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1、第二节第二节 脱毒种苗生产及病毒检测技术脱毒种苗生产及病毒检测技术一、脱毒的意义：一、脱毒的意义： 无性繁殖作物长期营养繁殖，易受病毒侵染，而使病无性繁殖作物长期营养繁殖，易受病毒侵染，而使病毒在体内积累，导致种性退化，造成产量下降或品质降低毒在体内积累，导致种性退化，造成产量下降或品质降低甚至死亡，给农业造成巨大损失。甚至死亡，给农业造成巨大损失。 通过茎尖培养获得无病毒种苗，对退化品种进行提纯复通过茎尖培养获得无病毒种苗，对退化品种进行提纯复壮。提高产量和品质，如马铃薯脱毒可提高产量壮。提高产量和品质，如马铃薯脱毒可提高产量30-60%,30-60%,提提高了经济效益。此外，由于减少农药使
2、用，可以保护生态高了经济效益。此外，由于减少农药使用，可以保护生态环境。环境。 脱毒技术主要应用于各种无性繁殖植物，如草莓、马脱毒技术主要应用于各种无性繁殖植物，如草莓、马铃薯、甘薯、苹果、香蕉、甘蔗等。铃薯、甘薯、苹果、香蕉、甘蔗等。二、脱毒方法：二、脱毒方法：（一）茎尖分生组织培养脱毒：（一）茎尖分生组织培养脱毒：1. 脱毒原理：脱毒原理：病毒在植物体内的分布不均匀，越靠近病毒在植物体内的分布不均匀，越靠近顶端区域，带毒越少，顶端分生组织（顶端区域，带毒越少，顶端分生组织（0.2-0.5 mm）不带）不带病毒或含病毒量极低。因此，分离分生组织细胞进行培病毒或含病毒量极低。因此，分离分生组织
3、细胞进行培养，可以获得无病毒种苗。养，可以获得无病毒种苗。2. 茎尖分生组织培养脱毒的基本程序：茎尖分生组织培养脱毒的基本程序： 一般包括培养基选择和制备、带脱毒材料的表面、灭一般包括培养基选择和制备、带脱毒材料的表面、灭菌、茎尖分生组织分离、接种和培养、诱导芽分化和小菌、茎尖分生组织分离、接种和培养、诱导芽分化和小植株增殖、诱导生根、驯化移栽等环节。植株增殖、诱导生根、驯化移栽等环节。 茎尖分生组织的分离需要在超净工作台上借助体视显茎尖分生组织的分离需要在超净工作台上借助体视显微镜进行。茎尖放在培养皿内进行解剖，一只手用镊子微镜进行。茎尖放在培养皿内进行解剖，一只手用镊子固定，另一手用解剖针
4、将叶片和叶原基层层剥掉，当露固定，另一手用解剖针将叶片和叶原基层层剥掉，当露出半圆形顶端分生组织时，将分生组织切下，接种与培出半圆形顶端分生组织时，将分生组织切下，接种与培养基上。养基上。virus-virus-freefreetissuetissuevirus particlesvirus particlesfound herefound here3. 脱毒效果与茎尖大小的关系：脱毒效果与茎尖大小的关系： 脱毒效果和茎尖分生组织大小直接相关，茎尖分生组脱毒效果和茎尖分生组织大小直接相关，茎尖分生组织越小，脱毒率越高，但生长速度慢。如草莓茎尖切取织越小，脱毒率越高，但生长速度慢。如草莓茎尖切取
5、时，脱毒率达到时，脱毒率达到100%，而切取时，脱毒率为，而切取时，脱毒率为50%。因此，。因此，脱毒培养时，需要兼顾脱毒率、成活率及茎尖发育成完脱毒培养时，需要兼顾脱毒率、成活率及茎尖发育成完整植株的能力。既要脱除病毒，也要使茎尖分生组织迅整植株的能力。既要脱除病毒，也要使茎尖分生组织迅速生长发育。一般茎尖分生组织大小以为适宜。速生长发育。一般茎尖分生组织大小以为适宜。（二）微体嫁接脱毒：（二）微体嫁接脱毒： 微体嫁接是在无菌条件下，将极小）的茎尖嫁接到试管微体嫁接是在无菌条件下，将极小）的茎尖嫁接到试管内的无菌实生苗砧木上，经培养，待接口愈合发育为完整内的无菌实生苗砧木上，经培养，待接口愈
6、合发育为完整植株而达到脱毒的效果。该方法已在柑橘、苹果、葡萄、植株而达到脱毒的效果。该方法已在柑橘、苹果、葡萄、山茶等园艺植物中应用。山茶等园艺植物中应用。微体嫁接微体嫁接1.微体嫁接的方法：微体嫁接的方法：2.（1）试管砧木的准备）试管砧木的准备:将无病毒种子表面灭菌后接种与将无病毒种子表面灭菌后接种与MS培养基，黑暗条件下培养培养基，黑暗条件下培养15d使其发芽。使其发芽。3.（2）茎尖嫁接：在超净工作台上，将幼苗的上胚轴和子叶）茎尖嫁接：在超净工作台上，将幼苗的上胚轴和子叶去掉，根系截短，在离上胚轴顶端越去掉，根系截短，在离上胚轴顶端越处斜向下切一深达木质处斜向下切一深达木质部，长部，长
