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1、第19章 植物组织培养技术及其在育种中的应用植物组织培养技术是现代植物生物植物组织培养技术是现代植物生物技术的基本技术。技术的基本技术。植物组织培养技术及其在育种中的应用一、一、 现代生物技术及其基本概念现代生物技术及其基本概念（一）生物技术概念（一）生物技术概念 生物技术（生物技术（Biotechnology)，有时也，有时也称生物工程（称生物工程（Bioengineering）, 是指人是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的原理，按照程技术手段和其他基础科学的原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，预先的设计改造生物体
2、或加工生物原料，为人类产出所需产品。生物技术是一门综为人类产出所需产品。生物技术是一门综合性学科。现代生物技术已成功地应用于合性学科。现代生物技术已成功地应用于植物育种中。植物育种中。植物组织培养技术及其在育种中的应用（二）生物技术的种类（二）生物技术的种类1.基因工程（基因工程（Gene Engineering）2.细胞工程（细胞工程（Cell Engineering ）3.酶工程（酶工程（Enzyme Engineering ）4.发酵工程（发酵工程（Fermentation Engineering ）5.蛋白质工程（蛋白质工程（Protein Engineering ）植物组织培养技术及
3、其在育种中的应用（三）细胞工程（三）细胞工程 细胞工程就是在细细胞工程就是在细胞水平研究开发、胞水平研究开发、利用各类细胞的工利用各类细胞的工程。亦即人们根据程。亦即人们根据科学设计改变细胞科学设计改变细胞的遗传基础，通过的遗传基础，通过无菌操作，大量培无菌操作，大量培养细胞、组织乃至养细胞、组织乃至完整个体的技术。完整个体的技术。植物组织培养技术及其在育种中的应用（四）克隆概念（四）克隆概念1.分离基因的技术；分离基因的技术；2.扩增基因的技术；扩增基因的技术；3.将单一细胞扩增成细胞群体的技术；将单一细胞扩增成细胞群体的技术；4.将一个生命体复制成一个与之完全相同将一个生命体复制成一个与之
4、完全相同的新个体的过程；的新个体的过程；5.将单一个体扩增成一个遗传上完全相同将单一个体扩增成一个遗传上完全相同的群体。的群体。6.一个遗传上来源完全相同的生物群体一个遗传上来源完全相同的生物群体。植物组织培养技术及其在育种中的应用二、植物组织培养的基本步骤二、植物组织培养的基本步骤1、植物细胞的全能性（、植物细胞的全能性（Cell Totipotency） 一个植物细胞能产生一个完整植株一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称之为细胞的全能性。的固有能力称之为细胞的全能性。植物组织培养技术及其在育种中的应用2、植物离体分化的类型、植物离体分化的类型无菌短枝型无菌短枝型丛生芽增殖型丛生芽增殖
5、型器官发生型器官发生型胚状体发生型胚状体发生型原球茎发生型原球茎发生型植物组织培养技术及其在育种中的应用3、植物组织培养的特点、植物组织培养的特点培育材料经济；培育材料经济；培养条件可人为控制；培养条件可人为控制；生长周期短，繁殖率高；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。管理方便，利于自动化控制。植物组织培养技术及其在育种中的应用5、植物组织培养的基本操作、植物组织培养的基本操作无菌操作技术无菌操作技术细胞培养技术细胞培养技术原生质体融合技术原生质体融合技术植物组织培养技术及其在育种中的应用v接种用具的灭菌接种用具的灭菌 接种前，必须把用具放入接种室或箱内，初用接接种前，必须把用具
