天然药物化学成分提取分离鉴定方法与技术色谱法

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1、第二章第二章提取分离鉴定的方法与技术提取分离鉴定的方法与技术色谱法色谱法1 1 碳酸钙碳酸钙（固定相）（固定相）色素混合液色素混合液石油醚石油醚 (流动相）流动相）1906年，年，Tsweet发现色谱分离现象发现色谱分离现象色谱柱色谱柱色带色带色带色带2“ “像像像像光光光光谱谱谱谱中中中中的的的的光光光光线线线线一一一一样样样样，色色色色素素素素混混混混合合合合物物物物的的的的不不不不同同同同组组组组分分分分有有有有规规规规律律律律地地地地排排排排列列列列在在在在碳酸钙柱上而彼此分离。碳酸钙柱上而彼此分离。碳酸钙柱上而彼此分离。碳酸钙柱上而彼此分离。” ”Tsweet,Tsweet,德德德德

2、国国国国植植植植物物物物学学学学报报报报, , 1906.1906.3 3柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱薄层色谱薄层色谱薄层色谱薄层色谱纸色谱纸色谱纸色谱纸色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱色谱法（色谱法（Chromatography） 一、色谱法在研究天然药物有效成分中的应用、色谱法在研究天然药物有效成分中的应用：分离混合物分离混合物精制化合物精制化合物鉴定化合物鉴定化合物4 4二、原理：二、原理： 利用混合物中各成分在固定相和移动相利用混合物中各成分在固定相和移动相中中吸附吸附、分配分配及其及其亲和力亲和力的差异而达到分离。的差异而达到分离。色谱的三要素色谱的三要素固定相固定相

3、移动相移动相被分离被分离 物质物质5 5三者相互关系三者相互关系 ？按原理不同可分为：按原理不同可分为： 吸附色谱法吸附色谱法* * 分配色谱法分配色谱法* * 离子交换色谱法离子交换色谱法 凝胶滤过色谱法凝胶滤过色谱法（分子筛滤过色谱）（分子筛滤过色谱） 大孔吸附树脂法大孔吸附树脂法 高效液相色谱法（自学）高效液相色谱法（自学） 气相色谱法（自学）气相色谱法（自学）6 6三、分类：三、分类： 吸附色谱法吸附色谱法 *（Adsorption Chromatography )1 1）原理）原理： 利用吸附剂对混合物中各成分分子利用吸附剂对混合物中各成分分子吸附吸附能力能力的差异而达到分离的色谱法

4、。的差异而达到分离的色谱法。2 2）分类：）分类： 物理吸附物理吸附 化学吸附化学吸附 半化学吸附半化学吸附 7 78 8 8 8vv物理吸附物理吸附*：vv化学吸附化学吸附：vv半化学吸附半化学吸附：“相似者易吸附相似者易吸附”避免避免氢键形成氢键形成能力能力分子间力，无选择性，分子间力，无选择性，分子间力，无选择性，分子间力，无选择性，可逆。可逆。可逆。可逆。硅胶、氧化铝、活性炭硅胶、氧化铝、活性炭硅胶、氧化铝、活性炭硅胶、氧化铝、活性炭化学键，选择性较强，常化学键，选择性较强，常化学键，选择性较强，常化学键，选择性较强，常不可逆不可逆不可逆不可逆。硅胶硅胶硅胶硅胶-生物碱生物碱生物碱生物

5、碱碱性氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝-黄酮、蒽醌等黄酮、蒽醌等黄酮、蒽醌等黄酮、蒽醌等氢键，选择性较弱，氢键，选择性较弱，氢键，选择性较弱，氢键，选择性较弱，多可逆。多可逆。多可逆。多可逆。 聚酰胺聚酰胺聚酰胺聚酰胺3）吸附色谱的三要素）吸附色谱的三要素固定相固定相（吸附剂）（吸附剂）移动相移动相（溶剂溶剂）被分离被分离 物质物质9 9溶溶解解能能力力流动相流动相溶质溶质吸附吸附剂剂吸附作用吸附作用竞争竞争在在液液- -固固吸吸附附色色谱谱中中，溶溶质质的的保保留留和和分分离离选选择择性决定于下列三个因素：性决定于下列三个因素：1010吸附作用吸附作用1111v硅硅 胶：胶：适用于中性和

