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1、实验六实验六 水中细菌总数和大肠菌群的检测水中细菌总数和大肠菌群的检测综合性实验2021-4-30前言含目的及原理前言含目的及原理各种天然水中常含有一定数量的微生物。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水生性微生物水生性微生物(如光合藻类如光合藻类)土壤、空气微生物土壤、空气微生物动物尸体及分泌物微生物动物尸体及分泌物微生物生活污水中微生物微生物生活污水中微生物微生物水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指是指1mL水样中所含细菌菌落的总数水样中所
2、含细菌菌落的总数cfu/g(mL)，可用稀释平板计数法检测。可用稀释平板计数法检测。水中病原菌主要来源水中病原菌主要来源2021-4-30水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。粪便污染指示菌的理想条件是：粪便污染指示菌的理想条件是：人畜粪便中的正常菌，且数量较粪便中其他菌多；人畜粪便中的正常菌，且数量较粪便中其他菌多；受人畜粪便污染的环境中可检出，而在未受污染环境中受人畜粪便污染的环境中可检出，而在未受污染环境中无该菌存在；无该菌存在；排出至环境后，该菌存活
3、时间与肠道致病菌相当或略长；排出至环境后，该菌存活时间与肠道致病菌相当或略长；对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力略强于肠道致病对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力略强于肠道致病菌菌检出与鉴定方法比较简单。检出与鉴定方法比较简单。人畜肠道大肠菌群的可以满足上述理想条件。人畜肠道大肠菌群的可以满足上述理想条件。 1、前言含目的及原理、前言含目的及原理2021-4-301、前言含目的及原理、前言含目的及原理国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。我国我国?生活饮用水卫生标准生活饮用水
4、卫生标准?GB5749-85细菌总数细菌总数1ml水中不超过水中不超过100个个大肠杆菌数大肠杆菌数1 L 水中不超过水中不超过3个。个。假设只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水假设只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水,大大肠肠菌群数平均每升不得超过菌群数平均每升不得超过1000个个经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水,大肠菌群数平均每升不得超过大肠菌群数平均每升不得超过10000个个2021-4-30大肠菌群的检测大肠菌群的检测多管发酵法多管发酵法特征：特征：G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在无芽孢杆菌，兼性厌氧、在3724h内能发内能发
5、酵乳糖产酸、产气。酵乳糖产酸、产气。多管发酵法多管发酵法初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；别离培养：伊红美蓝别离培养：伊红美蓝EMB平板上划线别离，出平板上划线别离，出现紫色、粉红色特征性菌落；现紫色、粉红色特征性菌落；复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。2021-4-30本实验的目的本实验的目的了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。定意义。学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方学习和掌握用稀释平板计数法测定水中
6、细菌总数的方法。法。学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。 2021-4-302、材料与方法2.1 实验材料、仪器、试剂实验材料、仪器、试剂材料：自选自来水、公园湖水、河水材料：自选自来水、公园湖水、河水仪器：仪器： 高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环管、接种环 、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。精灯、显微镜等。试剂试剂 ： 牛肉膏，蛋白胨，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚溴甲酚紫水溶液、胆盐、革
7、蓝氏染色试剂紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂2021-4-302、材料与方法、材料与方法2.2 培养基的配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，琼脂8g， 蒸馏水1000ml； 乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵1：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL调pH值后加、水 1000mL、三倍浓缩液3：除水以外，其余成分取三倍用量。分装：1的培养基分装9ml/管， 3的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。灭菌条件：115 ，15min。EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定脱水培养基，按说明