6、放入接种室或箱内，初用接种室或箱时要用甲醛（一般市售分析纯的有效成份为种室或箱时要用甲醛（一般市售分析纯的有效成份为 36-38% 熏蒸熏蒸5小时以上再开紫外光灯照射小时以上再开紫外光灯照射40-60分钟，分钟，以后在每次接种之前，把要接种的试管或三角瓶放入以后在每次接种之前，把要接种的试管或三角瓶放入接种室（箱）内，用接种室（箱）内，用5%的煤酚瓶皂溶液即来苏尔（一的煤酚瓶皂溶液即来苏尔（一般市售的有效成份为般市售的有效成份为47-53%）或）或 5% 的石灰炭酸液喷的石灰炭酸液喷雾消毒，再打开紫外光灯照雾消毒，再打开紫外光灯照20-40分钟，这样消毒后，分钟，这样消毒后，再经再经30-40
7、分钟便可进行接种。分钟便可进行接种。 植物组织培养技术及其在育种中的应用v接种材料的表面灭菌接种材料的表面灭菌 接接种种前前花花蕾蕾或或穗穗的的彻彻底底灭灭菌菌是是杜杜绝绝污污染染的的主主要要关关键键，先先用用70-75%的的酒酒精精浸浸泡泡10-15秒秒钟钟或或用用酒酒精精棉棉球球擦擦两两遍遍，初初步步杀杀死死表表面面所所带带的的微微生生物物，放放在在10%的的漂漂白白粉粉液液或或饱饱和和漂漂白白粉粉液液中中浸浸泡泡15-30分钟杀菌，然后用无菌水冲洗分钟杀菌，然后用无菌水冲洗2-3次。次。 消消毒毒过过的的穗穗子子或或花花蕾蕾用用消消毒毒纱纱布布包包好好，待待取取花花药药接接种种，注注意意
8、，穗穗子子或或花花蕾蕾的的操操作作要要在在无无菌菌条条件下进行。件下进行。植物组织培养技术及其在育种中的应用5、植物组织培养所需营养与环境条件、植物组织培养所需营养与环境条件（1）无机营养）无机营养大量元素：大量元素： 一般是指浓度大于一般是指浓度大于0.5mmol/L.氮氮(N) 、磷、磷(P) 、钾、钾(K) 、钙、钙(Ca) 、镁、镁(Mg) 、硫、硫(S) 。微量元素：微量元素： 包括铁包括铁(Fe) 、铜、铜(Cu) 、钼、钼(Mo) 、锌、锌(Zn) 、钠钠(Na) 、锰、锰(Mn) 、钴、钴(Co) 、硼、硼(B) 、碘、碘(I)。（2）有机营养）有机营养维生素、肌醇、氨基酸、有
9、机添加物。维生素、肌醇、氨基酸、有机添加物。（3）生长调节物）生长调节物生长素生长素：2，4 - D、奈乙酸奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA）、）、吲哚乙酸吲哚乙酸(IAA) 。细胞分裂素细胞分裂素：激动素（：激动素（KT）、）、6-苄基氨基嘌呤（苄基氨基嘌呤（6BA） 、玉米素玉米素（ZT）。）。赤霉素赤霉素（GA） ：脱落酸（脱落酸（ABA） 、乙烯利（乙烯利（CEDP）。）。植物组织培养技术及其在育种中的应用（4）琼脂）琼脂（5）能源和渗透压）能源和渗透压（6）其他成分）其他成分（7）温度）温度（8）光照（光强、光质）光照（光强、光质）培养基的配制：培养基的配制： 培养基母液
10、的配制培养基母液的配制 ；配制培养基的步骤；配制培养基的步骤；培养基的分装及灭菌。培养基的分装及灭菌。植物组织培养技术及其在育种中的应用6、植物组织培养经历的五个阶段：、植物组织培养经历的五个阶段：（1）预备阶段预备阶段外植体的获得；外植体的获得；接种材料的消毒处理；接种材料的消毒处理；配制适宜的培养基；配制适宜的培养基；（2）诱导去分化阶段诱导去分化阶段（3）继代增殖阶段）继代增殖阶段（4）生根成芽阶段）生根成芽阶段（5）移栽成活阶段）移栽成活阶段植物组织培养技术及其在育种中的应用三、植物组织培养技术在育种中的应用三、植物组织培养技术在育种中的应用种质资源保护；种质资源保护；优良品种快速繁殖
