扰大,样品预处理外源

7、性物质干扰大,样品预处理难。难。 兽药残留研究5、残留在体内分布不均衡、残留在体内分布不均衡n一些抗生素主要残留在肝脏和肾脏。一些抗生素主要残留在肝脏和肾脏。n脂溶性高的化合物主要蓄积于脂肪组织。脂溶性高的化合物主要蓄积于脂肪组织。n环境污染物多富集于鱼皮。环境污染物多富集于鱼皮。n“瘦肉精瘦肉精”残留的靶组织却是视网膜和毛发。残留的靶组织却是视网膜和毛发。兽药残留研究五、影响残留的因素五、影响残留的因素n动物生理、病理、动物生理、病理、种属种属n化合物结构、性质、化合物结构、性质、相互作用相互作用n饲养模式、给药方饲养模式、给药方式、食品贮藏加工式、食品贮藏加工n环境环境兽药残留研究六、残留

8、控制措施六、残留控制措施n合理用药合理用药n监监 控控n立立 法法n科学研究科学研究兽药残留研究七、残留控制标准七、残留控制标准 最高残留限量(最高残留限量(MRLMRL): : 休药期休药期(Withdrawl time):(Withdrawl time):兽药残留研究八、残留控制原理八、残留控制原理残留的毒理学评价残留的毒理学评价安全浓度(安全浓度(SC)残留的化学评价残留的化学评价最高残留限量最高残留限量(MRL)休药期(休药期(WDT)分析方法研分析方法研究究兽药残留研究第第2 2节节 残留的毒理学评价残留的毒理学评价兽药残留研究 确定最大无作用剂量(确定最大无作用剂量(NOELNOE

9、L);确定安);确定安全因子(全因子(SFSF);推算日许量();推算日许量(ADIADI)和安全)和安全浓度(浓度(SCSC)。)。一、目的意义一、目的意义兽药残留研究( (一一) ) 基础毒理学研究基础毒理学研究n急性毒性试验急性毒性试验n遗传毒性试验遗传毒性试验n9090天喂养试验天喂养试验n两代繁殖试验两代繁殖试验n发育试验发育试验二、毒理学研究内容二、毒理学研究内容兽药残留研究n一年喂养试验一年喂养试验n慢性致癌试验慢性致癌试验n第二种动物的致畸试验第二种动物的致畸试验n抗菌药肠道菌丛试验抗菌药肠道菌丛试验n特殊试验(神经、免疫、激素、子宫等)特殊试验(神经、免疫、激素、子宫等)(

10、(二二) ) 附加毒理学研究附加毒理学研究兽药残留研究n通过各项毒理学研究结果,确定各项毒性实通过各项毒理学研究结果,确定各项毒性实验的验的NOELNOEL。n根据各项毒性实验的根据各项毒性实验的NOELNOEL,将,将NOELNOEL值最小者值最小者确定为受试物的最终确定为受试物的最终NOELNOEL。nNOEL:最大无作用剂量,指动物用药后不最大无作用剂量,指动物用药后不出现明显毒副反应的最高剂量。出现明显毒副反应的最高剂量。(三)确定最大无作用剂量(三)确定最大无作用剂量(NOEL)(NOEL)兽药残留研究三、毒理学评价的程序和要求三、毒理学评价的程序和要求 n第一阶段:急性毒性试验。第

11、一阶段:急性毒性试验。 目的:目的:了解受试物的毒性强度和性质,为蓄积性了解受试物的毒性强度和性质,为蓄积性 和亚慢性毒性试验的剂量选择提供依据。和亚慢性毒性试验的剂量选择提供依据。 实验项目:实验项目:半数致死量实验(半数致死量实验(LDLD5050)。)。 结果判定:结果判定:LDLD5050大于大于1010倍人体摄入量,继续研倍人体摄入量,继续研 究。否则,放弃。究。否则,放弃。(一)程序(一)程序兽药残留研究1. 1. 蓄积毒性试验:蓄积毒性试验: LDLD5050大于大于10g/kg b.w.10g/kg b.w.,不进行蓄积毒性试,不进行蓄积毒性试验。验。 蓄积系数(蓄积系数(K

12、K)小于)小于3 3为强蓄积性,应放弃。为强蓄积性,应放弃。 K K大于或等于大于或等于3 3为弱蓄积性。为弱蓄积性。第二阶段:蓄积毒性和致突变试验。第二阶段:蓄积毒性和致突变试验。兽药残留研究(1 1)目的:)目的:对受试物是否具有致癌作用的可能对受试物是否具有致癌作用的可能性进行筛选。性进行筛选。(2 2)试验项目:)试验项目:原核细胞和真核细胞,基因突原核细胞和真核细胞,基因突变和染色体畸变,体内和体外试验系统,体细变和染色体畸变,体内和体外试验系统,体细胞和生殖细胞。胞和生殖细胞。 Ames Ames试验和微核试验必做。精子畸形、睾试验和微核试验必做。精子畸形、睾丸精原细胞染色体畸变、

