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1、第十四章第十四章 全自动全自动DNADNA测序仪和测序仪和 蛋白质自动测序仪蛋白质自动测序仪1.元素周期表的发现奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础元素周期表“基因组序列图”将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础！“基因组”-生命科学的“元素周期表”人体解剖图奠定了现代医学发展的基础2.生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之中GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTT
2、CTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT3.vv了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病，了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病，是生命科学的核心内容之一是生命科学的核心内容之一vv核酸和蛋白质核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子，是控制生命过程的两种重要大分子，其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主要对象要对象 4.vv核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结构构核
3、苷酸核苷酸的线性排列构成它的一级结构的线性排列构成它的一级结构vv蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位氨基酸氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的一级结构的排列顺序，研究蛋白质的一级结构是了解蛋白质功能的基础是了解蛋白质功能的基础 5.第一节全自动DNA测序仪 DNA DNA测序测序 核苷酸序列核苷酸序列vv早期：小片段重叠法早期：小片段重叠法 通过测定通过测定RNARNA序列来推测序列来推测DNADNA序列序列 缺点：既缺点：既费时费时又又不准确不准确vv2020世纪世纪8080年代以后年代以后 ：DNADNA自动测序仪自动测序仪 SangerSanger
4、双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber Maxam-Gilber化学降解法化学降解法 优点：优点：操作简单、安全、快速、准确操作简单、安全、快速、准确 6.SangerSanger双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法Maxam-GilberMaxam-Gilber化学降解法化学降解法 vv都是根据在某一都是根据在某一固定固定的点的点开始开始核苷酸链的核苷酸链的延伸延伸，随机随机在某在某一个一个特定特定的碱基处的碱基处终止终止，产生，产生A A、T T、C C、G G四组不同长度四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰
5、胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得段的分离和检测，从而获得DNADNA序列序列 vv双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动在全自动DNADNA测序仪中应用广泛测序仪中应用广泛 7.n n原理一个末端标记的一个末端标记的DNADNA片段在片段在4 4组互相独立的化学反应中分别得组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。因此生成基。因此生成4 4种放射性标记的分子，从共同起点（放射性标种放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末
6、端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的长短不一的DNADNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原原DNADNA全片段上位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳全片段上位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。Maxam-Gilber化学降解法8. n n基本步骤第一步，对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰；第一步，对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰；第二步，修饰碱基从糖环