11、；优良品种快速繁殖；诱发和离体筛选突变体；诱发和离体筛选突变体；克服远缘杂交困难；克服远缘杂交困难；克服种子发育中的障碍；克服种子发育中的障碍；单倍体育种的技术环节单倍体育种的技术环节基因工程的基础技术基因工程的基础技术植物组织培养技术及其在育种中的应用（一）单倍体育种（一）单倍体育种1.单倍体的概念及其特点单倍体的概念及其特点 只含有一套染色体组的生物体；只含有一套染色体组的生物体； 被子植物的配子体世代。被子植物的配子体世代。矮小性；矮小性；不育性；不育性；全显性。全显性。植物组织培养技术及其在育种中的应用2. 单倍体植物在育种上的意义单倍体植物在育种上的意义1.单倍体植物的直接利用；单倍
12、体植物的直接利用；2.克服杂种分离，缩短育种年限；克服杂种分离，缩短育种年限；3.快速获得异花授粉植物的自交系；快速获得异花授粉植物的自交系；4.单倍体植物的诱变育种；单倍体植物的诱变育种；5.克服远缘杂种不孕性与不稳定的现象；克服远缘杂种不孕性与不稳定的现象；植物组织培养技术及其在育种中的应用3. 单倍体植株和愈伤组织的培养单倍体植株和愈伤组织的培养（1）单倍体材料的采集）单倍体材料的采集 单单倍倍体体育育种种的的首首要要问问题题是是如如何何获获得得大大最最的的单单倍倍体体植植株株。据据现现有有的的研研究究材材料料，用用花花药药培培养养产产生生单倍体植株有两个途径单倍体植株有两个途径: 第第
13、一一是是在在离离体体培培养养的的花花药药中中，花花粉粉经经过过类类似似胚胚胎胎发发育育的的过过程程直直接接形形成成单单倍倍体体植植物物，如如烟烟草草、曼陀罗等。曼陀罗等。 第二是在离体培养的花药中，花粉形成愈伤第二是在离体培养的花药中，花粉形成愈伤组织，再从愈伤组织分化出单倍体植株。组织，再从愈伤组织分化出单倍体植株。植物组织培养技术及其在育种中的应用（2）花药的接种）花药的接种v接种前的准备工作接种前的准备工作 接接种种和和培培养养花花药药是是在在无无菌菌条条件件下下进进行行的的，所所用的一切用具必须彻底灭菌。用的一切用具必须彻底灭菌。v花粉发育时期的鉴定花粉发育时期的鉴定 适适宜宜的的花花
14、粉粉发发育育时时期期对对于于提提高高花花粉粉诱诱导导愈愈伤伤组组织织分分化化的的频频率率是是很很重重要要的的，为为此此，进进行行花花药药培培养前，要用显微镜进行花粉发育时期的鉴定。养前，要用显微镜进行花粉发育时期的鉴定。 经显微镜检查后，把花粉细胞的发育进期与经显微镜检查后，把花粉细胞的发育进期与花药或花序的外部形态联系起来，找出花粉单核花药或花序的外部形态联系起来，找出花粉单核期或单核期的花蕾或花序的外部形态标志选取花期或单核期的花蕾或花序的外部形态标志选取花药进行接种培养。药进行接种培养。 植物组织培养技术及其在育种中的应用 （3）从愈伤组织分化成苗）从愈伤组织分化成苗 诱诱导导愈愈伤伤组
15、组织织分分化化出出根根、茎茎、叶叶的的方方法法是是在在愈愈伤伤组组织织长长到到1-3毫毫米米大大小小（如如小小米米大大）时时，即即可可转转移移到到诱诱导导分分化化培培养养基基上上，促促使使分分化化长长出出植植株株。一一般般说说来来，愈愈伤伤组组织织如如果果先先形形成成芽芽，随随后后根根自自然然会会发发生生，如如果果先先有有根根，以以后后不不一一定定会会出出芽芽。因因此此，掌握芽分化的条件是十分重要的。掌握芽分化的条件是十分重要的。 愈愈伤伤组组织织转转移移培培养养工工作作是是在在无无菌菌室室或或接接种种箱箱内内进进行行的的，转转移移后后愈愈伤伤组组织织培培养养在在23-28恒恒温温室室内内，每
16、每日日光光照照9-11小小时时，可可用用日日光光灯灯作作辅辅助助光，光强度在光，光强度在2000勒克斯以上。勒克斯以上。 在转移愈伤组织时，应注意其极性，原来在转移愈伤组织时，应注意其极性，原来向上的一但转移后的一但转移后仍应向上，否则向上的一但转移后的一但转移后仍应向上，否则会影响生长，同时在转移时，就避免沾带过多的会影响生长，同时在转移时，就避免沾带过多的培养基。培养基。 植物组织培养技术及其在育种中的应用4. 染色体加倍染色体加倍处理方式：处理方式：l试管内进行；试管内进行；l花粉植株定植后进行；花粉植株定植后进行；药剂处理；药剂处理；植株鉴定。植株鉴定。 植物组织培养技术及其在育种中的