13、显性致死三者任选一丸精原细胞染色体畸变、显性致死三者任选一项。项。 2. 2. 致突变试验:致突变试验:兽药残留研究(3 3)结果判定:)结果判定: 若若3 3项试验均为阳性,放弃。项试验均为阳性,放弃。n若若2 2项为阳性,而又有强蓄积性,放弃;若为弱蓄项为阳性,而又有强蓄积性,放弃;若为弱蓄积性,应由专家评议,权衡利弊再决定。积性,应由专家评议,权衡利弊再决定。n若若1 1项为阳性,再选择两项其它致突变试验。如果项为阳性,再选择两项其它致突变试验。如果两项为阳性,则放弃;如一项为阳性,且为强蓄两项为阳性,则放弃;如一项为阳性,且为强蓄积性,应放弃;若一项阳性,进入第三阶段试验。积性,应放弃

14、;若一项阳性,进入第三阶段试验。n若若3 3项均为阴性,进入第三阶段。项均为阴性,进入第三阶段。 兽药残留研究(1 1)目的:)目的:观察受试物动物的毒性作用性质和观察受试物动物的毒性作用性质和靶器官,确定最大无作用剂量(靶器官,确定最大无作用剂量(NOELNOEL)。)。 (2 2)试验项目:)试验项目:90d90d喂养试验、喂养繁殖试验、喂养试验、喂养繁殖试验、喂养致畸试验和传统致畸试验。喂养致畸试验和传统致畸试验。 第三阶段:亚慢性毒性试验和代谢试验。第三阶段:亚慢性毒性试验和代谢试验。 兽药残留研究(3 3)结果判定:)结果判定: 任何一项的任何一项的NOELNOEL小于或等于人可能摄

15、入量小于或等于人可能摄入量的的100100倍,应予放弃;倍,应予放弃; 大于大于100100倍而小于倍而小于300300倍,可进行慢性毒性倍,可进行慢性毒性试验;试验; 大于或等于大于或等于300300倍者,不必进行慢性毒性试倍者,不必进行慢性毒性试验。验。兽药残留研究n目的:目的:发现仅长期接触受试物才出现的毒性作发现仅长期接触受试物才出现的毒性作用,确定用,确定NOELNOEL。n结果判定:结果判定:NOELNOEL 5050倍人摄入量,放弃;倍人摄入量,放弃; 5050倍倍 NOEL NOEL 100100倍,由专家评议;倍,由专家评议; NOEL NOEL 100100倍,允许用于食品

16、,并制定倍,允许用于食品,并制定ADIADI。 如任何一个剂量发现有致癌作用,且有剂量如任何一个剂量发现有致癌作用,且有剂量- -效应关系,由专家共同评议。效应关系,由专家共同评议。 第四阶段:慢性毒性试验(包括致癌试验)第四阶段:慢性毒性试验(包括致癌试验)兽药残留研究(二)要求(二)要求n试验动物试验动物必须选择对化学物质的代谢方式与人必须选择对化学物质的代谢方式与人相似的动物种类。相似的动物种类。 n选择的选择的剂量剂量要能够在其血浆和靶器官中产生与要能够在其血浆和靶器官中产生与人相应的浓度。人相应的浓度。 n应选择应选择最佳的试验组合最佳的试验组合。 n必须对受试物可能对人畜健康造成的

17、危害及可必须对受试物可能对人畜健康造成的危害及可能的有益作用之间进行能的有益作用之间进行综合评价综合评价。 兽药残留研究1. 1. 日许量的确定日许量的确定 日许量日许量 (ADI) (ADI) :指人终生每日摄入某种药物或:指人终生每日摄入某种药物或 化学物质后,对其健康不产生化学物质后,对其健康不产生 可觉察有害作用的剂量。可觉察有害作用的剂量。 四、安全浓度的确定四、安全浓度的确定兽药残留研究计算方法如下:计算方法如下: NOEL (mg/kg b.w./d)60 kg b.w.NOEL (mg/kg b.w./d)60 kg b.w. ADI= ADI= 安全因子安全因子 单位:单位:

18、mg/kg b.w./d 或mg/60kg b.w./d 兽药残留研究安全浓度:安全浓度:食品动物用药后其所有可食用组织中食品动物用药后其所有可食用组织中 与药物有关的总残留浓度。与药物有关的总残留浓度。 STC = ADI食耗因子(食耗因子(TCF) TCF:肌肉:肌肉 300 g; 肝脏肝脏 100 g;脂肪;脂肪 50 g; 肾脏肾脏 50 g; 鸡蛋鸡蛋 100 g;牛奶;牛奶 1.5 L2. 2. 安全浓度的确定安全浓度的确定 (STC) (STC)兽药残留研究第第3 3节节 残留的化学评价残留的化学评价兽药残留研究一、目的一、目的n阐明药物在动物体内的总残留阐明药物在动物体内的总残