6、酸性成分适用于中性和酸性成分v氧化铝：氧化铝：适用于中性和碱性成分适用于中性和碱性成分v活性炭：活性炭：非极性吸附剂非极性吸附剂v聚酰胺：聚酰胺：高分子聚合物高分子聚合物, ,氢键吸附氢键吸附极极 性性 吸吸 附附 剂剂a a、吸附剂（固定相）、吸附剂（固定相）1212硅胶（硅胶（silica） SiO2 XH2O 酸性、亲水性吸附剂。酸性、亲水性吸附剂。结构：结构：内部内部内部内部-硅氧交联结构硅氧交联结构硅氧交联结构硅氧交联结构多孔结构多孔结构多孔结构多孔结构范德华力范德华力范德华力范德华力 表面表面表面表面-有硅醇基有硅醇基有硅醇基有硅醇基氢键吸附氢键吸附氢键吸附氢键吸附适用于中性或酸性

7、亲脂适用于中性或酸性亲脂性成分的分离。性成分的分离。1313 特性：特性： 1 1 1 1）极性吸附剂，极性吸附剂，“相似者易吸附相似者易吸附” 物质极性物质极性，吸附能力，吸附能力 2 2 2 2）吸水吸水失活失活 105105105105110110110110O O O OC C C C烘干烘干烘干烘干30303030分钟分钟分钟分钟( ( ( (可逆失水可逆失水可逆失水可逆失水)吸附力最大吸附力最大吸附力最大吸附力最大 500500500500O O O OC C C C烘干烘干烘干烘干( ( ( (不可逆失水不可逆失水不可逆失水不可逆失水)活性丧失，无吸附力活性丧失，无吸附力活性丧失

8、，无吸附力活性丧失，无吸附力注意：注意：活化温度不宜高，不宜分离碱性物质。活化温度不宜高，不宜分离碱性物质。 氧化铝（氧化铝（aluminium oxide） 极极性性吸吸附附剂剂，最最适适于于分分离离植植物物中中的的碱碱性或中性的亲脂性成分性或中性的亲脂性成分。 有酸性、碱性和中性三种规格。有酸性、碱性和中性三种规格。 吸吸附附特特性性与与硅硅胶胶类类似似，但但碱碱性性氧氧化化铝铝不宜分离酸性物质不宜分离酸性物质。1414聚酰胺（聚酰胺（polyamide）结构结构：-CH2-CO-NH-n原理原理：氢键吸附学说氢键吸附学说 1515酰酰氨氨基基与与化化合合物物（羟羟基基、羧羧基基及及醌醌基

9、基）形形成氢键吸附。成氢键吸附。1616用途用途：分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。影响吸附强弱的因素影响吸附强弱的因素：1 1、流流动动相相：水水甲甲醇醇或或乙乙醇醇丙丙酮酮氯氯仿仿稀氨水甲酰胺稀氨水甲酰胺; ;2 2、分分子子结结构构：a a、形形成成氢氢键键数数目目多多，吸吸附附能能力力强强。b b、形形成成分分子子内内氢氢键键，吸吸附附力力减减弱弱。C C、芳香化合物中，共轭双键多，吸附牢。、芳香化合物中，共轭双键多，吸附牢。化合物结构对化合物结构对化合物结构对化合物结构对聚酰胺吸附作聚酰胺吸附作聚酰胺吸附作聚酰胺吸附作用的影响用的影响用的

10、影响用的影响形成氢键的数目形成氢键的数目形成氢键的数目形成氢键的数目成键基团位置成键基团位置成键基团位置成键基团位置双键的数目双键的数目双键的数目双键的数目分子内氢键分子内氢键分子内氢键分子内氢键1717课本第课本第3333页页活性炭活性炭（activated carbon） 非非极极性性吸吸附附剂剂，对对非非极极性性物物质质具具有有较较强强的亲和力，在的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力水中对溶质表现出强的吸附能力。 从从活活性性炭炭上上洗洗脱脱被被吸吸附附的的物物质质时时，溶溶剂剂的的极性越小，洗脱能力越强。极性越小，洗脱能力越强。1818特别适合水溶性物质的分离特别适合水溶性物质的分

