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1、第十二章第十二章 分子发光分析法分子发光分析法12.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理12.3 荧光和磷光分析仪荧光和磷光分析仪12.1 分子发光分析概述分子发光分析概述12.4 荧光和磷光分析法的特点和应用荧光和磷光分析法的特点和应用12.5 化学发光分析化学发光分析本章学习要求本章学习要求掌握掌握分子荧光光谱法、分子磷光光谱法和化学分子荧光光谱法、分子磷光光谱法和化学发光分析的基本原理；发光分析的基本原理；了解影响荧光、磷光及化学发光强度的因素；了解影响荧光、磷光及化学发光强度的因素；了解三种光谱仪的基本组成部件及其作用；了解三种光谱仪的基本组成部件及其作用；熟悉三种方法的基
2、本应用。熟悉三种方法的基本应用。12.1 分子发光分析概述分子发光分析概述物质分子吸收能量跃迁到电子激发态后，在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光，以此建立起来的分析方法称为分子发光分析法。分子发分子发光分析光分析法法光致发光分析（）光致发光分析（）电致发光分析（）电致发光分析（）化学发光分析（）化学发光分析（）生物发光分析（）生物发光分析（）一、荧光和磷光的产生一、荧光和磷光的产生1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；是量子化的；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见图12-1)；速度最快、激发态寿命最
3、短的途径占优势； 第一、第二、电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、电子激发三重态 T1 、 T2 ；12.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃内转移振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转移l l 2T2内转移振动弛豫2.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重态：电子激发态的多重态：M=2S+1 S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)； 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态； S0T1 为禁阻跃迁；必须通过其他途径进入，
4、进入的几率小； 根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定；而三根据洪特规则，平行自旋比成对自旋稳定；而三重态能级比相应单重态能级低，所以平均寿命长。重态能级比相应单重态能级低，所以平均寿命长。3 3. .激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电电子子从从激激发发态态返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃跃迁迁(发发光光)和和无无辐辐射跃迁等方式失去能量：射跃迁等方式失去能量：传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁荧光荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级
5、基态；S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃内转移振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转移l l 2T2内转移振动弛豫非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程振振动动弛弛豫豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s。内转移内转移：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外外转转移移：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转移使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃系间窜跃：不同多重态,有重叠的转
6、动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电子由第一激发：电子由第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态（基态（ 多多为为 S S1 1 S S0 0跃迁跃迁），），发射波长为 2的荧光； 10-710 -9 s 。 磷光发射磷光发射： 电子由第一激发电子由第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态（基态（ T T1 1 S S0 0跃迁跃迁）；）； 电子由S0进入T1的过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢： 10-410 s 。 光照停止
7、后，可持续一段时间。二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱 1.1.荧光荧光( (磷光磷光) )的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固固定定待待观观测测的的发发射射波波长长( (一一般般选选最最大大发发射射波波长长),),改改变变激激发发光光波波长长，根根据据化化合合物物发发射射的的荧荧光光( (磷磷光光) )强强度与激发光波长的关系得度与激发光波长的关系得激发光谱激发光谱曲线曲线 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；多，荧光强度最大；2.2.荧光发射光谱荧光发射光谱( (或磷光光谱或磷光光谱) ) 固定激发光波长固定激发光波长
8、( (选最大激发波长选最大激发波长),),扫扫描发射光波长，根据描发射光波长，根据化合物发射的荧光化合物发射的荧光( (或或磷光磷光) )强度与发射光波强度与发射光波长关系得到的曲线长关系得到的曲线( (图图中曲线中曲线II或或III) )。3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系a.Stokesa.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，是振动弛豫消耗了能量。b.b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态
9、的最低振动能级再跃迁回到基态的各振动能级，产生波长一定的荧光(如2 )。 c c. . 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。 200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱4.荧光效率荧光效率荧光效率（荧光效率（ ）：）：分子产生荧光必须具备的分子产生荧光必须具备的条件：条件：（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。 1。 荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速
10、速率率常常数数有有关关。如果外转换过程速度快，不出现荧光发射；如果外转换过程速度快，不出现荧光发射；5.5.荧光与分子结构的关系荧光与分子结构的关系（1）跃跃迁迁类类型型： * 的的荧荧光光效效率率高高，系系间间跨跨越越过过程程的的速率常数小，有利于荧光的产生；速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共共轭轭效效应应：提提高高共共轭轭度度有有利利于于增增加加荧荧光光效效率率并并产产生生红移。红移。（3）刚性平面结构刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧
11、光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应取代基效应：芳环上的不同取代基对该化合物的荧光强：芳环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大影响。给电子基团使荧光增强；吸电子度和荧光光谱有很大影响。给电子基团使荧光增强；吸电子基团使荧光减弱甚至猝灭。参看基团使荧光减弱甚至猝灭。参看P349表表12-1。5 5. .荧光定量分析原理荧光定量分析原理(1)荧光定量关系式荧光定量关系式 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If Ia 由比耳定律：由比耳定律： Ia I0-It I0 (1-10- b c )