19、留消除规律消除规律,存,存在的在的稳定状态稳定状态,主要,主要代谢方式、代谢程度、代谢方式、代谢程度、代谢形式及种属差异代谢形式及种属差异。n确定药物在动物的残留确定药物在动物的残留靶组织靶组织、残留标识物、残留标识物、最高残留限量(最高残留限量(MRLMRL)及休药期标准)及休药期标准。兽药残留研究 总残留研究总残留研究 代谢研究代谢研究 休药期研究休药期研究 分析方法研究分析方法研究二、研究内容二、研究内容兽药残留研究(一)总残留研究(一)总残留研究1 1、概念:、概念: 由游离化合物、游离代谢物及它们与内由游离化合物、游离代谢物及它们与内源性大分子的结合物几部分组成。源性大分子的结合物几

20、部分组成。2 2、研究目标、研究目标: : 药物在动物体内的总残留消除规律,存药物在动物体内的总残留消除规律,存在的稳定状态及主要代谢物。在的稳定状态及主要代谢物。 兽药残留研究 放射性标记法(放射性标记法(“热热”研究法)研究法) 直接测组织法(直接测组织法(“冷处理冷处理” ” 法)法):3 3、研究方法:、研究方法:兽药残留研究(1 1)靶组织()靶组织(Target tissuesTarget tissues) 指动物用药后药物及其代谢物残留时间最长指动物用药后药物及其代谢物残留时间最长的组织。的组织。(2 2)标示残留物)标示残留物Marker residue (Rm)Marker

21、residue (Rm) 总残留中消除最慢、残留时间最长的物质。总残留中消除最慢、残留时间最长的物质。其含量的变化与总残留的变化呈稳定的比例关系。其含量的变化与总残留的变化呈稳定的比例关系。4 4、几个概念:、几个概念:兽药残留研究(3 3)容许量)容许量Tolerance (Marker Residue)Tolerance (Marker Residue) 指残留标识物在靶组织中允许残留的量指残留标识物在靶组织中允许残留的量 容许量容许量= STC X% marker residue= STC X% marker residue(4 4)安全浓度)安全浓度Safe Concentration

22、 (SC)Safe Concentration (SC) 指人体允许摄入的与药物相关的残留物的指人体允许摄入的与药物相关的残留物的总量。总量。 兽药残留研究 指具有生理活性残留物的含量,通常指具有生理活性残留物的含量,通常用残留靶组织中允许残留的残留标识物用残留靶组织中允许残留的残留标识物的量来反映,的量来反映,即即动物体内总残留含量消动物体内总残留含量消除至安全浓度以下时残留标识物在靶组除至安全浓度以下时残留标识物在靶组织中的含量。织中的含量。(5 5)最高残留限量)最高残留限量 (MRLs) (MRLs)兽药残留研究(6 6)最高残留限量设定方法)最高残留限量设定方法兽药残留研究n目的:目

23、的: (1)确证靶动物(或人体)体内的残留物与)确证靶动物(或人体)体内的残留物与 毒理学研究的动物体内残留特征相似性。毒理学研究的动物体内残留特征相似性。 (2)寻找与靶动物(或人体)代谢特征相似)寻找与靶动物(或人体)代谢特征相似 的动物模型。的动物模型。n要求:要求:选择毒理学研究最敏感的动物。选择毒理学研究最敏感的动物。 (二)比较代谢研究(二)比较代谢研究兽药残留研究n内容:内容:(1 1)组织与排泄物中主要代谢物的)组织与排泄物中主要代谢物的定性定性 及及定量定量研究。研究。(2 2)药物代谢)药物代谢速度速度与与程度程度。(3 3)主要的)主要的代谢途径代谢途径和和排泄途径排泄途

24、径。兽药残留研究(三)休药期研究(三)休药期研究n概念:概念: 休药期休药期(Withdrawal time):也称消除也称消除期期(depletion period),),指畜禽停止给药到指畜禽停止给药到许可屠宰或其产品(乳、蛋)许可上市的间隔许可屠宰或其产品(乳、蛋)许可上市的间隔时间。时间。 兽药残留研究n试验要求试验要求(1 1)临床)临床最高剂量,最长期限最高剂量,最长期限。(2 2)按)按FDAFDA要求需要求需2020头头动物。动物。(3 3)每个采样点屠宰)每个采样点屠宰4 45 5头头动物。动物。(4 4)设置)设置4 45 5个个等距的采样点。等距的采样点。1、休药期、休药

25、期兽药残留研究n休药期计算方法:休药期计算方法: 定义法定义法 线性回归法线性回归法 非参数法非参数法 兽药残留研究(1 1)定义法)定义法n休药期休药期= = 残留量低于残留量低于MRLMRL的时间的时间+ +安全间隔时间。安全间隔时间。n估算安全间隔时间的方法: (1)当所有检测样都低于MRL时,取该时间点的1030作为安全间隔时间值。 (2)通过组织消除半衰期t1/2计算,一般安全间隔时间为1-3倍的t1/2 。 兽药残留研究2、弃奶期、弃奶期n在在ADIADI的分配中必须考虑到牛奶部分。的分配中必须考虑到牛奶部分。n必须有奶中的容许量(最高残留限量)和残留必须有奶中的容许量(最高残留限