17、应用单倍体育种程序：单倍体育种程序：材料采集材料采集 接种培养接种培养 诱导愈伤组织诱导愈伤组织 获得再生植株获得再生植株 染色体加倍染色体加倍 幼苗培幼苗培育和品种选择育和品种选择 植物组织培养技术及其在育种中的应用（二）原生质体培养与体细胞杂交（二）原生质体培养与体细胞杂交 常规杂交育种由于物种间难以逾越常规杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。的天然屏障而举步维艰。 科学家们受细科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图通过这逐渐将眼光转向细胞融合，试图通过这种崭新的手段冲破自然界的禁锢。种崭新的手段冲破自然界的
18、禁锢。植物组织培养技术及其在育种中的应用1.原生质体的概念原生质体的概念 植物细胞原生质体是指那些以去除植物细胞原生质体是指那些以去除全部细胞壁的细胞。全部细胞壁的细胞。 此时，细胞外仅由此时，细胞外仅由细胞膜包裹，细胞膜包裹， 呈圆形只有在高渗溶液中呈圆形只有在高渗溶液中才能相对稳定。才能相对稳定。 原生质体经适当处理，可与其他细原生质体经适当处理，可与其他细胞融合成新的体细胞胞融合成新的体细胞。植物组织培养技术及其在育种中的应用2. 原生质体的特点原生质体的特点比完整的细胞更容易获得外来遗传物质，比完整的细胞更容易获得外来遗传物质，为实现异源遗传物质转化提供了较好的为实现异源遗传物质转化提
19、供了较好的实验材料。实验材料。原生质体在一定条件下可以融合成杂种原生质体在一定条件下可以融合成杂种细胞，开辟了一条新的育种途径。细胞，开辟了一条新的育种途径。植物组织培养技术及其在育种中的应用3. 发展概况发展概况1892， J. A. Klerker 用机械法获得原生质体；用机械法获得原生质体；1960，E.C. Cocking 用酶法首先从番茄根尖中分离出用酶法首先从番茄根尖中分离出大量有活性的原生质体并通过培养再生出细胞壁大量有活性的原生质体并通过培养再生出细胞壁形成再生植株形成再生植株;1960，G. Barski发现发现, 题细胞原生质体能融合在一起题细胞原生质体能融合在一起形成单核
20、的、并能进行分裂的杂种细胞；形成单核的、并能进行分裂的杂种细胞；1972，P.S.Carlon首次获得烟草体细胞种间杂种。首次获得烟草体细胞种间杂种。80s 此项技术在我国得到发展。此项技术在我国得到发展。植物组织培养技术及其在育种中的应用4. 原生质体的制备原生质体的制备（1）取材与灭菌）取材与灭菌（2）酶解）酶解 (纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶) （3）分离）分离 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）（沉淀法、漂洗法、滴洗法）（4）洗涤）洗涤（5）鉴定（形态观测、活性鉴定）鉴定（形态观测、活性鉴定）原生质体的培养：原生质体的培养：细胞壁再生；细胞壁再生；细胞分裂；细胞分裂
21、；植株再生。植株再生。植物组织培养技术及其在育种中的应用5. 原生质体的融合原生质体的融合v化学法诱导融合化学法诱导融合1)按比例混合双亲原生质体按比例混合双亲原生质体- 2)滴加滴加PEG- 3)滴加高钙高滴加高钙高PH值溶液值溶液- 4)洗涤原生质体溶液洗涤原生质体溶液- 5)离心获得原生质体溶液离心获得原生质体溶液-6)筛选杂种细胞筛选杂种细胞-7)再生杂种细胞再生杂种细胞。植物组织培养技术及其在育种中的应用v物理法诱导融合物理法诱导融合基本程序：基本程序：l原生质体的获得；原生质体的获得；l电击融合；电击融合；l筛选杂种细胞；筛选杂种细胞；l杂种细胞再生和完杂种细胞再生和完整植株的形成