11、离。b b、溶、溶 剂剂 （移动相）（移动相）遵循遵循“相似相溶相似相溶”及及“相似者易吸附相似者易吸附”原理：原理：极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈强；极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈强；非极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈弱。非极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈弱。c、被分离物质、被分离物质遵循遵循“相似相溶相似相溶”及及“相似者易吸附相似者易吸附”原理：原理：对于极性吸附剂而言：对于极性吸附剂而言：被分离成分极性大，吸附牢，难以洗脱；被分离成分极性大，吸附牢，难以洗脱；被分离成分极性小，吸附力弱，容易洗脱。被分离成分极性小，吸附力弱，容易洗脱。1919

12、一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强：CH2CH2，CH2=CH2，OCH3，COOR，C=O，CHO，NH2，OH，COOH四、操作方式四、操作方式 1、薄层色谱法（、薄层色谱法（TLC）* 定定义义：将将吸吸附附剂剂均均匀匀的的铺铺在在平平板板上上，把把要要分分离离分分析析的的样样品品点点加加到到薄薄层层色色谱谱板板上上，然然后后用用适适当当的的溶溶剂剂系系统统展展开开，在在一一定定的的条条件件下下显显色色或或直直接接在在日日光光或或紫紫外外光光下下观观察察所所获获得得的的斑斑点点，从从而而达达到到分分离离、分分析析、鉴定鉴定的目的。的目的。20201）薄层色谱的吸附剂和支持剂：）薄层色

13、谱的吸附剂和支持剂： 在在选选用用吸吸附附剂剂或或支支持持剂剂时时，一一般般是是根根据据被被分分离离物物质质的的化化学学性性质质来来选选用用。当当不不了了解解被被分分离离物物质质的的化化学学性性质质时时，可可以以先先选选用用最最常常用用的的硅硅胶胶或或氧氧化化铝铝，如如果果分分离离效效果果不不好好，可可再再改用其他的吸附剂或支持剂。改用其他的吸附剂或支持剂。 2121常用的常用的硅胶硅胶吸附剂吸附剂粒径：粒径：200-300200-300目目种类：硅胶种类：硅胶G G硅胶硅胶+ +粘合剂煅石膏粘合剂煅石膏 硅胶硅胶GF254GF254含有荧光物质含有荧光物质 硅胶硅胶H H 不含粘合剂煅石膏不

14、含粘合剂煅石膏 硅胶硅胶HF254 HF254 含有荧光物质含有荧光物质2222常用的常用的展开展开剂剂正己烷、环己烷正己烷、环己烷 、四氯化碳、甲苯、氯仿、四氯化碳、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水2323理想的溶剂应能使混合物分离后各组分的理想的溶剂应能使混合物分离后各组分的RfRf值相差尽可能大，且尽量在值相差尽可能大，且尽量在0.2-0.80.2-0.8之间。之间。当单一溶剂不能很好地展开各组分时，常选当单一溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。择用混合溶剂作为展开剂。2）薄层色谱的一般操作）薄层色谱的一般操作a

15、 a、制板、制板b b、活化、活化c c、点样、点样d d、展开、展开e e、显色、显色f f、计算比移值、计算比移值 2424操作技术操作技术手工铺板手工铺板 取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在研钵中研钵中研钵中研钵中向一个方向研磨向一个方向研磨向一个方向研磨向一个方向研磨混合成均匀糊状（无气泡和混合成均匀糊状（无气泡和混合成均匀糊状（无气泡和混合成均匀糊状（无气泡和结块），均匀涂布在薄层板上。结块），均匀涂布在薄层板上。结块），均匀涂布在薄层板上。结块），均匀涂布在

16、薄层板上。玻璃板玻璃板玻璃板玻璃板层析专用玻璃板，清洗干净层析专用玻璃板，清洗干净层析专用玻璃板，清洗干净层析专用玻璃板，清洗干净用量用量用量用量1010101020202020cmcmcmcm，3g3g3g3g硅胶硅胶硅胶硅胶黏合剂黏合剂黏合剂黏合剂0.0.0.0.3 3 3 30.0.0.0.8 8 8 8% % % % CMC-NCMC-NCMC-NCMC-Na a a a溶液，溶液，溶液，溶液，干燥干燥干燥干燥水平台面，室温下自然完全晾干水平台面，室温下自然完全晾干水平台面，室温下自然完全晾干水平台面，室温下自然完全晾干检查检查检查检查表面光滑平整，均匀，无杂质表面光滑平整，均匀，无杂