26、量)和残留标识物规定。标识物规定。n当奶中残留物消除至容许量附近时必须重复采当奶中残留物消除至容许量附近时必须重复采样。样。n样品至少设三个重复。样品至少设三个重复。n每个动物的消除规律应单独计算。每个动物的消除规律应单独计算。n计算方法采用线性回归法,计算方法采用线性回归法, 兽药残留研究3、弃蛋期、弃蛋期n注意:注意: 消除实验中,必须在接近蛋黄形成消除实验中,必须在接近蛋黄形成期用药期用药1212天。天。兽药残留研究4、食品安全要求、食品安全要求1 1毒理学评价中对药物的安全性保守估计。毒理学评价中对药物的安全性保守估计。2 2计算安全浓度时对食物消耗量保守估计。计算安全浓度时对食物消耗

27、量保守估计。3 3充分监测所有与药物相关的残留物。充分监测所有与药物相关的残留物。4 4动物与人体比较代谢研究评估准确。动物与人体比较代谢研究评估准确。5 5靶组织、残留标识物及容许量设置合理。靶组织、残留标识物及容许量设置合理。6 6休药期与弃奶期计算方法合理。休药期与弃奶期计算方法合理。兽药残留研究1 1残留分析的特点残留分析的特点(1 1)待测物质浓度低,属痕量测定,被测物)待测物质浓度低,属痕量测定,被测物 浓度波动大。浓度波动大。(2 2)生物样品基质复杂,干扰物质多。)生物样品基质复杂,干扰物质多。 (3 3)分析方法以仪器分析方法为主。)分析方法以仪器分析方法为主。 (四)分析方

28、法(四)分析方法兽药残留研究(1 1)分离:)分离: 提取提取 净化净化 分分离(分辨)离(分辨)(2 2)检测:)检测: 直接对痕量残留物质进行定性或定量。直接对痕量残留物质进行定性或定量。 如紫外如紫外/ /可见、红外、荧光、核磁共振、可见、红外、荧光、核磁共振、质谱等波谱学性质。质谱等波谱学性质。2 2分析原理分析原理兽药残留研究3 3程序程序样品采集与制备样品采集与制备 提取提取 净化净化 浓缩浓缩 衍生化衍生化 分辨分辨 检测检测分离分离样品前处理样品前处理测定测定兽药残留研究(1 1)样品前处理:)样品前处理: 样品采集和贮存,去蛋白,抽提和净样品采集和贮存,去蛋白,抽提和净化(固

29、液萃取、膜萃取、液液萃取、固化(固液萃取、膜萃取、液液萃取、固相萃取、组织固相萃取、超临界流体萃取、相萃取、组织固相萃取、超临界流体萃取、免疫亲和色谱)。免疫亲和色谱)。(2 2)衍生:)衍生: 荧光衍生(氨基、羟基、巯基、羧基荧光衍生(氨基、羟基、巯基、羧基或羰基),紫外可见光衍生(氨基、羧基、或羰基),紫外可见光衍生(氨基、羧基、羟基、巯基),酶衍生,光化学衍生。羟基、巯基),酶衍生,光化学衍生。兽药残留研究 液相色谱,气相色谱,薄层色谱,超临界液相色谱,气相色谱,薄层色谱,超临界流体色谱(用于极性或大分子化合物),毛细管流体色谱(用于极性或大分子化合物),毛细管电泳(离子),多维分离(联

30、合不同色谱柱)。电泳(离子),多维分离(联合不同色谱柱)。 (4 4)检测:)检测: 微生物方法,免疫方法,物理化学方法微生物方法,免疫方法,物理化学方法(紫外可见检测器、荧光检测器、电化学检测(紫外可见检测器、荧光检测器、电化学检测器、极谱检测器、气相的特定检测器、质谱检测器、极谱检测器、气相的特定检测器、质谱检测器)。器)。(3 3)分离:)分离:兽药残留研究 液相色谱、毛细管电泳二级管阵列,液相色谱、毛细管电泳二级管阵列,气相色谱质谱,薄层色谱质谱,液相色气相色谱质谱,薄层色谱质谱,液相色谱质谱,气相色谱红外光谱,液相色谱谱质谱,气相色谱红外光谱,液相色谱红外光谱。红外光谱。(5 5)确

31、认:)确认: (6 6)复核:)复核: 多个实验室。多个实验室。 兽药残留研究4 4建立方法的步骤建立方法的步骤检测限与定量限检测限与定量限 文献调研文献调研 建立测定方法建立测定方法 样品前处理方法样品前处理方法 标准曲线标准曲线 稳定性试验稳定性试验 方法性能评价方法性能评价 准确度准确度精密度精密度线性范围线性范围 选择性选择性 兽药残留研究(1 1)文献调研)文献调研 n待测物理化性质:待测物理化性质: 如极性、溶解性、酸碱性、稳定性、熔如极性、溶解性、酸碱性、稳定性、熔点、蒸汽压及波谱学性质等;点、蒸汽压及波谱学性质等;n体内过程:体内过程: 包括代谢产物、组织分布、排泄途径和包括代

