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1、第四节第四节 氨基酸混合物的分析分离氨基酸混合物的分析分离 p148p148一、分配层析的一般原理一、分配层析的一般原理 层析即色层分析又称色谱层析即色层分析又称色谱(chromatograph)(chromatograph)。所有。所有层析系统均有两相组成：层析系统均有两相组成： 固定相固定相(stationary phase)(stationary phase) 流动相流动相(mobile phase)(mobile phase) 混合物在层析系统中的分离决定于各组分在两相中混合物在层析系统中的分离决定于各组分在两相中的分配。的分配。 1891 1891年年NerstNerst提出提出分配
2、定律分配定律：当一种溶质在两种互不：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的溶质在两相中的浓度比浓度比为一常数称为为一常数称为分配系数分配系数(Kd)(Kd)。2021/8/221物质不仅在互不相溶的两液相间分配，也可物质不仅在互不相溶的两液相间分配，也可以在固相以在固相- -液相间或在气相液相间或在气相- -液相间分配。液相间分配。层析系统中的层析系统中的固定固定相可以是固相、液相或固相可以是固相、液相或固- -液相混合相（半液体）；液相混合相（半液体）；流动流动相可以是液相可以是液相或气相，它充满于静相的空隙
3、中，并能相或气相，它充满于静相的空隙中，并能流过静相。流过静相。2021/8/222某一物质分配不直接决定于它的分配系数某一物质分配不直接决定于它的分配系数(Kd)(Kd)，而取决于它的有效分配系数，而取决于它的有效分配系数K Keff eff 。 K Keffeff差异差异越大的物质越容易分开。越大的物质越容易分开。Keff =某一物质在某一物质在动相中动相中的总量的总量某一物质在某一物质在静相中静相中的总量的总量Keff = CA x VA CB x VBKeff = KdRv(A,B两相的体积比两相的体积比)2021/8/223二、二、 分配柱层析装置分配柱层析装置设想的板层：固+流洗脱
4、液圆形滤纸，以免扰乱表面填充物 固尼龙网格、烧结玻片或其他支持物尽可能小的死体积分部收集管连接保持恒压力的洗脱液池（溶器）2021/8/224柱层析：柱层析：层析柱中的填充物（支持剂）都是一些层析柱中的填充物（支持剂）都是一些具有亲水性的不溶物质：纤维素、淀粉、硅胶等。具有亲水性的不溶物质：纤维素、淀粉、硅胶等。它们吸附一层不流动的结合水，可以看作固定相，它们吸附一层不流动的结合水，可以看作固定相，流过的互不溶的溶剂是流动相。流过的互不溶的溶剂是流动相。纸层析：纸层析：滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的溶剂是流动相。混合氨基酸在这两相中不断用的溶剂是流动相
5、。混合氨基酸在这两相中不断分配而被分布在滤纸的不同位置上。只要实验条分配而被分布在滤纸的不同位置上。只要实验条件确定，每种氨基酸的相对迁移率恒定。分离、件确定，每种氨基酸的相对迁移率恒定。分离、鉴定氨基酸的常用技术。鉴定氨基酸的常用技术。2021/8/225氨基酸的双向纸层析图谱酚-甲酚-水丁醇-醋酸+ 原点三三、纸纸层层析析2021/8/226纸层析中的纸层析中的RfRf值（相对迁移率）值（相对迁移率）Rf=XY溶剂前沿氨基酸显色点滤纸原点2021/8/227四、薄层层析四、薄层层析纤维素粉、硅胶和氧化铝粉纤维素粉、硅胶和氧化铝粉分辨率高、所需样品量微盖子层析缸层析板溶剂2021/8/228
6、五、离子交换柱层析五、离子交换柱层析磺酸型阳离子交换树脂（支持剂）磺酸型阳离子交换树脂（支持剂）离子交换树脂（支持剂）。含酸性基团或碱性基团，解离出离子交换树脂（支持剂）。含酸性基团或碱性基团，解离出H+ 或或OH-与被分离物中相应的离子交换而与被分离物中相应的离子交换而“挂挂”在树脂上。在树脂上。2021/8/229离子交换柱层析自动化样品注入口泵洗脱液2021/8/2210离子交换离子交换自动分析仪自动分析仪洗脱的先后顺序取决于氨基酸的所带电荷洗脱的先后顺序取决于氨基酸的所带电荷与离子交换树脂的静电吸引和疏水相互与离子交换树脂的静电吸引和疏水相互作用两者的综合作用的结果作用两者的综合作用的结果流出液/ml2021/8/2211气相色谱 氨基酸与异硫氰酸苯酯反应生成PTH-氨基酸，然后经三甲基硅烷基化，得到易于气化的氨基酸衍生物。连接记连接记录仪录仪2021/8/2212高效液相色谱高效液相色谱(high performance liquid chromatograph，简称，简称HPLC)又称高压液相色谱又称高压液相色谱储储液液缸缸过滤器过滤器压力泵压力泵进样室进样室检测器检测器收集器收集器记录仪记录仪恒温装置恒温装置层析柱层析柱2021/8/2213