7、上脱落，修饰碱基第二步，修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5 5和和3 3的磷酸二酯的磷酸二酯键断裂；键断裂；第三步，比较第三步，比较G G、A+GA+G、C+TC+T、C C以及以及ACAC各个泳道，可从测序各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读取凝胶的放射自显影片上读取DNADNA序列。序列。9.10.特点n n重现性好，所用试剂简单，易于掌握；重现性好，所用试剂简单，易于掌握；n n所测长度比所测长度比SangerSanger法短一些，对放射性标记末端法短一些，对放射性标记末端250250个核苷酸以内的个核苷酸以内的DNADNA序列效果较好；序列效果较好；n n序列来自原序列来自原DNAD
8、NA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝；分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝；n n可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等DNADNA修饰的情况，修饰的情况，通过化学保护及修饰干扰实验来研究通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNADNA的二级结构及蛋白质的二级结构及蛋白质-DNA-DNA相互作相互作用。用。n n无需延伸反应及克隆无需延伸反应及克隆n n更适于含有稀有碱基或更适于含有稀有碱基或GCGC含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并测序。测序。n n比较繁琐费时，过长序列有困难。比较繁琐费时，
9、过长序列有困难。11.12.13.14.（一）双脱氧链末端终止法测序原理vv利用利用DNADNA的体外合成过程的体外合成过程聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerasepolymerasechainreaction,PCRchainreaction,PCR） vvDNADNA聚合酶的催化聚合酶的催化vv以目的以目的DNADNA为模板为模板vv按照碱基互补配对原则按照碱基互补配对原则vv在引物的引导下在引物的引导下单核苷酸聚合形成新单核苷酸聚合形成新单核苷酸聚合形成新单核苷酸聚合形成新DNADNA链链链链15.n n普通的普通的PCRPCR反应体系中，加入的反应体系中，加入的核苷酸单体为核苷酸
10、单体为 4 4种种2-2-脱氧核苷三脱氧核苷三磷酸（磷酸（dATPdATP，dCTPdCTP，dGTPdGTP，dTTPdTTP） dNTP结构示意图结构示意图16.n n测序反应体系中，加入的核苷酸测序反应体系中，加入的核苷酸单体为单体为 2,3-2,3-双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸（ddNTPddNTP） ddNTP结构示意图结构示意图17. PCRPCRPCRPCR（聚合酶链式反应）原理（聚合酶链式反应）原理（聚合酶链式反应）原理（聚合酶链式反应）原理反应所需物质：反应所需物质：DNA模板、引物、模板、引物、DNA聚合聚合酶、酶、dNTP、缓冲液、缓冲液每个循环包括：每个循环包括：变
11、性（变性（90）、退火（）、退火（54）、延伸（）、延伸（72）18.与与dNTPdNTP相比，相比，ddNTPddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基基，反应过程中虽然可以在，反应过程中虽然可以在DNADNA聚合酶作用下，通过聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的其磷酸基团与正在延伸的DNADNA链的末端脱氧核糖链的末端脱氧核糖-OH-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNADNA链中，但它链中，但它们本身没有们本身没有-OH-OH，不能同后续的不能同后续的dNTPdNTP形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的从而使正在
12、延伸的DNADNA链在此链在此终止终止。 19.据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的同的DNADNA模板、引物、四种模板、引物、四种dNTPdNTP和一种和一种ddNTP(ddNTP(如如ddATP)ddATP)，则，则新合成的新合成的DNADNA链在可能掺入正常链在可能掺入正常dNTPdNTP的位置都有可的位置都有可能掺入能掺入ddNTPddNTP而导致新合成链在不同的位置终止而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在由于存在ddNTPddNTP与与dNTPdNTP的竞争，生成的反应产物是一系列的竞争，生成的反应产物是一系列长
13、度不同的多核苷酸片段。长度不同的多核苷酸片段。 20.ATemplatePrimerdNTPsPolymeraseTerminatorGCT双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）21.TCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGA TTT双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）22.T双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）23.ACG双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）24.25.双脱氧链末端终止法测序反应原理（5）26.（二）新生链的荧光标记原理vv早期采用同位素法标记新生链，因其具有早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害放射性危害、背景