32、谢产物、组织分布、排泄途径和特征药动学性质,如生物利用度、半衰期、分特征药动学性质,如生物利用度、半衰期、分布容积、蛋白结合率。布容积、蛋白结合率。n药理毒理学特征:药理毒理学特征: 如残留毒性、最高残留限量和休药期等。如残留毒性、最高残留限量和休药期等。 兽药残留研究n首先建立测定方法和线性范围,为后续的各种首先建立测定方法和线性范围,为后续的各种工作提供分析手段,最后根据干扰和使用情况工作提供分析手段,最后根据干扰和使用情况逐步确立测定条件和建立标准曲线。逐步确立测定条件和建立标准曲线。 nHPLCHPLC是首选的测定方法。是首选的测定方法。 (2 2)建立测定方法)建立测定方法 兽药残留

33、研究n纯水作为样品基质预试,了解液液萃纯水作为样品基质预试,了解液液萃取(取(LLE)或固相萃取()或固相萃取(SPE)条件、)条件、试剂干扰和回收率情况。试剂干扰和回收率情况。n空白样品和标准添加样品进行研究。空白样品和标准添加样品进行研究。 (3 3)建立样品前处理方法)建立样品前处理方法 兽药残留研究(4 4)标准曲线)标准曲线 n配制系列浓度(配制系列浓度(57个),每个浓度重复测定个),每个浓度重复测定35次。次。n标准曲线的浓度梯度须涵盖样品可能的浓度范标准曲线的浓度梯度须涵盖样品可能的浓度范围,不得进行外推计算。围,不得进行外推计算。兽药残留研究n包括标准溶液和样品在贮存条件下的

34、稳包括标准溶液和样品在贮存条件下的稳定性试验,如室温、冷冻、反复冻融条定性试验,如室温、冷冻、反复冻融条件下的稳定性。件下的稳定性。 (5 5)稳定性试验)稳定性试验 兽药残留研究 标准添加法。标准添加法。 通常需设定至少通常需设定至少3个浓度,每批每个个浓度,每批每个浓度水平浓度水平5次重复,进行次重复,进行5次单独试验,次单独试验,经统计处理后得到各效能指标。经统计处理后得到各效能指标。 (6 6)方法性能评价)方法性能评价 兽药残留研究n概念:概念: 指测定值与真实值的接近程度,表示分指测定值与真实值的接近程度,表示分析结果的正确性。析结果的正确性。n表示方法:表示方法: 添加回收率(添

35、加回收率(recoveryrecovery)n计算方法:计算方法: 标准曲线法和单点校准法。标准曲线法和单点校准法。a. a. 准确度(准确度(accuracyaccuracy) 兽药残留研究X=(A-b) /a (W/V)/Cs 100%X:试样中待测物的回收率;:试样中待测物的回收率;A:试样的峰高或峰面积;:试样的峰高或峰面积;a: 标准曲线斜率;标准曲线斜率;b: 标准曲线截距标准曲线截距W:试样的重量(:试样的重量(g););V:试样提取液浓缩吹干后残余物溶解的总体积(:试样提取液浓缩吹干后残余物溶解的总体积(mL)。)。 Cs:已知标准添加浓度;:已知标准添加浓度;n标准曲线法计算

36、公式:标准曲线法计算公式: 兽药残留研究n单点校准法计算公式:单点校准法计算公式: X=AV/AsW 100%X:试样中待测物的回收率;:试样中待测物的回收率;A:试样的峰高或峰面积;:试样的峰高或峰面积;As:标准工作液的峰高或峰面积;:标准工作液的峰高或峰面积;W:试样的重量(:试样的重量(g););V:试样提取液浓缩吹干后残余物溶解的总体积:试样提取液浓缩吹干后残余物溶解的总体积(mL)。)。兽药残留研究回收率要求:回收率要求: 兽药残留研究n概念:概念: 指用某种方法重复测定同一均质样品所得指用某种方法重复测定同一均质样品所得测定值得彼此接近程度,表示分析结果得重复性。测定值得彼此接近

37、程度,表示分析结果得重复性。n表示方法:表示方法: 相对标准偏差(相对标准偏差(RSDRSD),又称变异系数),又称变异系数(CVCV),计算公式:),计算公式: RSDRSDSD/XSD/X. .100100b b精密度(精密度(precisionprecision)兽药残留研究n重复性(重复性(repeatability): 指在短期内相同的试验指在短期内相同的试验条件下对同一样品测定测定结果间的精密度。条件下对同一样品测定测定结果间的精密度。 批(日)内批(日)内RSD(within-run precision) 批(日)间批(日)间RSD(between-run precision)。