22、。整植株的形成。植物组织培养技术及其在育种中的应用6. 融合细胞的培养鉴定与筛选融合细胞的培养鉴定与筛选杂和细胞的显微镜鉴别；杂和细胞的显微镜鉴别；互补法鉴定杂和细胞；互补法鉴定杂和细胞；细胞与分子生物学法；细胞与分子生物学法；植株形态的鉴别。植株形态的鉴别。植物组织培养技术及其在育种中的应用植物组织培养技术及其在育种中的应用（三）人工种子（三）人工种子 人工种子即人为制造的种子，它人工种子即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素、及其他成分的人工胶囊。分、激素、及其他成分的人工胶囊。其具有种子的功能，可直接用于田间其具有种子的功能，可直接用
23、于田间播种。播种。植物组织培养技术及其在育种中的应用 1、人工种子的构成人工种子的构成 人工种皮人工种皮 胚胚 状状 体体 人工胚乳人工胚乳植物组织培养技术及其在育种中的应用2、人工种子的特点人工种子的特点：（1）可以不受环境条件的限制，周年进行生产；）可以不受环境条件的限制，周年进行生产；（2）经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系）经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系 的优良性状；的优良性状；（3）成本低，适于田间机械化生产；）成本低，适于田间机械化生产；（4）可根据需要调节胚乳成分。）可根据需要调节胚乳成分。植物组织培养技术及其在育种中的应用3、人工种子的制备人工种子的制备（1）胚状体的制
24、备及其同步生长；）胚状体的制备及其同步生长；（2）人工胚乳的制备；）人工胚乳的制备；（3）配制包埋剂及人工包埋。）配制包埋剂及人工包埋。植物组织培养技术及其在育种中的应用人工种子包埋示意图人工种子包埋示意图 4%海藻酸钠 体细胞胚 包埋丸 2% CaCl 人工种子 水 植物组织培养技术及其在育种中的应用4、人工种子的贮存与萌发、人工种子的贮存与萌发 低温、干燥、洁净。低温、干燥、洁净。植物组织培养技术及其在育种中的应用（四）基因工程（四）基因工程（一）基因工程的含义 按照人们的愿望， 进行严密的设计， 通过体外 DNA重组技术 和DNA转移技术，有目的地改造生物种性， 使现有物种在短时间内趣于
25、完善， 创造出新的生物类型。植物组织培养技术及其在育种中的应用致癌农杆菌介导的致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法质粒载体转化法植物组织培养技术及其在育种中的应用2、重组、重组DNA的直接转化法的直接转化法微粒散射技术微粒散射技术 (Particle bombardment)植物组织培养技术及其在育种中的应用（二）基因工程的基本步骤1、目的基因的克隆与鉴定；2、植物表达载体的构建；3、植物的遗传转化；4、转化细胞的筛选；5、转基因植株的鉴定。植物组织培养技术及其在育种中的应用基因基因基因克隆基因克隆基因转化基因转化DNA重组技术重组技术植物遗传转化技术植物遗传转化技术植物组织培养技术植物组织培养
26、技术植物组织培养技术及其在育种中的应用分子标记技术在育种中的应用分子标记技术在育种中的应用1. DNA1. DNA遗传标记的特点：遗传标记的特点：v 数量极多；数量极多；v 遗传上稳定；遗传上稳定；v 排除了环境差异排除了环境差异. .植物组织培养技术及其在育种中的应用2. DNA2. DNA遗传标记的应用遗传标记的应用v构建遗传图谱；构建遗传图谱；v分析亲缘关系；分析亲缘关系；v定位农艺性状；定位农艺性状；v分子标记辅助选择；分子标记辅助选择；v种质资源及杂种后代的鉴定。种质资源及杂种后代的鉴定。植物组织培养技术及其在育种中的应用3. 分子标记技术分子标记技术1.RFLP Restriction fragment length polymorphisms2.RAPD3.AFLP4.SSR5.SSLP植物组织培养技术及其在育种中的应用