7、2-3cm的切口，在斜切口末端横切一刀，用去掉切下的切口，在斜切口末端横切一刀，用去掉切下部分。在体视显微镜下，从待脱毒样品上切取部分。在体视显微镜下，从待脱毒样品上切取的茎尖分生组的茎尖分生组织，小心放于切口的水平面上，切面向下并与砧木切口形成织，小心放于切口的水平面上，切面向下并与砧木切口形成层组织紧密贴合，然后接于培养基上。层组织紧密贴合，然后接于培养基上。4.（3）嫁接苗培养：将嫁接苗置于光下培养，光照时数）嫁接苗培养：将嫁接苗置于光下培养，光照时数16h，嫁接嫁接1周后形成愈伤组织，周后形成愈伤组织，2-3周愈合，周愈合，5-6周后接穗发育为新周后接穗发育为新梢。梢。2. 微体嫁接脱
8、毒的关键：微体嫁接脱毒的关键： 影响微体嫁接成活率的主要因素为影响微体嫁接成活率的主要因素为接穗大小和取样时间接穗大小和取样时间。与接穗大小呈正相关，而无病毒植株获得与接穗茎尖的大与接穗大小呈正相关，而无病毒植株获得与接穗茎尖的大小呈负相关。茎尖分生组织小于可以脱除多数病毒，春季小呈负相关。茎尖分生组织小于可以脱除多数病毒，春季取材嫁接的成活率高于其他季节。取材嫁接的成活率高于其他季节。（3）热处理脱毒：）热处理脱毒： 通过热处理可以由受病毒侵染的个体得到无病毒植株，通过热处理可以由受病毒侵染的个体得到无病毒植株，其原理是利用病毒与植物的耐热性不同，在高于常温的环其原理是利用病毒与植物的耐热性
9、不同，在高于常温的环境下，植物组织中的病毒受热后可被部分或全部钝化或失境下，植物组织中的病毒受热后可被部分或全部钝化或失去活性，而寄主植物组织很少或不会受到伤害。或高温下去活性，而寄主植物组织很少或不会受到伤害。或高温下植物生长快，而病毒增殖慢而使植物新生部分不带病毒。植物生长快，而病毒增殖慢而使植物新生部分不带病毒。 1.热处理脱毒方法：热处理脱毒方法： 可以通过温可以通过温汤浸渍汤浸渍或或热空气处理法热空气处理法脱毒，前者对休眠芽脱毒，前者对休眠芽效果较好，后者对活跃生长的茎尖效果较好，后者对活跃生长的茎尖效果较好。效果较好。 热空气处理即把旺盛生长的植物移入热疗室，在热空气处理即把旺盛生
10、长的植物移入热疗室，在35-35-4040下处理一定时间（几分钟到数周）热处理后将茎尖切下处理一定时间（几分钟到数周）热处理后将茎尖切下嫁接于无病毒砧木或进行组织培养。热处理温度应逐步下嫁接于无病毒砧木或进行组织培养。热处理温度应逐步升高，直到要求温度。升高，直到要求温度。 温汤浸渍的材料常用温汤浸渍的材料常用50-55 50-55 处理处理10-50min10-50min或或35 35 温温水处理水处理30-40min30-40min。2. 热处理脱毒条件：热处理脱毒条件：（1）温度和持续时间：因）温度和持续时间：因病毒种类而异，有些病毒种类而异，有些33-3433-34处处理理28-33d
11、28-33d即可脱毒，而有些必须在即可脱毒，而有些必须在39-42 39-42 处理处理50-60d50-60d，耐热杆状病毒热处理脱毒效果差。在植物的耐热范围内，耐热杆状病毒热处理脱毒效果差。在植物的耐热范围内，温度越高，脱毒效果越好。一般采用温度越高，脱毒效果越好。一般采用35-38 .35-38 .尤其尤其3737恒恒温处理温处理302302天为普遍。也可采用高低温处理减少对植物的天为普遍。也可采用高低温处理减少对植物的损伤。如马铃薯损伤。如马铃薯40 40 （4h4h）+16-20 +16-20 （20h20h）。）。（2）湿度和光照：湿度以）湿度和光照：湿度以70-80%为适宜。光照
12、以自然光为适宜。光照以自然光最好。最好。（3）前处理：）前处理：27-35 1-2 1-2周。周。（四）其他脱毒方法：（四）其他脱毒方法：1.花器官培养脱毒：由植物的花器官培养脱分化形成愈伤组花器官培养脱毒：由植物的花器官培养脱分化形成愈伤组织，然后再分化不定芽，可以获得无毒苗。如草莓花药培织，然后再分化不定芽，可以获得无毒苗。如草莓花药培养。养。2.2. 珠心胚培养脱毒：柑橘类珠心胚与微管组织没有联系，珠心胚培养脱毒：柑橘类珠心胚与微管组织没有联系，一般不带毒，可以利用珠心胚进行培养获得。一般不带毒，可以利用珠心胚进行培养获得。3.3.化学脱毒化学脱毒:采用病毒唑等试剂处理材料或添加到培养基