17、质表面光滑平整，均匀，无杂质表面光滑平整，均匀，无杂质操操作作要要点点2525裂开的薄层板不能使用裂开的薄层板不能使用裂开的薄层板不能使用裂开的薄层板不能使用! ! 操作技术操作技术活化活化 涂涂涂涂布布布布后后后后的的的的薄薄薄薄层层层层先先先先在在在在室室室室温温温温下下下下阴阴阴阴干干干干，至至至至完完完完全全全全干干干干透透透透后后后后，在在在在使使使使用用用用前前前前置置置置适适适适当当当当温温温温度度度度烘烘烘烘烤烤烤烤一一一一定定定定时时时时间间间间进进进进行行行行活活活活化化化化，然然然然后后后后置干燥器中备用。置干燥器中备用。置干燥器中备用。置干燥器中备用。 硅胶硅胶硅胶硅胶

18、 105-110 30 105-110 30 105-110 30 105-110 30- - - -60min60min60min60min氧化铝氧化铝氧化铝氧化铝 105-110 30min 105-110 30min 105-110 30min 105-110 30min2626操作技术操作技术点样点样定量微升毛细管定量微升毛细管定量微升毛细管定量微升毛细管薄层点样毛细管薄层点样毛细管薄层点样毛细管薄层点样毛细管vv配配配配制制制制样样样样品品品品的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂具具具具高高高高度度度度挥挥挥挥发发发发性性性性和和和和尽尽尽尽可可可可能能能能非非非非极极极极性性性性，否否否否则则

19、则则易使斑点扩展。易使斑点扩展。易使斑点扩展。易使斑点扩展。vv采采采采用用用用多多多多次次次次点点点点加加加加法法法法，第第第第二二二二次次次次点点点点加加加加时时时时应应应应待待待待前前前前一一一一次次次次点点点点加加加加的的的的溶溶溶溶剂挥发后再进行。剂挥发后再进行。剂挥发后再进行。剂挥发后再进行。vv点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差。（1 15ul5ul）2727点样示意图点样示意图vv样品溶液的配制样品溶液的配制样品溶液的配制样品溶液的

20、配制 vv点样点样点样点样 对照样对照样对照样对照样反应混合反应混合反应混合反应混合液样液样液样液样点样直径点样直径 2mm2mm，1cm1cm点间距点间距 1.5cm1.5cm1-2cm1-2cm2828C、展开、展开薄薄薄薄层层层层色色色色谱谱谱谱的的的的展展展展开开开开方方方方式式式式有有有有上上上上行行行行、下下下下行行行行、单单单单向向向向、双双双双向向向向、多次、径向等多种方式。多次、径向等多种方式。多次、径向等多种方式。多次、径向等多种方式。多多多多数数数数采采采采用用用用直直直直线线线线形形形形上上上上行行行行展展展展开开开开，薄薄薄薄层层层层板板板板水水水水平平平平角角角角度

21、度度度以以以以75757575 为最佳。为最佳。为最佳。为最佳。2929vv展开剂要接触到吸附剂展开剂要接触到吸附剂展开剂要接触到吸附剂展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样下沿，但切勿接触到样下沿，但切勿接触到样下沿，但切勿接触到样点（点（点（点（0.5cm0.5cm0.5cm0.5cm左右高度）。左右高度）。左右高度）。左右高度）。vv盖上盖子，展开。盖上盖子，展开。盖上盖子，展开。盖上盖子，展开。vv观察展开情况。观察展开情况。观察展开情况。观察展开情况。vv取出薄层板取出薄层板取出薄层板取出薄层板预饱和中预饱和中展开中展开中3030预防预防 边缘效应边缘效应操作技术操作技术显色显色显