12、 If I0(1-10- b c ) I0(1-e-2.3 bc ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：（浓度很低时，将括号项近似处理后：（参看参看P.349） If 2.3 I0 b c Kc荧光定量关系式荧光定量关系式（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。（3 3）影响荧光强度的因素）影响荧光强度的因素1 1）溶剂的影响）溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。
13、2 2）温度的影响）温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3 3）溶液）溶液pHpH的影响的影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。4 4）各种散射光的影响）各种散射光的影响5 5）激发光照射的影响）激发光照射的影响由溶剂产生的散射光（瑞利或拉曼散射）有可能产生较严重的干扰。消除方法：通过选择合适的激发波长来消除。有些荧光物质会发生光分解，使荧光强度降低。消除方法：采用低强度激发光、缩短测定时间。6 6）荧光猝灭）荧光猝灭荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度下降或消失的现象称为荧光猝灭。 u碰撞猝灭：M+ Q(熄灭剂) M + Q
14、+ 热（熄灭）或M+ Q(熄灭剂) M + Q u 氧的熄灭作用：溶液中溶解氧分子可加速系间窜跃。u自熄灭和自吸收：荧光物质浓度大时产生。自熄灭激发态之间碰撞引起能量损失形成。自吸收当荧光光谱与吸收光谱重叠时，荧光被溶液中基态分子吸收。7 7）内滤光作用）内滤光作用溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾等。6.荧光定性分析荧光定性分析根据荧光物质的激发光谱和发射光谱可以鉴别化合物。常用比较法：在相同的分析条件下，将待测物的荧光发射光谱与预期化合物的荧光光谱比较，若特征峰波长及形态一致，则可能为该物质。也可采用预期化合物的激发光谱进行比较亦可。若使用两者结合，则结果可信
15、度大大提高。参看P.351图12-312.312.3荧光和磷光的分析仪器荧光和磷光的分析仪器四部分四部分组成：激发光源、试样池、双单色器系统、检测器。组成：激发光源、试样池、双单色器系统、检测器。 特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图：光光源源：高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)。单单色色器器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；检测器检测器：光电倍增管。同步扫描技术同步扫描技术 同同步步扫扫描描技技术术可可简简化化光光谱谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。 合适的合适的可可减少光谱重叠减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的
16、荧光激发光谱相似 ， 发 射 光 谱 严 重 重 叠 ， 但60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。磷光检测磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：测量方法：（1 1）通通常常借借助助于于荧荧光光和和磷磷光光寿寿命命的的差差别别，采采用用磷磷光光镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。（2 2）采采用用脉脉冲冲光光源源和和可可控控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。 室室温温测测量量时时，不不需需要要杜瓦瓶。杜瓦瓶。12.412.4荧光和磷光分析法的特点与应用荧光和磷光分析法的特点与应用1. 1. 特点特点（1 1）灵敏度高）
17、灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级； （2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。2 2. .荧光分析法的应用荧光分析法的应用1)1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。2)2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见下表 2007-11-8主要用于痕量物质分析，也可用于分子结构性能测定。三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见下表2.2.农药
18、、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 g/cm-3 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 见下表2007-11-812.5化学发光分析化学发光分析化学发光机理：一些物质在进行化学时，吸收了的化学能，使产物分子激发至激发态，返回基态时发射出光子。能产生化学发光的反应的基本要求：1.化学反应能提供足够的能量；2.吸收化学能后的分子必须能释放出光子或转移给另一分子放出光子。1. 1. 化学发光反应化学发光反应在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C
19、+ D*A +B = C + D* D* D + D* D + h h （1 1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2 2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E E=170=170300 kJ/mol300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3 3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光。2 2. .化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据定量
20、依据：定量依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：3 3. .化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a. a. 一氧化氮与一氧化氮与O O3 3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.b.氧原子与氧原子与SOSO2 2、NONO、COCO的发光反应的发光反应氧原子与氧原子与SOSO2 2的发光反应：的发光反应： O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 +
21、 O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3； O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3； 氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：c. 乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激
22、发态乙醛：反应，生成激发态乙醛： CH2O* CH2O + h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；（2 2）火焰中的化学发光反应）火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a. 一氧化氮一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm； 最大发射波长：最大发射波长：690nm； 在在富氢火焰中：富氢火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 该反应十分迅速；该反应十分迅速；
23、b.硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等等在富在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm； 最大发射波长：最大发射波长：394nm； 灵敏度：灵敏度： 0.2 ng/cm-3； 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。（3 3）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。结束结束作业作业P.356第3、4题第1题中“仪器”为思考部分
