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1、地中海贫血的实验室检测地中海贫血的实验室检测 及临床应用及临床应用深圳益生堂生物企业有限公司深圳益生堂生物企业有限公司深圳益生堂生物企业有限公司深圳益生堂生物企业有限公司 2021/5/211主要内容主要内容地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的实验室检测及应用地中海贫血的实验室检测及应用少见型地中海贫血应用范例少见型地中海贫血应用范例技术服务简介技术服务简介2021/5/212红细胞红细胞血液中数量最多的一种红细胞血液中数量最多的一种红细胞运送氧气功能运送氧气功能红细胞中含红细胞中含 有血红蛋白，有血红蛋白，因而使血液因而使血液呈红色呈红色 。血红蛋白合成不足或不能合成血红
2、蛋白合成不足或不能合成，引起贫血。引起贫血。2021/5/213血红蛋白成人血红蛋白成人血红蛋白HbA由两条由两条珠蛋白链和两条珠蛋白链组成，每条肽链有一个包含铁原子的环状血红素2021/5/214 血红蛋白病概念 由编码珠蛋白的基因突变引起珠蛋白肽链异常所致由编码珠蛋白的基因突变引起珠蛋白肽链异常所致的疾病统称血红蛋白病。分为两种情况：的疾病统称血红蛋白病。分为两种情况： 1 1、异常血红蛋白病：基因突变导致珠蛋白肽链、异常血红蛋白病：基因突变导致珠蛋白肽链结构结构发生改变。（珠蛋白的一级结构发生改变发生改变。（珠蛋白的一级结构发生改变 的血红的血红蛋白）蛋白） 2 2、地中海贫血：基因突变
3、导致珠蛋白肽链、地中海贫血：基因突变导致珠蛋白肽链合成量合成量减减少。少。 地中海贫血是血红蛋白病的重要类型之一地中海贫血是血红蛋白病的重要类型之一 2021/5/215 血红蛋白病的分类2021/5/216地中海贫血概念地中海贫血概念地中海贫血是由于地中海贫血是由于珠蛋白基因的基因的缺缺 失失或或缺缺 陷陷使某使某种蛋白链合成受到抑制而引起的溶血性贫血，为种蛋白链合成受到抑制而引起的溶血性贫血，为单基因遗传病。典型的常染色体单基因遗传病。典型的常染色体隐性隐性遗传病。遗传病。主要有两种类型：主要有两种类型：-地中海贫血-地中海贫血2021/5/217地中海贫血临床特征（中、重度）地中海贫血临
4、床特征（中、重度）小细胞低色素性溶血性贫血小细胞低色素性溶血性贫血黄疸黄疸肝脾肿大（脾大明显）肝脾肿大（脾大明显）骨髓增生骨髓增生生长发育迟缓生长发育迟缓合并感染合并感染BartsBarts水肿胎输血依赖性2021/5/218地中海贫血的遗传学基础2021/5/219地中海贫血的遗传规律地中海贫血的遗传规律2021/5/2110人体不同发育时期的血红蛋白及其组成人体不同发育时期的血红蛋白及其组成2021/5/2111人体不同发育时期的珠蛋白表达规律人体不同发育时期的珠蛋白表达规律2021/5/2112蛋白链发育阶段特异性的临床意义蛋白链发育阶段特异性的临床意义胎儿血红蛋白为胎儿血红蛋白为2 2
5、2 2 所以所以地贫的纯合子( (基因不表达）, ,由于不能合成肽链，出现Hb BartsHb Barts水肿胎, ,宫内发生严重贫血。 （孕妇可发生妊娠高血压综合征、巨大胎盘、产后出血等并发症）胎儿期的链是低水平表达，以链表达为主，所以链的减少对胎儿期无影响，出生后头几个月链逐渐被链取代，故重型地贫一般在出生几个月才出现贫血。（贫血逐渐加重，肝脾大，反复输血和去铁治疗）2021/5/2113胎儿重型胎儿重型地贫和成人地贫和成人HbHHbH病的病理病的病理生理学机制生理学机制2021/5/2114中国南方中国南方和和地贫的人群携带率地贫的人群携带率2021/5/2115非缺失型非缺失型地贫地贫