38、)。n 两层含义两层含义: :n 重现性重现性(reproducibility): 指不同实验条件下使用相指不同实验条件下使用相同分析方法对同一样品各个独立测定值间的变异程同分析方法对同一样品各个独立测定值间的变异程度。度。兽药残留研究精密度要求:精密度要求:兽药残留研究n检测限(检测限(limit of detection,LOD) 指分析方法能够从样品的背景信号中检测指分析方法能够从样品的背景信号中检测出待测物存在时所需的最低浓度,是反映分析出待测物存在时所需的最低浓度,是反映分析方法灵敏度的效能指标。方法灵敏度的效能指标。n一般要求残留分析方法的一般要求残留分析方法的LOD0.1MRL。

39、 C. C. 检测限与定量限检测限与定量限兽药残留研究n定量限(定量限(limit of quantitation,LOQ):): 指分析方法能够对样品中待测物进行定量指分析方法能够对样品中待测物进行定量测定的最低浓度。测定的最低浓度。LOQ反映了方法在低浓度端反映了方法在低浓度端分析结果的可靠性,一般要求分析结果的可靠性,一般要求CV20,回收,回收率率70。n通常要求残留分析方法的通常要求残留分析方法的LOQ0.2MRL。 兽药残留研究n待测物浓度与仪器的响应信号呈线性关系并能待测物浓度与仪器的响应信号呈线性关系并能满足定量要求的浓度范围,用浓度最小值和最满足定量要求的浓度范围,用浓度最小

40、值和最大值或两者之比表示。大值或两者之比表示。n采用直线回归的方法计算和描述。一般要求相采用直线回归的方法计算和描述。一般要求相关系数关系数r0.9990。 d线性范围(线性范围(linear range) 兽药残留研究e. e. 选择性(选择性(selectivityselectivity) n指样品基质中有其他成分共存时该分析指样品基质中有其他成分共存时该分析方法对待测物的分辨能力。方法对待测物的分辨能力。 (a)内源性物质的干扰。)内源性物质的干扰。 (b)代谢产物干扰。)代谢产物干扰。 (c)其他药物的干扰。)其他药物的干扰。兽药残留研究n遵循原则:遵循原则:(1)样品应包括实际样品;

41、)样品应包括实际样品;(2)普通方法至少有)普通方法至少有3个实验室参加。个实验室参加。(3)影响较大的方法,如拟向国内或国际上推)影响较大的方法,如拟向国内或国际上推 荐使用的方法,至少需荐使用的方法,至少需8个实验室参加。个实验室参加。 f f复核试验复核试验 兽药残留研究G. G. 报告报告 n概述概述: : 待测物相关分析方法的发展现状及存在的问题。待测物相关分析方法的发展现状及存在的问题。n操作方法操作方法: : 稳定性试验方法,提取方法,净化方法,测定方法。稳定性试验方法,提取方法,净化方法,测定方法。n方法评价方法评价: : 标准曲线,回收率,变异系数,检测限,定量限,标准曲线,

42、回收率,变异系数,检测限,定量限,选择性。选择性。n应用应用: :n附件附件: : 标准品、空白样品、添加样品和实测样品的色谱图,标准品、空白样品、添加样品和实测样品的色谱图,参考文献。参考文献。兽药残留研究5 5方法分类方法分类n按分离或检测原理可分为:按分离或检测原理可分为:(1 1)理化分析法。)理化分析法。 包括波谱法、色谱法及其联用技术。包括波谱法、色谱法及其联用技术。 (2 2)免疫分析法。)免疫分析法。 放射免疫测定法、酶联免疫测定法、荧光免疫放射免疫测定法、酶联免疫测定法、荧光免疫测定法等测定法等. . (3 3)生物测定法。)生物测定法。 如微生物测定法、放射受体测定法等。如

43、微生物测定法、放射受体测定法等。 兽药残留研究按残留分析目的和用途可分为:按残留分析目的和用途可分为: (1)筛选方法)筛选方法(screening methods)。 半定量和一定的定性能力,灵敏度高、过程简半定量和一定的定性能力,灵敏度高、过程简单、分析速度快。单、分析速度快。 (2)常规方法)常规方法(routine methods)。 准确的定量分析能力。准确的定量分析能力。 (3)确证方法()确证方法(confirmatory methods)。)。 高的灵敏度,准确的定性分析和定量分析能力。高的灵敏度,准确的定性分析和定量分析能力。重点在于定性功能。重点在于定性功能。 兽药残留研究

44、(1 1)单组分残留分析法。)单组分残留分析法。(2 2)多组分残留分析法。)多组分残留分析法。按被测组分数目可分为:按被测组分数目可分为:兽药残留研究第第4节节 各国兽药残留监控各国兽药残留监控兽药残留研究一、美一、美 国国(一)食品安全管理机构:(一)食品安全管理机构: (1)食品安全监察署()食品安全监察署(FSIS) (2)食品药物管理局()食品药物管理局(FDA) (3)动植物检验署()动植物检验署(APHIS) (4)环境保护局()环境保护局(EPA) (5)地方和州政府食品安全机构。)地方和州政府食品安全机构。 兽药残留研究n负责对国内负责对国内肉类、禽类和蛋类肉类、禽类和蛋类产