22、色喷雾瓶显色喷雾瓶显色喷雾瓶显色喷雾瓶三用紫外灯三用紫外灯三用紫外灯三用紫外灯vv本身带有颜色本身带有颜色本身带有颜色本身带有颜色vv本身无颜色本身无颜色本身无颜色本身无颜色vv含有荧光剂的薄层板含有荧光剂的薄层板含有荧光剂的薄层板含有荧光剂的薄层板 有色斑点有色斑点有色斑点有色斑点 显色剂显色显色剂显色显色剂显色显色剂显色 暗色斑点暗色斑点暗色斑点暗色斑点 观察方法：日光、荧光、显色。观察方法：日光、荧光、显色。观察方法：日光、荧光、显色。观察方法：日光、荧光、显色。3131vv本身带有荧光本身带有荧光本身带有荧光本身带有荧光 荧光斑点荧光斑点荧光斑点荧光斑点 3232定定义义：样样品品经经

23、色色谱谱分分离离后后，某某成成分分从从原原点点至至该该成成分分斑斑点点中中心心的的距距离离与与从从原原点点至至展展开开剂剂前前沿沿的的距距离的比值称为该成分的比移值（离的比值称为该成分的比移值（RfRf值）。值）。 原点至色谱斑点中心的距离原点至色谱斑点中心的距离 比移值（比移值（Rf值）值） 原点至展开剂前沿的距离原点至展开剂前沿的距离3333操作技术操作技术测定比移值测定比移值0.2-0.80.2-0.8RfRf值越大，化合物的极性？值越大，化合物的极性？3434上上样样量量大大，常常用用于于制制备备分分离离，是是分分离离天天然然化化学成分最常用的方法。学成分最常用的方法。定定义义：柱柱色

24、色谱谱是是一一种种将将分分离离材材料料装装入入柱柱状状容容器器中中, ,以以适适当当的的洗洗脱脱剂剂进进行行洗洗脱脱而而使使不不同同成成分分得得到到分分离离的的色谱方法。色谱方法。2、柱色谱、柱色谱*3535其原理、吸附剂及洗脱剂的选择与薄层色谱其原理、吸附剂及洗脱剂的选择与薄层色谱法相同。法相同。操作步骤：操作步骤：注意点：上柱的样品须经过注意点：上柱的样品须经过纯化处理纯化处理（过滤、（过滤、萃取、脱色、沉淀等）萃取、脱色、沉淀等）3636纯纯化化装装柱柱上上样样洗洗脱脱1）装柱）装柱实实验验室室常常用用的的柱柱内内径径与与柱柱长长之之比比通常为通常为1:151:151:201:20。若柱

25、粗而短，则分离效果较差。若柱粗而短，则分离效果较差。若若柱柱过过长长而而细细，分分离离效效果果虽虽好好，但流速慢，消耗时间太长。但流速慢，消耗时间太长。3737a a、干法、干法b b、湿湿法法：因因湿湿法法装装柱柱容容易易赶赶走走硅硅胶胶内内的的气气泡泡，故一般以湿法装柱较好。故一般以湿法装柱较好。 38382）上样）上样3939a a、样品、样品易溶于易溶于洗脱剂：湿法上上样洗脱剂：湿法上上样b b、样品难溶于洗脱剂：干法上样、样品难溶于洗脱剂：干法上样将样品溶解于少量洗脱剂，制成高浓度溶液将样品溶解于少量洗脱剂，制成高浓度溶液后慢慢上柱。后慢慢上柱。将将样样品品溶溶解解于于少少量量甲甲醇

26、醇或或丙丙酮酮后后，均均匀匀拌拌入入适适量量吸吸附附剂剂（1:2-1:31:2-1:3），水水浴浴挥挥干干溶溶剂剂。均均匀匀平铺至柱子顶端。平铺至柱子顶端。 梯度洗脱：洗脱剂极性从小到大。梯度洗脱：洗脱剂极性从小到大。 洗脱剂液面高度始终要高于柱面。洗脱剂液面高度始终要高于柱面。 控制洗脱剂流速为匀速。控制洗脱剂流速为匀速。 有色成分收集各色带洗脱液。有色成分收集各色带洗脱液。 无色成分则采用等分收集。无色成分则采用等分收集。 浓浓缩缩洗洗脱脱液液，薄薄层层检检识识后后合合并并相相同同流流分分。混混合合 成分则进一步分离。成分则进一步分离。3）洗脱）洗脱4040植物色素分离图示植物色素分离图示