14、高背景高等等缺点缺点而很快被荧光染料标记法所取代而很快被荧光染料标记法所取代vv荧光染料荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在在DNADNA自动自动测序中得到广泛应用测序中得到广泛应用 27.n n荧光染料荧光染料荧光染料荧光染料标记法标记法标记法标记法单色单色荧光标记法荧光标记法多色多色荧光标记法荧光标记法荧光标记荧光标记引物法引物法荧光标记荧光标记终止底物法终止底物法荧
15、光标记荧光标记引物法引物法荧光标记荧光标记终止底物法终止底物法28. 多色荧光标记法多色荧光标记法 - - 荧光标记引物法荧光标记引物法vv定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的引物的55端端vv一组（一组（4 4种）荧光标记引物，其种）荧光标记引物，其序列相同序列相同，但，但标记的荧光标记的荧光染料颜色染料颜色不同不同vv测序反应中，模板、反应底物、测序反应中，模板、反应底物、DNADNA聚合酶及标记引物等聚合酶及标记引物等按按A A、T T、C C、GG编号被置于编号被置于4 4支微量离心管中，支微量离心管中，A A、T T、C C、GG四个测序
16、反应四个测序反应分管进行分管进行，上样时，上样时合并在一个泳道内合并在一个泳道内电电泳。泳。特定颜色特定颜色荧光标记的荧光标记的引物引物则与特定的双脱氧核苷酸底则与特定的双脱氧核苷酸底物物保持对应关系保持对应关系 29.n n荧光标记引物法荧光标记引物法图图18-8荧光标记引物法原理荧光标记引物法原理30. 多色荧光标记法 - 荧光标记终止底物法荧光标记终止底物法vv定义：将荧光染料标记在作为终止底物的定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷双脱氧单核苷酸酸上上vv反应中将反应中将4 4种种ddNTPddNTP分别用分别用4 4种不同的荧光染料标记，带种不同的荧光染料标记，带有荧光基团
17、的有荧光基团的ddNTPddNTP在掺入在掺入DNADNA片段导致链延伸终止的片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料vv经电泳后将各个荧光谱带分开，根据经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同荧光颜色的不同来来判断所代表的判断所代表的不同碱基信息不同碱基信息 31.模板：模板：模板：模板：T C C A T G A T T C C A T G A T 产物：产物：产物：产物：A A A G A G A G G A G G A G G T A G G T A G G T A A G G T A A G G T A C A G
18、 G T A C A G G T A C T A G G T A C TAGCTGGTTAAC新生链的荧光标记原理32.n n都确定了都确定了4 4种荧光染料与种荧光染料与4 4种种ddNTPddNTP所终止的所终止的DNADNA片段之间的片段之间的专专一对应关系一对应关系n n荧光标记引物法荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的使荧光有色基团标记在长短不同的DNADNA片段的片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一一DNADNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，片段的两端，且标记发生在引物与模板的
19、退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔两者在时间上有一定间隔n n荧光标记终止底物法荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，使标记和终止过程合二为一，两者在同一两者在同一时间完成时间完成 n n在具体操作中，在具体操作中，前者要求前者要求A A、C C、GG、T T四个反应四个反应分别进行分别进行，而，而后者后者的四种反应可以在的四种反应可以在同一管中完成同一管中完成 荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点：33. 单色荧光标记法 n n也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法法n n与与多色
20、荧光标记法多色荧光标记法不同不同的是单色荧光标记引物法的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将和荧光标记终止底物法均需将A A、C C、GG、T T四个四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳也分别在不同泳道中电泳 34.n n 均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法n n单色荧光标记法单色荧光标记法需将需将A A、C C、GG、T T四个反应四个反应分别在不同分别在不同扩增扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳不同泳道中电泳n