45、品的检验;产品的检验;n负责各有关残留监控机构的负责各有关残留监控机构的协调工作协调工作;负责相;负责相关的检测活动的关的检测活动的计划和执行计划和执行,进行国家残留检,进行国家残留检测计划;测计划;n负责负责向向FDAFDA报告报告药物、农药和其他污染物在肉、药物、农药和其他污染物在肉、禽和蛋类产品中的残留污染情况。禽和蛋类产品中的残留污染情况。FSIS:兽药残留研究FDA:n主要负责主要负责批准批准可使用的兽药和食品添加可使用的兽药和食品添加剂,建立动物源性食品中的兽药的允许剂,建立动物源性食品中的兽药的允许最大残留限量最大残留限量,并负责制定,并负责制定休药期休药期。兽药残留研究EPA:

46、n主要负责批准可使用的主要负责批准可使用的农药农药,建立在动,建立在动物源性食品中的物源性食品中的农药残留农药残留允许的最大残允许的最大残留限量。留限量。 兽药残留研究APHIS:n防止植物和动物的防止植物和动物的有害生物有害生物和和疾病疾病。兽药残留研究地方和州政府食品安全机构:地方和州政府食品安全机构:n主要管理其辖区内的主要管理其辖区内的所有食品所有食品,与,与FDAFDA和其他和其他联邦机构合作实施鱼、海产品、牛奶及其他国联邦机构合作实施鱼、海产品、牛奶及其他国内生产的食品的安全标准;内生产的食品的安全标准;n检验餐馆、杂货店、其他食品零售商店、牛奶检验餐馆、杂货店、其他食品零售商店、

47、牛奶厂及牛奶加工厂、谷堆及辖区范围的食品加工厂及牛奶加工厂、谷堆及辖区范围的食品加工厂;厂;n禁止州内不安全食品的销售和配送。禁止州内不安全食品的销售和配送。兽药残留研究n联邦食品药物及化妆品法联邦食品药物及化妆品法(FFDCA)n联邦肉类检验法联邦肉类检验法 (FMIA)n禽类制品检验法(禽类制品检验法(PPIA)n蛋类制品检验法(蛋类制品检验法(EPIA)。)。 (二)法律法规(二)法律法规兽药残留研究(一)管理机构(一)管理机构 1996年前,年前,农业与农产品部、卫生部、农业与农产品部、卫生部、工业部及渔业与海洋部。工业部及渔业与海洋部。 1997年,年,农业部下属的农业部下属的加拿大

48、食品监察加拿大食品监察署(署(CFIA)与卫生部。)与卫生部。 二、加拿大二、加拿大兽药残留研究n卫生部:卫生部: 负责负责制定制定所有国内出售的食品的所有国内出售的食品的安全安全与与营营养质量标准养质量标准以及食品安全的以及食品安全的相关政策相关政策,并通过,并通过应用加拿大卫生部的食品安全评估程序进行最应用加拿大卫生部的食品安全评估程序进行最后检查,后检查,评估评估CFIA的执行情况。的执行情况。兽药残留研究nCFIACFIA: 负责负责实施实施卫生部制定的卫生部制定的有关法规和标准有关法规和标准,并对法规和标准的执行情况进行并对法规和标准的执行情况进行监督监督; 负责负责安排安排具体活动

49、项目的具体活动项目的检查检查,如对所有,如对所有联邦登记了的屠宰场和加工公司的检查,对政府联邦登记了的屠宰场和加工公司的检查,对政府工作人员执行情况的检查以及对出口产品要满足工作人员执行情况的检查以及对出口产品要满足国外贸易要求标准的检查。国外贸易要求标准的检查。兽药残留研究n肉类检查法肉类检查法( MIA) 主要对主要对肉和家禽肉和家禽,规定了如何制定合法,规定了如何制定合法登记的生产单位生产安全、符合道德标准登记的生产单位生产安全、符合道德标准的肉类制品所应达到的标准和要求,以及的肉类制品所应达到的标准和要求,以及为防止欺诈在省级和国际市场上出售时的为防止欺诈在省级和国际市场上出售时的标识

50、的标准和要求。标识的标准和要求。 (二)法律法规(二)法律法规兽药残留研究n鱼类检查法鱼类检查法(FIA)(FIA) 主要对鱼和海产食品,规定了有关主要对鱼和海产食品,规定了有关鱼类产品和海洋植物的捕捞、运输和加鱼类产品和海洋植物的捕捞、运输和加工的标准和要求,包括了省级贸易和外工的标准和要求,包括了省级贸易和外贸进出口的鱼类产品和海洋植物。贸进出口的鱼类产品和海洋植物。 兽药残留研究n加拿大农产品法加拿大农产品法(CAPA)(CAPA) 对蛋、乳制品、蜜、鲜果、蔬菜和加工对蛋、乳制品、蜜、鲜果、蔬菜和加工产品,就如何监督在联邦登记注册的企业生产产品,就如何监督在联邦登记注册的企业生产农业产品