27、植物色素分离图示植物色素分离图示414242 分配色谱法是以液体做固定相，用与其不分配色谱法是以液体做固定相，用与其不相混溶的的溶剂做流动相的相混溶的的溶剂做流动相的液液- -液色谱法液色谱法。一、基本原理一、基本原理利用被分离成分在固定相和流动相中的利用被分离成分在固定相和流动相中的溶解度溶解度不同。不同。易溶于流动相的成分，移动速度快。易溶于流动相的成分，移动速度快。易溶于固定相的成分，移动速度慢。易溶于固定相的成分，移动速度慢。分配色谱法分配色谱法 *（ Distribution ChromatographyDistribution Chromatography）溶溶解解能能力力流动相流

28、动相溶质固定相固定相竞争竞争在在液液- -液液分分配配色色谱谱中中，溶溶质质的的保保留留和和分分离离选选择择性取决于其在固定相和流动相中的性取决于其在固定相和流动相中的溶解度溶解度：4343溶溶溶溶解解解解能能能能力力力力二、分二、分配色谱中的固定相和配色谱中的固定相和流动相流动相固定相：被支持剂固定的固定相：被支持剂固定的溶剂。溶剂。流动相：与固定相不相混溶的另一相溶剂。流动相：与固定相不相混溶的另一相溶剂。4444支持剂支持剂固定相固定相流动相流动相待分离物质待分离物质分配色谱分配色谱四要素四要素-固体固体-液体液体-液体液体三、支持三、支持剂（载体、担体）剂（载体、担体） 在在分分配配色

29、色谱谱中中起起到到支支持持和和吸吸着着一一定定量量固固定定相的作用，相的作用，本身无吸附作用本身无吸附作用。要求：要求：不与被分离成分反应。不与被分离成分反应。 不不溶于两相溶剂中溶于两相溶剂中。常用支持剂：常用支持剂： 含水含水硅胶硅胶、硅藻土、纤维素、硅藻土、纤维素、滤纸滤纸4545适用范围：适用范围：正相分配色谱：亲水性成分和弱亲脂性成分正相分配色谱：亲水性成分和弱亲脂性成分反相分配色谱：强亲脂性成分反相分配色谱：强亲脂性成分根据固定相和流动相相对极性大小不同：根据固定相和流动相相对极性大小不同：1 1、正相分配色谱、正相分配色谱 极性：极性：固定相固定相 流动相流动相2 2、反相分配色

30、谱、反相分配色谱 极性：极性：流动相流动相 固定相固定相4646四、分配色谱的类型四、分配色谱的类型1 1、正相分配色谱：、正相分配色谱：vv支持剂：支持剂：硅胶等等 （硅胶吸水超过（硅胶吸水超过1717，不作不作 吸附剂吸附剂，而作为载体），而作为载体）vv固定相：固定相：强极性溶剂强极性溶剂，如水水、缓冲液等vv流动相：流动相：氯仿、乙酸乙酯等弱极性亲脂弱极性亲脂有机溶剂vv洗脱规律：洗脱规律：4747？极性小成分极性小成分极性大成分极性大成分 -先洗下先洗下-后洗下后洗下2 2、反相分配色谱：反相分配色谱：vv支持剂：硅胶、纤维素粉、滤纸等支持剂：硅胶、纤维素粉、滤纸等 vv固定相：亲脂

31、性固定相：亲脂性极性小极性小的有机溶剂，可用石的有机溶剂，可用石蜡油、反相硅胶蜡油、反相硅胶RP-18RP-18、RP-8RP-8、RP-2 RP-2 vv流动相：水或甲醇等流动相：水或甲醇等强极性溶剂强极性溶剂vv洗脱规律：洗脱规律：48？极性大成分极性大成分极性小成分极性小成分-先洗下先洗下-后洗下后洗下表表2、分配色谱的类型、分配色谱的类型类型类型固定相固定相极性极性流动相流动相极性极性分离速度分离速度正相分配正相分配大大小小极性小的分离速度快极性小的分离速度快反相分配反相分配小小大大极性大的分离速度快极性大的分离速度快49495050五、操作技术五、操作技术1 1、分配柱色谱法、分配柱