21、 n多色荧光标记引物法多色荧光标记引物法需将需将A A、C C、GG、T T四个反应四个反应分别在不同分别在不同扩增管中进行，电泳时可扩增管中进行，电泳时可合并合并在同一泳道中在同一泳道中电泳电泳n n多色荧光标记终止底物法多色荧光标记终止底物法可将可将A A、C C、GG、T T四个反应在四个反应在同一同一扩增管中进行，电泳时在扩增管中进行，电泳时在同一同一泳道中电泳泳道中电泳单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点：35.（三）荧光标记DNA的检测原理vv测序反应一般以测序反应一般以单引物单引物进行进行DNADNA聚合酶延伸反应，聚合酶延伸反应，绝大多绝大多数产物均为单链数产物均为单链vv反
22、应结束后，样品经简单反应结束后，样品经简单纯化纯化处理就可以放置到自动测序仪处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳中开始电泳 vv两极间极高的两极间极高的电势差电势差推动着各个荧光推动着各个荧光DNADNA片段在凝胶高分片段在凝胶高分子聚合物中子聚合物中从负极向正级从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口检测窗口 vv由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里区，在这里激光束激光束以与凝胶垂直的角度以与凝胶垂直的角度激发激发荧光荧光DNADNA片段片段 36.vvDNADNA片段上的荧
23、光发色基团吸收了激光束提供的能量而发片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出射出特征波长的荧光特征波长的荧光vv代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到到CCDCCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理机加以处理vv整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合为纵轴的信号数据的集合vv经
24、测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来果以一种清晰直观的图形显示出来 37. 多色荧光标记技术检测优点：多色荧光标记技术检测优点：vv一个样本的四个测序反应产物可以一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，度的影响，提高了测序精度提高了测序精度vv一个样品所有反应产物只需一个样品所有反应产物只需进样一次进样一次，所以一次实验便可，所以一次实验便可以处理较之手工方法更多
25、的样品。在相同样品数的情况下，以处理较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下，加样的加样的工作量也大大减少工作量也大大减少 38.DNA序列测定的策略n克隆亚克隆的方法(clone-by-clone)n全基因组散弹法(鸟枪法)(whole-genomeshotgunmethod)39. 两种大规模基因组测序策略的比较两种大规模基因组测序策略的比较项项项项 目目目目 策策策策略略略略全基因组霰弹法全基因组霰弹法全基因组霰弹法全基因组霰弹法逐步克隆法逐步克隆法逐步克隆法逐步克隆法遗传背景遗传背景遗传背景遗传背景不需要不需要不需要不需要需要（需构建精确的需要（需构建精确的需要（需构建精确的需要（
26、需构建精确的物理图谱）物理图谱）物理图谱）物理图谱）速度速度速度速度快快快快慢慢慢慢费用费用费用费用低低低低高高高高计算机性能计算机性能计算机性能计算机性能高（以全基因组为单高（以全基因组为单高（以全基因组为单高（以全基因组为单位进行拼接）位进行拼接）位进行拼接）位进行拼接）低（以低（以低（以低（以BACBAC为单位进为单位进为单位进为单位进行拼接）行拼接）行拼接）行拼接）适用范围适用范围适用范围适用范围工作框架图工作框架图工作框架图工作框架图精细图精细图精细图精细图代表测序物种代表测序物种代表测序物种代表测序物种果蝇、水稻果蝇、水稻果蝇、水稻果蝇、水稻人、线虫人、线虫人、线虫人、线虫40.克
27、隆亚克隆的方法(clone-by-clone)n n是以物理图谱为基础、以大插入片断克隆为单位的定向测序策略。其是以物理图谱为基础、以大插入片断克隆为单位的定向测序策略。其方法是先构建议染色体为单位的遗传图谱，再利用高覆盖率的大片断方法是先构建议染色体为单位的遗传图谱，再利用高覆盖率的大片断基因组文库（基因组文库（BACBAC、YACYAC等）获得精细的物理图谱，选择合适的等）获得精细的物理图谱，选择合适的BACBAC或或YACYAC克隆进行亚克隆测序，用计算机拼装，通过引物步移等手段填克隆进行亚克隆测序，用计算机拼装，通过引物步移等手段填补补BACBAC内的空洞，形成一条完整的内的空洞，形成
28、一条完整的BACBAC序列。然后参照物理图谱，将序列。然后参照物理图谱，将相互关联、部分重叠的相互关联、部分重叠的BACBAC克隆联成一个大的重叠群克隆联成一个大的重叠群(Contig)(Contig)。但一些。但一些长串联的高度重复序列区域和克隆或测序所不能获得的区域，仍会存长串联的高度重复序列区域和克隆或测序所不能获得的区域，仍会存在一些物理空洞（在一些物理空洞（Physical GapPhysical Gap）。与）。与Shot-gunShot-gun方法相比较，方法相比较，Clone Clone by Cloneby Clone的技术难度较高，尤其是大片段基因组文库（如的技术难度较高，