13、采用病毒唑等试剂处理材料或添加到培养基中可以钝化病毒，达到一定的脱毒效果。中可以钝化病毒，达到一定的脱毒效果。4.4. 超低温处理脱毒超低温处理脱毒:经过冷冻保护剂处理过的茎尖材料，经过冷冻保护剂处理过的茎尖材料，采用液氮处理（采用液氮处理（-196）可以钝化病毒，达到脱毒效果，）可以钝化病毒，达到脱毒效果，该方法已在香蕉等果树中成功应用。该方法已在香蕉等果树中成功应用。5.5. 合并热处理、茎尖培养或微嫁接脱毒：采用多种方法同合并热处理、茎尖培养或微嫁接脱毒：采用多种方法同时处理可以达到更好的脱毒效果。时处理可以达到更好的脱毒效果。二、病毒检测方法：二、病毒检测方法： 1、形态鉴定：、形态鉴
14、定： 根据植株的生长状态鉴定是否根据植株的生长状态鉴定是否脱毒，但不准确。脱毒，但不准确。 2、指示植物鉴定法：利用特定的易于感染某些、指示植物鉴定法：利用特定的易于感染某些病毒的指示植物的特征进行病毒鉴定。病毒的指示植物的特征进行病毒鉴定。 指示植物指示植物CMV病毒感染的植株叶片病毒感染的植株叶片3、抗血清鉴定法：利用抗原和抗体的特异性反应原理、抗血清鉴定法：利用抗原和抗体的特异性反应原理进行病毒鉴定。用已知病毒的抗血清（进行病毒鉴定。用已知病毒的抗血清（antiserum）鉴）鉴定未知病毒。定未知病毒。 近年来又在此基础上发展出酶联免疫法（近年来又在此基础上发展出酶联免疫法（Enzyme
15、 Linked Immunosorbent Assay，ELISA），方法是将抗），方法是将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清与对应化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，使待检血清与对应抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断。抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断。酶联免疫法进行病毒鉴定酶联免疫法进行病毒鉴定4、电子显微镜检测（、电子显微镜检测（Electronmicroscope）：采用）：采用电子显微镜对病毒的薄样品（约电子显微镜对病毒的薄样品（约1100um）或纯化）或纯化
16、的病毒悬液中进行病毒的直接观察。的病毒悬液中进行病毒的直接观察。5、RTPCR检测（检测（Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction）：）：RT-PCRRT-PCR是将是将RNARNA模板的模板的反转录（反转录（RTRT）, ,和和cDNAcDNA的聚合酶链式扩增（的聚合酶链式扩增（PCRPCR）相）相结合的技术。结合的技术。RT-PCRRT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检技术灵敏而且用途广，可用于检测病毒测病毒DNADNA的转录产物，分析表达的水平。该方法已用的转录产物，分析表达的水平。该方法已用于大蒜脱毒苗检测。于大蒜脱毒苗检测。四、无
17、毒苗的保存与繁殖：四、无毒苗的保存与繁殖：（一）无毒苗的保存：（一）无毒苗的保存： 无毒苗木需在隔离条件下保存以防止再度感染病毒，一无毒苗木需在隔离条件下保存以防止再度感染病毒，一般在专用的防虫网室进行培养，或者在离体条件下保存。般在专用的防虫网室进行培养，或者在离体条件下保存。（二）无毒苗的繁殖：（二）无毒苗的繁殖：1.无毒苗的继代培养与快速繁殖无毒苗的继代培养与快速繁殖2. 可采用不定芽或丛生芽等途径进行无毒苗的快繁。可采用不定芽或丛生芽等途径进行无毒苗的快繁。3.2. 无毒苗的生根及微型鳞茎的培养无毒苗的生根及微型鳞茎的培养4. 生长至生长至1.0-1.5 cm的无毒苗接种于生根培养基诱导生根或的无毒苗接种于生根培养基诱导生根或在诱导试管鳞茎、试管种薯等培养基上诱导形成脱毒鳞茎、在诱导试管鳞茎、试管种薯等培养基上诱导形成脱毒鳞茎、脱毒种薯等繁殖材料。脱毒种薯等繁殖材料。2010312