32、色谱法先将支持剂和固定相拌匀先将支持剂和固定相拌匀抽滤，除去多余的固定相抽滤，除去多余的固定相将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和湿法装柱湿法装柱洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和51512 2、分配薄层色谱法、分配薄层色谱法v支持剂：惰性物质支持剂：惰性物质v固定相：支持剂吸附的溶剂固定相：支持剂吸附的溶剂v流动相：流动相：事先要用固定相饱和事先要用固定相饱和v装置及操作同吸附薄层色谱，装置及操作同吸附薄层色谱，区别在于制板区别在于制板用的是支持剂不是吸附剂。用的是支持剂不是吸附剂。3、纸色谱法（、纸色谱法（PC）

33、 系以纸为载体，以纸上所含水分为固定相，系以纸为载体，以纸上所含水分为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。用展开剂进行展开的分配色谱。 v支持支持剂：剂：滤纸（纤维素）滤纸（纤维素）v固定相：固定相：水水v流动相流动相：水饱和有机溶剂：水饱和有机溶剂5252用作微量分析，特别适合于用作微量分析，特别适合于亲水性较强的成分。亲水性较强的成分。化合物极性越小，化合物极性越小，RfRf值越大；极性越大，值越大；极性越大，RfRf值越小。值越小。5353纸色谱与薄层色谱装置纸色谱与薄层色谱装置离子交换色谱法离子交换色谱法（Ion exchange chromatography）基本原理：基本原理： 离

34、子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子基团，能离子基团，能可逆性可逆性的与被分离成分上的离的与被分离成分上的离子基团发生交换，使混合成分中子基团发生交换，使混合成分中离子型与非离子型与非离子型物质离子型物质或或具有不同离解度的离子化合物具有不同离解度的离子化合物得到分离。得到分离。操作方式：操作方式： 柱色谱柱色谱5454液液- -固色谱法固色谱法固定相：离子交换树脂固定相：离子交换树脂流动相：含强离子的水溶液流动相：含强离子的水溶液固定相：固定相：离子交换树脂离子交换树脂（高分子化合物）（高分子化合物）球形颗粒，不溶于水，可在水中溶胀球形颗粒，不溶于水，可在水

35、中溶胀离子交换离子交换基团基团强酸性阳离子交换树脂结构图强酸性阳离子交换树脂结构图强酸性阳离子交换树脂结构图强酸性阳离子交换树脂结构图适用范围：适用范围： 分离具有解离能力的酸性、碱性及两性化合分离具有解离能力的酸性、碱性及两性化合物，如生物碱物，如生物碱、有机酸、酚酸、有机酸、酚酸、氨基酸等。氨基酸等。5656离子交换树脂的种类（功能基团）：离子交换树脂的种类（功能基团）：阳离子交换树脂阳离子交换树脂：强酸性（强酸性（-SO-SO3 3-H-H+ +） 弱酸性（弱酸性（-COO-H-COO-H+ +） 阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：强碱性（强碱性（-N+-N+（CHCH3 3）3 3ClC

36、l- -） 弱碱性（弱碱性（-NH-NH2 2OHOH，-NH-NH-，-N=-N=） 被分离物质被分离物质被分离物质被分离物质带带带带负电荷负电荷负电荷负电荷被分离物质被分离物质被分离物质被分离物质带带带带正电荷正电荷正电荷正电荷水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离凝胶过滤色谱法凝胶过滤色谱法（Gelpermeation chromatography） 原理：原理：分子筛。分子筛。固定相：凝胶固定相：凝胶（具多孔网状结构）（具多孔网状结构） 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex G

37、sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶（羟丙基葡聚糖凝胶（ sephadex LH-20sephadex LH-20）流动相：流动相： 水或有机溶剂水或有机溶剂585859适适用用范范围围：分分离离分分子子量量大大小小不不同同的的化化学学成成分分，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、甾体等。如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、甾体等。洗洗 脱脱 顺顺 序序 ：分分子子量量大大的的化化合合物物先流出。先流出。大孔吸附树脂色谱大孔吸附树脂色谱基本原理：基本原理： 利利用用大大孔孔树树脂脂具具有有吸吸附附性性和和分分子子筛筛作作用用，使使天天然然药药物物中中相相对对分分子子量量大大小小及及吸吸附附力力强强弱弱