29、尤其是大片段基因组文库（如BACBAC文库）文库）的精细物理图谱的构建是技术性极强的工作；并且测序费用和所需的的精细物理图谱的构建是技术性极强的工作；并且测序费用和所需的时间也相对较多。时间也相对较多。41.人类基因组计划研究的主人类基因组计划研究的主要成果和进展表现在这要成果和进展表现在这“四张图四张图”遗传图谱遗传图谱 又称为连锁图谱（又称为连锁图谱（linkage maplinkage map），），指基因或指基因或DNADNA标志在染色体上的相对标志在染色体上的相对位置与遗传距离位置与遗传距离物理图谱物理图谱 以定位的以定位的DNADNA标记序列如标记序列如STSSTS作为路作为路标，
30、以标，以DNADNA实际长度即实际长度即bp、kb、Mb为图距的基因组图谱。为图距的基因组图谱。转录图谱转录图谱 利用利用EST（expressedsequencetags 表达序列标签）作为标记所构建的表达序列标签）作为标记所构建的分子遗传图谱分子遗传图谱序列图谱序列图谱 通过基因组测序得到的，以通过基因组测序得到的，以A A、T T、G G、C C为标记单位的基因组为标记单位的基因组DNADNA序列序列42.43.全基因组散弹法(鸟枪法)(whole-genomeshotgunmethod)n n是借助物理和化学的手段，将整个基因随机打断成一定大是借助物理和化学的手段，将整个基因随机打断成
31、一定大小的片段进行测序，再根据序列间的重叠关系进行计算机小的片段进行测序，再根据序列间的重叠关系进行计算机拼接和组装，确定它们在基因组中的位置。拼接和组装，确定它们在基因组中的位置。Shot-gunShot-gun的优的优点是速度快、简单易行、成本较低，可在短时间内通过集点是速度快、简单易行、成本较低，可在短时间内通过集中设备和人力获得海量的基因组序列。缺点在于序列的拼中设备和人力获得海量的基因组序列。缺点在于序列的拼接组装比较困难，在重复序列较多的区域难度更大；由于接组装比较困难，在重复序列较多的区域难度更大；由于缺少基因组的物理图谱，有些序列难以准确定位，成为游缺少基因组的物理图谱，有些序
32、列难以准确定位，成为游离片段；此外，受文库的随机性和测序的覆盖度的影响，离片段；此外，受文库的随机性和测序的覆盖度的影响，某些区域会形成较大的空洞（某些区域会形成较大的空洞（GapGap）44.45.二、全自动DNA测序仪的结构与功能 全自动全自动DNADNA测序仪测序仪vv平平平平板型电泳板型电泳板型电泳板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于度一般小于0.4mm0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳电泳vv毛细管电泳技术毛细管电泳技术毛细管电泳技术毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中将凝胶高分子
33、聚合物灌制于毛细管中（内径（内径5050 mm100100 mm），在高压及较低浓度胶的条），在高压及较低浓度胶的条件下实现件下实现DNADNA片段的片段的快速分离快速分离 平板型电泳毛细管电泳 46.310型全自动遗传分析仪型全自动遗传分析仪ABIPrism3100遗传分析仪遗传分析仪3700型全自动遗传分析仪型全自动遗传分析仪安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE500/1000/400047.（一）仪器的组成vv主机：主机： 主要包括主要包括电泳系统电泳系统、激光器激光器和和荧光检测荧光检测系统系统 ；大致可分为；大致可分为自动进样器区自动进样器区自动进样器区自动进样器区 、凝
34、胶块、凝胶块、凝胶块、凝胶块区区区区和和检测区检测区检测区检测区等结构功能等结构功能区区vv微型计算机微型计算机vv各种各种应用软件应用软件48.PE310基因分析仪的结构基因分析仪的结构49.凝胶块区凝胶块区 自动进样器区自动进样器区 检测区 PE310基因分析仪的主机分区基因分析仪的主机分区50.热板热板毛细管毛细管雷射检测器雷射检测器注射器驱动杆注射器驱动杆毛细管和电极毛细管和电极注射器注射器正极缓冲液正极缓冲液泵块泵块自动进样器自动进样器负极缓冲液负极缓冲液PE310基因分析仪的基本结构基因分析仪的基本结构51.（二）仪器各组成部分的功能 1. 主机功能 具有具有自动灌胶、进样、电泳、
35、荧光检测自动灌胶、进样、电泳、荧光检测等功能等功能 (1)(1)自动进样器区功能自动进样器区功能 自动进样器受程序控制进行三维移动，因负极电极和毛细自动进样器受程序控制进行三维移动，因负极电极和毛细管均固定不动，故许多操作如毛细管进入样品盘标本孔中管均固定不动，故许多操作如毛细管进入样品盘标本孔中进样、电极和毛细管在电极缓冲液瓶、洗涤液和废液管中进样、电极和毛细管在电极缓冲液瓶、洗涤液和废液管中移动等均依靠自动进样器的移动完成；移动等均依靠自动进样器的移动完成；52.电极为电泳的电极为电泳的负性电极负性电极，测序过程中，正、负极之间的电势，测序过程中，正、负极之间的电势差可达差可达150001
36、5000伏，如此高的电势差可促进伏，如此高的电势差可促进DNADNA分子在毛细管分子在毛细管中很快泳动，达到快速分离不同长度中很快泳动，达到快速分离不同长度DNADNA片段的目的；片段的目的；样品盘有样品盘有4848孔和孔和9696孔两种，可一次性连续测试孔两种，可一次性连续测试4848或或9696个样本个样本电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。53.(2)(2)凝胶块区功能凝胶块区功能 注射器注射器注射器注射器驱动杆驱动杆驱动杆驱动杆：给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中。在分析每一个样品前，泵自动冲掉上