51、农业产品( (例如奶品、枫叶产品、加工品例如奶品、枫叶产品、加工品) )规定规定了基本原则,并制定了促进省级贸易和外贸进了基本原则,并制定了促进省级贸易和外贸进出口食品的安全和质量的标准。出口食品的安全和质量的标准。 兽药残留研究n食品药物法食品药物法(FDA)(FDA): 负责有关食品、药物、化妆品和负责有关食品、药物、化妆品和医疗器械的卫生安全和防止商业欺诈医疗器械的卫生安全和防止商业欺诈( (食食品检验署只负责其中的食品品检验署只负责其中的食品) )。 兽药残留研究n消费者保护和标识法消费者保护和标识法(CPLA)(CPLA) 应用于所有食品,防止包装食品和应用于所有食品,防止包装食品和

52、某些非食用产品在包装、标识、销售、某些非食用产品在包装、标识、销售、进口和广告方面的商业欺诈进口和广告方面的商业欺诈( (食品检验署食品检验署只负责食品部分只负责食品部分) )。 兽药残留研究三、中国三、中国(一)管理机构(一)管理机构n农业部兽医局农业部兽医局n中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所n省级兽医药品监察所省级兽医药品监察所n全国兽药残留专家委员会全国兽药残留专家委员会兽药残留研究农业部兽医局农业部兽医局n负责动物卫生有关工作,组织动物及动物产负责动物卫生有关工作,组织动物及动物产品检验检疫、兽药残留监控、动物及动物产品检验检疫、兽药残留监控、动物及动物产品卫生质量安全监督管理工作

53、;品卫生质量安全监督管理工作;n研究拟定动物医疗、动物实验的技术标准并研究拟定动物医疗、动物实验的技术标准并组织实施。组织实施。 n组织拟定动物卫生标准,负责制定、发布兽组织拟定动物卫生标准,负责制定、发布兽药国家标准、兽药残留限量标准和残留检测药国家标准、兽药残留限量标准和残留检测标准,并组织实施。标准,并组织实施。 兽药残留研究中国兽医药品监察所中国兽医药品监察所n负责兽药质量检验和兽药残留检验最终技术仲负责兽药质量检验和兽药残留检验最终技术仲裁;裁; n承担兽药残留标准的制、修订工作;承担兽药残留标准的制、修订工作;n承担兽药残留监控工作;承担兽药残留监控工作;n开展兽药残留检测工作;开

54、展兽药残留检测工作;n承担国家兽药残留基准实验室和省级残留试验承担国家兽药残留基准实验室和省级残留试验室的技术指导工作。室的技术指导工作。 兽药残留研究全国兽药残留专家委员会全国兽药残留专家委员会n主持兽药残留相关标准的制定与评估。主持兽药残留相关标准的制定与评估。如如MRL、休药期与检测方法标准、休药期与检测方法标准等。等。兽药残留研究(二)食品安全管理进程(二)食品安全管理进程n1994年,年,农业部发布农业部发布34种兽药的最高残留限种兽药的最高残留限量标准。量标准。n1997年,年,修订最高残留限量标准。修订最高残留限量标准。n1999年,年,再次修订最高残留限量标准,并将再次修订最高

55、残留限量标准,并将药物的品种扩大到药物的品种扩大到109种。种。n2002年,年,第三次修订最高残留限量标准,兽第三次修订最高残留限量标准,兽药品种增加到药品种增加到240多种。多种。兽药残留研究n1994年发布年发布饲料药物添加剂允许使用目录饲料药物添加剂允许使用目录,规定了规定了94种物质可以用作饲料药物添加剂。种物质可以用作饲料药物添加剂。n1997年规定了年规定了30种饲料药物添加剂的适用动物、种饲料药物添加剂的适用动物、适用阶段、使用剂量、停药期和配伍禁忌。适用阶段、使用剂量、停药期和配伍禁忌。n2000年版年版中国兽药典中国兽药典首次规定了首次规定了20多种兽药多种兽药的休药期。的

56、休药期。n2001年,重新规定了饲料药物添加剂使用规定。年,重新规定了饲料药物添加剂使用规定。n2003年,制定年,制定400余种兽药制剂的休药期标准。余种兽药制剂的休药期标准。兽药残留研究思考题思考题n残留的概念与特点。残留的概念与特点。n残留的毒理学评价程序与要求。残留的毒理学评价程序与要求。 n残留化学评价研究的主要内容及要求。残留化学评价研究的主要内容及要求。n最高残留限量和休药期确定方法。最高残留限量和休药期确定方法。n残留分析方法建立的基本步骤。残留分析方法建立的基本步骤。兽药残留研究n试述新药原料药研究的主要内容。试述新药原料药研究的主要内容。n试述新药主要药效学研究的基本要试述新药主要药效学研究的基本要求与注意事项。求与注意事项。小小 测测 验验兽药残留研究

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