38、不不同的化学成分得以同的化学成分得以分离。分离。6060液液- -固色谱法固色谱法固定相：大孔吸附树脂固定相：大孔吸附树脂流动相：溶剂流动相：溶剂6161固定相：大孔吸附树脂固定相：大孔吸附树脂高分子聚合物高分子聚合物多孔网状结构多孔网状结构不含交换基团不含交换基团吸附能力：分子间作用力吸附能力：分子间作用力 氢键氢键分子筛作用：多孔性质分子筛作用：多孔性质 特点特点原理原理6262应用：应用： 苷苷类类、皂皂苷苷、生生物物碱碱、萜萜类类、黄黄酮酮等等大大分子化合物的分离。分子化合物的分离。洗脱规律和洗脱过程与普通吸附色谱相似：洗脱规律和洗脱过程与普通吸附色谱相似： 对对极极性性吸吸附附剂剂来

39、来说说，成成分分极极性性越越大大，越越难难洗脱；洗脱剂的极性越大，越易洗脱。洗脱；洗脱剂的极性越大，越易洗脱。一、高效液相色谱法一、高效液相色谱法 在在经经典典柱柱色色谱谱法法基基础础上上发发展展起起来来的的一一种种具有高效、快速、高灵敏特点的色谱分离方法。具有高效、快速、高灵敏特点的色谱分离方法。6363其他色谱法其他色谱法vv高高高高效效效效液液液液相相相相色色色色谱谱谱谱的的的的原原原原理理理理与与与与一一一一般般般般液液液液相相相相色色色色谱谱谱谱十十十十分分分分相相相相似似似似，样样样样品品品品的的的的分分分分离离离离取取取取决决决决于于于于其其其其在在在在流流流流动动动动相相相相和

40、和和和固固固固定相中的分配。定相中的分配。定相中的分配。定相中的分配。vv特特特特点点点点是是是是使使使使用用用用高高高高压压压压输输输输液液液液泵泵泵泵进进进进行行行行洗洗洗洗脱脱脱脱，并并并并配配配配备备备备有有有有紫紫紫紫外外外外等等等等检检检检测测测测系系系系统统统统，使使使使分分分分离离离离达达达达到到到到高高高高速速速速化化化化和和和和高效化。高效化。高效化。高效化。二、气相色谱法二、气相色谱法流动相：气体流动相：气体固定相：液体或固体固定相：液体或固体基本原理：基本原理： 利利用用化化学学成成分分在在气气体体与与固固定定相相之之间间吸吸附附能能力力不不同同或或分分配配系系数数不不

41、同同的的差差异异而而分分离离的的色谱分离方法。色谱分离方法。适用范围：适用范围：沸点低、易挥发的挥发油类沸点低、易挥发的挥发油类成分。成分。6464思考题思考题1 1、薄薄层层色色谱谱中中，吸吸附附剂剂、被被分分离离物物质质及及溶溶剂剂三者之间的关系如何？三者之间的关系如何？ 2、聚聚酰酰胺胺分分离离下下列列黄黄酮酮类类化化合合物物时时（以以MeOHMeOH为溶剂），最先洗脱下来的是（为溶剂），最先洗脱下来的是（ ）65653、根根据据不不同同性性质质的的化化学学成成分分，用用连连线线选选择择与与其其相适应的色谱分离方法：相适应的色谱分离方法：氧化铝吸附柱色谱法氧化铝吸附柱色谱法 分子量大小不同的化合物分子量大小不同的化合物凝胶凝胶滤过柱色谱法滤过柱色谱法 碱性亲脂性化合物碱性亲脂性化合物聚酰胺聚酰胺吸附柱色谱法吸附柱色谱法 黄酮类化合物黄酮类化合物离子交换色谱法离子交换色谱法 酸性亲脂性化合物酸性亲脂性化合物硅胶硅胶吸附柱色谱法吸附柱色谱法 离子性化合物离子性化合物6666谢谢！6767