37、一次注入毛细管中。在分析每一个样品前，泵自动冲掉上一次分析用过的胶，灌入新胶；分析用过的胶，灌入新胶；样品样品样品样品盘按钮盘按钮盘按钮盘按钮：控制自动进样器进出；控制自动进样器进出；注射器注射器注射器注射器固定平台固定平台固定平台固定平台：起固定注射器的作用；起固定注射器的作用；电极电极电极电极：为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液中；为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液中；54.正极正极正极正极缓冲液阀缓冲液阀缓冲液阀缓冲液阀：当注射器驱动杆下移，将注射器内的凝胶当注射器驱动杆下移，将注射器内的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进入缓冲液；电压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进
38、入缓冲液；电泳时此阀打开，提供电流通道；泳时此阀打开，提供电流通道；玻璃玻璃玻璃玻璃注射器注射器注射器注射器：储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力；提供必要的压力；毛细管毛细管毛细管毛细管固定螺母固定螺母固定螺母固定螺母：固定毛细管；固定毛细管；废液废液废液废液阀阀阀阀：在清洗泵块时控制废液流。在清洗泵块时控制废液流。 55. (3) (3)检测区功能检测区功能 激光检测器窗口及窗盖激光检测器窗口及窗盖激光检测器窗口及窗盖激光检测器窗口及窗盖：激光激光激光激光检测器窗口检测器窗口检测器窗口检测器窗口正对毛细管检测窗口，从仪器内部的氩离正对毛
39、细管检测窗口，从仪器内部的氩离子激光器发出的激光可通过激光检测器窗口照到毛细管检子激光器发出的激光可通过激光检测器窗口照到毛细管检测窗口上。电泳时，当荧光标记测窗口上。电泳时，当荧光标记DNADNA链上的荧光基团通过链上的荧光基团通过毛细管窗口时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，毛细管窗口时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，荧光经分光光栅分光后投射到荧光经分光光栅分光后投射到CCDCCD摄像机上摄像机上同步成像同步成像。窗窗窗窗盖盖盖盖起固定毛细管的作用，同时可防止激光外泄；起固定毛细管的作用，同时可防止激光外泄；56.激光检测器检测特征性的荧光光谱激光检测器检测特征性的荧光光谱激
40、光检测器检测特征性的荧光光谱激光检测器检测特征性的荧光光谱 C G T A C G C A T G A激光检测器检测特征性的荧光光谱激光检测器检测特征性的荧光光谱57.加热加热加热加热板板板板：电泳过程中起加热毛细管的作用，一般维持在电泳过程中起加热毛细管的作用，一般维持在5050；毛细管毛细管毛细管毛细管：为填充有凝胶高分子聚合物的玻璃管，直径为为填充有凝胶高分子聚合物的玻璃管，直径为5050 mm，电泳时样品在毛细管内从负极向正极泳动，电泳时样品在毛细管内从负极向正极泳动；热敏热敏热敏热敏胶带胶带胶带胶带：将毛细管固定在加热板上。将毛细管固定在加热板上。 58.DNADNA测序图测序图59
41、. 2. 2. 微型计算机功能微型计算机功能微型计算机功能微型计算机功能 控制主机的运行，并对来自主机的数据进行收集和分析。控制主机的运行，并对来自主机的数据进行收集和分析。设置测序条件（样品的进样量、电泳的温度、时间、电压设置测序条件（样品的进样量、电泳的温度、时间、电压等），同步监测电泳情况并进行等），同步监测电泳情况并进行数据分析数据分析 3. 3.各类软件功能各类软件功能各类软件功能各类软件功能 承担数据收集、承担数据收集、DNADNA序列分析及序列分析及DNADNA片段大小和定量分析片段大小和定量分析等功能。其结果可由彩色打印机输出等功能。其结果可由彩色打印机输出 60.三、全自动D
42、NA测序仪的常见故障及维护 毛细管电泳型毛细管电泳型DNADNA测序仪测序仪平板电泳型平板电泳型DNADNA测序仪测序仪电泳时仪器显示无电流电极弯曲电泳时产生电弧其它电泳时仪器显示无电流传热板粘住胶板其它61.（一）毛细管电泳型（一）毛细管电泳型DNADNA测序仪的常见故障及维护测序仪的常见故障及维护n n电泳时仪器显示无电流电泳时仪器显示无电流 vv电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管vv电极弯曲而无法浸入缓冲液中电极弯曲而无法浸入缓冲液中vv毛细管未浸入缓冲液中毛细管未浸入缓冲液中vv毛细管内有气泡等毛细管内有气泡等 62.n n电极弯曲
43、电极弯曲 vv安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令，电极不能准确插入各管中行电泳命令，电极不能准确插入各管中vv运行前未将样品盘归位、或虽然执行了归位操作，但运行前未将样品盘归位、或虽然执行了归位操作，但X/YX/Y轴归位尚未结束就运行轴归位尚未结束就运行Z Z轴归位等轴归位等 63.n n电泳时产生电弧电泳时产生电弧 vv主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积 n n其它其它 vv测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝胶测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避