8、书操作，水用量为90%。2021-4-302、材料与方法 水样的采集水样的采集自来水：自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。备分析。(500ml采样瓶加采样瓶加15g/L硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠溶液1.5ml)公园湖水、河水公园湖水、河水：在距岸边：在距岸边5m处，取距水面处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入下浸入水中，然后翻转过来，除去玻
9、璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存，内检测的，需放入冰箱中保存，6h以以内使用。内使用。2021-4-30细菌总数的测定细菌总数的测定1)按无菌操作法，将水样作按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释，保证倍系列稀释，保证30300菌落菌落/平皿平皿 生活饮用水自来水、深井水：生活饮用水自来水、深井水：100、10-1两浓度；两浓度； 水源水水源水 河水等：河水等： 10-1、 10-2、 10-3、 污水：污水：10-2、 10-3、 10-42选择选择3个适宜稀释度，吸取个适宜稀释度，
10、吸取1 mL于无菌培养皿，参加于无菌培养皿，参加冷却至冷却至45 左右的牛肉膏蛋白胨培养基约左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15ml，立即，立即混匀，静置使培养基凝固。每个稀释度作混匀，静置使培养基凝固。每个稀释度作2个重复。个重复。3将平皿倒置于将平皿倒置于37培养箱内培养培养箱内培养241h后取出，计算后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所水样中所含的细菌菌落总数。含的细菌菌落总数。2、材料与方法、材料与方法2021-4-302.4 多管发酵法测大肠菌群 自来水1初发酵实验 100mL水样两份：分别以无菌操作参加两个装有已灭菌的50mL 的
11、3浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液烧瓶中内有倒置小管，充分混匀； 10mL水样10份：分别以无菌操作参加各装有5mL的3乳糖胆盐蛋白胨的发酵试管中(内有倒置小管)，混匀； 以上材料置于37恒温箱内培养24h。2平板别离：上述各发酵管经培养24h后，将产酸产气的发酵管用接种环挑取一环发酵液于伊红美蓝培养基上划线，置于37培养箱内培养24h。3阳性菌落革兰氏染色：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落：粉红色，中心色较深的菌落，各挑一种染色。4G-、特征性的菌落复发酵验证可省5查表计算 根据证实有大肠菌群存在的阳性管瓶数查“大肠菌群检数表 ，报告每升水样中的大肠菌群数。2、材料与方
12、法、材料与方法2021-4-302.4 多管发酵法测大肠菌群 公园湖水、河水公园湖水、河水 将水样做将水样做1:10倍稀释，取适当的三个连续梯度，每倍稀释，取适当的三个连续梯度，每梯度梯度5份。份。 水源水、轻度污染水：水源水、轻度污染水：10mL、1ml、10-1水样水样1ml。中度污染水：中度污染水：1， 10-1 、10-2 ，均用，均用1mL。严重污染水：严重污染水： 10-1 、10-2 、 10-3 ，均用，均用1ml。10ml以上水样用以上水样用3乳糖胆盐蛋白胨培养液，其他的乳糖胆盐蛋白胨培养液，其他的用用1乳糖胆盐蛋白胨培养液，操作步骤同生活饮用乳糖胆盐蛋白胨培养液，操作步骤同
13、生活饮用水。水。2、材料与方法、材料与方法2021-4-30稀释与接种稀释与接种13实验五10-210-39mL300ml水样9mL1mL平行实验？平行实验？对照实验？对照实验？10-19mL9mL10ml 3培养基1ml1培养基2021-4-302021-4-303、结果与分析3.1 水中细菌总数：用二位有效数字。水中细菌总数：用二位有效数字。稀释度及菌落数稀释度及菌落数两稀释度两稀释度之比之比菌落总数菌落总数/（cfu/g或或cfu/mL）报告方式（菌落总数）报告方式（菌落总数）/（cfu/mL或或cfu/g）10-110-210-31多不可计16420-1640016000或1.6104
14、2多不可计295461.63775038000或3.81043多不可计271602.22710027000或2.71044多不可计多不可计313-313000310000或3.1105527115-270270或6000-10107多不可计30512-3050031000或3.11042021-4-303、结果与分析、结果与分析实验结果实验结果10110-1CK123451234512345初发酵产酸+-产气+-EMB紫黑色+-粉红色+-革兰氏染色G-+-结论+0阳性管数521163.2 水中大肠菌群最大可能数水中大肠菌群最大可能数2021-4-30查MPN表假设检测水样的浓度是比该体系中的高
15、或低，该如何查表？MPN=MPN指数10(ml)接种量最大的一管的水样(ml)2021-4-303、结果与分析、结果与分析3.3 实验讨论实验讨论大肠菌群的定义是什么？、为什么要选择大大肠菌群的定义是什么？、为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？肠菌群时，各起什么作用？经检查，水样是否符合饮用标准或污染程度。经检查，水样是否符合饮用标准或污染程度。2021-4-30实验要求、预习及准备实验要求、预习及准备1、四人一组，第十周内完成。、四人一组，
16、第十周内完成。2、设计实验，确定检测水样及多管发酵法稀释度、设计实验，确定检测水样及多管发酵法稀释度3、所用玻璃器皿预算并准备、所用玻璃器皿预算并准备4、所用培养基预算、配制分装、灭菌并保存、所用培养基预算、配制分装、灭菌并保存5、时间安排、时间安排周三上午周三上午34节：取样，制牛肉膏蛋白胨培养基，测节：取样，制牛肉膏蛋白胨培养基，测细菌总数；制初发酵培养基，灭菌并初发酵；细菌总数；制初发酵培养基，灭菌并初发酵；周四下午：计数细菌总数，检查初发酵结果，计算周四下午：计数细菌总数，检查初发酵结果，计算EMB培养基用量并配制培养基用量并配制EMB培养基，划线别离；培养基，划线别离；周五上午：观察结果周五上午：观察结果2021-4-30