44、免凝胶干燥而阻塞毛细管干燥而阻塞毛细管vv定期清洗泵块定期清洗泵块vv定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管 64.（二）平板电泳型（二）平板电泳型DNADNA测序仪的常见故障及维护测序仪的常见故障及维护n n电泳时仪器显示无电流电泳时仪器显示无电流 vv电泳缓冲液配制不正确电泳缓冲液配制不正确vv电极导线未接好或损坏电极导线未接好或损坏vv正极或负极铂金丝断裂正极或负极铂金丝断裂vv正极或负极的胶面未浸入缓冲液中正极或负极的胶面未浸入缓冲液中n n传热板粘住胶板传热板粘住胶板 vv主要原因为上方的缓冲液室漏液主要原因为上方的缓冲液室漏液 65.n n其它其它 v
45、v倒胶前应按照操作要求认真清洗玻璃板倒胶前应按照操作要求认真清洗玻璃板vv配制凝胶时应注意胶的浓度、配制凝胶时应注意胶的浓度、TEMEDTEMED含量、尿素浓度等含量、尿素浓度等vv倒胶时需注意不能有气泡倒胶时需注意不能有气泡vv将待测样品加入各孔前，应使用缓冲液冲洗各孔，把尿素将待测样品加入各孔前，应使用缓冲液冲洗各孔，把尿素冲去，以免影响电泳效果冲去，以免影响电泳效果 66.vvSmithSmith等于等于19861986年首次建立了一种年首次建立了一种使用四种不同荧光分使用四种不同荧光分别标记四种不同碱基别标记四种不同碱基的方法的方法 vv同年，同年，AnsorgeAnsorge建立了一
46、种使用建立了一种使用单色荧光单色荧光四甲基罗丹四甲基罗丹明明作为标记染料的自动测序方法作为标记染料的自动测序方法 vv平板法电泳是经典的电泳技术，具有样品平板法电泳是经典的电泳技术，具有样品判读序列长判读序列长（600bp600bp900bp900bp）、一块凝胶板上可）、一块凝胶板上可同时进行多个样同时进行多个样品品测序（可达测序（可达9696个）的优点个）的优点vv毛细管电泳毛细管电泳为近为近2020年来建立的一种快速、高效、进样量年来建立的一种快速、高效、进样量少、灵敏度高的新技术，可测序列达到少、灵敏度高的新技术，可测序列达到750bp750bp左右左右 67.四、全自动DNA测序仪的
47、进展 单色荧光标记单色荧光标记单色荧光标记单色荧光标记 四色荧光标记四色荧光标记四色荧光标记四色荧光标记 平板型电泳平板型电泳平板型电泳平板型电泳 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳 v芯片实验室（芯片实验室（lab-on-a-chip）v缩微生物处理器（缩微生物处理器（microfabricated bioprocessor），），成功完成纳升级标本的成功完成纳升级标本的Sanger DNA测序测序 68.缩微生物处理器结构示意图2006年，美国科学院院报（PANS）上公布了Blazej等建立的缩微生物处理器测序技术。缩微生物处理器基本结构为3层玻璃薄片和一层聚二甲基硅氧烷薄片，各层间
48、紧密粘合形成圆盘状，直径仅10厘米。聚二甲基硅氧烷是一种新型材料，具有能调控水合作用、通透性好等特点，保证了缩微生物处理器能够准确进行反应。该材料最近在蛋白结晶结构分析中也发挥了重要作用。69.五、全自动DNA测序仪的主要应用vv人类基因组测序人类基因组测序vv人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断vv法医的亲子鉴定和个体识别法医的亲子鉴定和个体识别vv生物工程药物的筛选生物工程药物的筛选vv动植物杂交育种动植物杂交育种 70.第二节蛋白质自动测序仪 vv蛋白质顺序指肽链中氨基酸的排列顺序蛋白质顺序指肽链中氨基酸的排列顺序vv通常从左至右表示肽链从氨基酸氨基端（通
49、常从左至右表示肽链从氨基酸氨基端（N N末端）末端）到羧基端（到羧基端（C C末端）末端） vv蛋白质测序仪工作原理：蛋白质测序仪工作原理：执行全自动化的执行全自动化的EdmanEdman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程 71.一、蛋白质测序仪的工作原理n nEdman降解法降解法 多肽链多肽链N末端末端NH2 PITC弱碱弱碱苯异硫甲氨酰肽苯异硫甲氨酰肽 TFA 噻唑啉酮苯胺（噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物）衍生物 剩余多肽剩余多肽 弱弱碱碱苯异硫甲氨酰肽苯异硫甲氨酰肽 TFA 噻唑啉酮苯胺（噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物）衍生物 剩余多肽剩余多肽
50、 PTH氨基酸氨基酸 PTH氨基酸氨基酸 HPLC HPLC 苯异硫氰酸酯三氟乙酸经酸作用，再进一步环化苯乙内酰硫脲（PTH）衍生物72.上述降解循环的偶联和环化发生在测序仪的反上述降解循环的偶联和环化发生在测序仪的反应器（筒）中，转化则在转化器进行。应器（筒）中，转化则在转化器进行。转化后的转化后的PTHPTH氨基酸经自动进样器注入高效液氨基酸经自动进样器注入高效液相色谱相色谱(high performance liquid chromatogram, (high performance liquid chromatogram, HPLC)HPLC)进行在线检测。进行在线检测。根据根据PTH
51、PTH氨基酸的洗涤滞流时间确定每一种氨氨基酸的洗涤滞流时间确定每一种氨基酸基酸。73.二、蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能vv测序反应系统测序反应系统 主要部件为反应器主要部件为反应器 vv氨基酸分析系统氨基酸分析系统 由高效液相色谱毛细管层析柱组成由高效液相色谱毛细管层析柱组成 vv信息软件处理系统信息软件处理系统 根据氨基酸的层析峰来判断为何种氨基酸根据氨基酸的层析峰来判断为何种氨基酸 74.三、蛋白质测序仪的主要应用vv新蛋白质的鉴定新蛋白质的鉴定 在凝胶电泳中出现的未知条带可以利用蛋白质测序仪来在凝胶电泳中出现的未知条带可以利用蛋白质测序仪来测定其序列测定其序列 vv分子克隆探针的设
52、计分子克隆探针的设计 用蛋白质序列信息设计用蛋白质序列信息设计PCRPCR引物和寡核苷酸探针。可以引物和寡核苷酸探针。可以利用这些探针进行利用这些探针进行cDNAcDNA文库或基因组文库的筛选文库或基因组文库的筛选 vv抗原的人工多肽合成抗原的人工多肽合成 75.本本 章章 小小 结结vvDNADNA测序仪是检测核酸一级结构测序仪是检测核酸一级结构 - - 核苷酸核苷酸线性线性排列顺序的自动化仪器排列顺序的自动化仪器vv工作原理包括工作原理包括SangerSanger双脱氧链末端终止法或双脱氧链末端终止法或Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学降解法化学降解法vv在单纯以测定
53、在单纯以测定DNADNA序列为目的的全自动序列为目的的全自动DNADNA测测序仪中以序仪中以双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法应用较广泛应用较广泛 76.本本 章章 小小 结结 其原理是利用其原理是利用DNADNA的体外合成过程，的体外合成过程，但与普通但与普通PCRPCR不同的是，双脱氧链末端终止法测序反应中除不同的是，双脱氧链末端终止法测序反应中除有有- -脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTPdNTP）外，还加入）外，还加入2-2-双脱氧核苷三双脱氧核苷三磷酸（磷酸（2-ddNTP2-ddNTP），由于没有），由于没有-OH-OH，不能进行后续反应，不能进行后续反应，使正在延伸的使正
54、在延伸的DNADNA链在此终止。链在此终止。由于存在由于存在ddNTPddNTP与与dNTPdNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段，通过电泳分离后可读出新生度不同的多核苷酸片段，通过电泳分离后可读出新生DNADNA链的序列链的序列 77.本本 章章 小小 结结vv用荧光标记新生链时，分为用荧光标记新生链时，分为多色标记法和单色标记法多色标记法和单色标记法vv根据标记部位不同，又分为根据标记部位不同，又分为荧光标记引物法和荧光标记终荧光标记引物法和荧光标记终止底物法止底物法vv荧光标记引物法的荧光染料标记过程和延伸反应终止分别荧光标记引物法的
55、荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一发生在同一DNADNA片段的两端，且两者在时间上有一定间隔片段的两端，且两者在时间上有一定间隔vv荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成同一时间完成vv采用四色荧光标记进行测序反应时，一个样本的四个测序采用四色荧光标记进行测序反应时，一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，提高了个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，提高了测序精度测序精度 78.本本
56、章章 小小 结结vv全自动全自动DNADNA测序仪根据电泳测序仪根据电泳方式的不同方式的不同分为分为平平板型电泳和毛细管电泳板型电泳和毛细管电泳两种仪器两种仪器类型类型vv测序仪测序仪主要由主机、微型计算机和各种应用软主要由主机、微型计算机和各种应用软件等组成，件等组成，主机主机包括自动进样器区、凝胶块区包括自动进样器区、凝胶块区和检测区等结构功能区和检测区等结构功能区 79.本本 章章 小小 结结vv毛细管电泳型毛细管电泳型DNADNA测序仪的常见故障包括电泳时测序仪的常见故障包括电泳时仪器显示仪器显示无电流无电流、电极弯曲电极弯曲、电泳时、电泳时产生电弧产生电弧等等vv平板电泳型平板电泳型
57、DNADNA测序仪的常见故障包括电泳时仪测序仪的常见故障包括电泳时仪器显示器显示无电流无电流、传热板粘住胶板传热板粘住胶板等，应根据具体等，应根据具体情况及时处理情况及时处理 80.本本 章章 小小 结结vv蛋白质测序仪蛋白质测序仪是检测蛋白质一级结构氨基是检测蛋白质一级结构氨基酸排列顺序的自动化酸排列顺序的自动化仪器仪器vv目前的蛋白质测序仪实际上是执行全自动化目前的蛋白质测序仪实际上是执行全自动化的的EdmanEdman化学化学降解反应降解反应和和游离氨基酸游离氨基酸的的分离分离与鉴定过程与鉴定过程 81.本本 章章 小小 结结vv蛋白质测序仪蛋白质测序仪包括包括 测序测序反应系统反应系统、分析系统和数椐处理分析系统和数椐处理系统系统vv主要应用主要应用于于 新新蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定、分子克隆探针的设计分子克隆探针的设计和和抗原的人工多肽合成抗原的人工多肽合成等方面等方面 82.83.