6、广西地区广西地区5789例样本中异常血红蛋筛查结果例样本中异常血红蛋筛查结果 类型类型 携带率携带率 WS 1.55% QS 0.36% CS 1.21% 2021/5/2116和和病理学机制和临床分类病理学机制和临床分类2021/5/2117主要内容主要内容地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的实验室检测及应用地中海贫血的实验室检测及应用少见型地中海贫血应用范例少见型地中海贫血应用范例技术服务简介技术服务简介2021/5/2118- -地贫的概念地贫的概念由于由于珠蛋白基因缺失缺失或点突变，使链合成受到抑制而引起的贫血。 - -基因缺陷基因缺陷 -链不足链不足 -地贫地贫
7、16p13 正常人共有4个基因 (每条16号染色体上有2个)正常人共有正常人共有4 4个个基因基因 ( (每条每条1616号染色体上有号染色体上有2 2个个) )有4个基因 (每条16号染色体上有2个)2021/5/2119地贫分子基础地贫分子基础有两种分子机制引起地贫：缺失型缺失型地贫，占地贫的95%以上，由基因缺失引起。非缺失型非缺失型地贫，占地贫约5%，由基因点突变引起。2021/5/212017171717种引起种引起种引起种引起 珠蛋白表达降低的常见缺珠蛋白表达降低的常见缺珠蛋白表达降低的常见缺珠蛋白表达降低的常见缺 失突变失突变失突变失突变2021/5/2121中国南方人群中国南方
8、人群1212种非缺失型种非缺失型地中海贫血地中海贫血的突变谱的突变谱2021/5/2122 - -地贫的分类地贫的分类静止型静止型地贫轻型地贫HbHHbH病Hb Barts Hb Barts 巴氏胎儿水肿综合症 2021/5/2123静止型静止型地贫地贫基因型基因型：一个-珠蛋白基因缺失或突变。珠蛋白基因缺失或突变。 表示为：-/或或T/ (T表示突变型）临床表现临床表现：无症状，血常规正常 Hb电泳分析电泳分析： 新生儿：Hb Barts 0.5%1%。 成 人：Hb电泳难以检出 2021/5/2124 静止型静止型地贫地贫 地贫地贫筛查常发现不了筛查常发现不了，需要作，需要作基因检测，基因
9、检测， 但若和但若和0地中海贫血杂合子通婚后则有地中海贫血杂合子通婚后则有 可能生育较严重的可能生育较严重的HbH病患儿。病患儿。 常见有：常见有：-3.7/、-4.2/ 、WS/2021/5/2125轻型轻型地贫地贫基因型：基因型：2个-珠蛋白基因缺失珠蛋白基因缺失 或每条染色体上各有一个或每条染色体上各有一个 基因缺失或缺陷基因缺失或缺陷 表示为：- -/或 -/- 或或-/T临床表现临床表现：无明显症状；红细胞脆性降低（60%）； MCV80fl；MCH27pg；Hb正常或轻度下降 亨氏小体可能阳性 血象：小细胞低色素性贫血 Hb电泳分析电泳分析： 新生儿：Hb Barts 1%10%
10、成年人：HbA2 2.5%2021/5/2126HbHHbH病病基因型基因型：3个-珠蛋白基因缺失或突变珠蛋白基因缺失或突变 表示为： - -/-（- -/T） 临床表现：临床表现： 链的合成受到严重影响，大量的-珠蛋白链过剩而聚合为四聚体HbH（4），使红细胞受损，导致慢性溶血性贫血。 有轻度或中度贫血，部分患者伴肝脾肿大及轻度黄疸，较重者亦需输血治疗。感染和服用氧化性药物及妊娠均可使贫血加重。2021/5/2127HbHHbH病病2021/5/21282 2类类HbHHbH病的血液学参数比较病的血液学参数比较2021/5/2129地贫疾病严重程度的单倍型顺序地贫疾病严重程度的单倍型顺序2约
11、占基因表达量的2/3,1基因占1/32021/5/2130Hb Barts Hb Barts 胎儿水肿综合征胎儿水肿综合征 基因型：基因型：四个-珠蛋白基因缺失或突变珠蛋白基因缺失或突变 表示为：- -/- - 临床表现：临床表现： 链不能合成，链聚合成 Hb Barts (4)，氧亲和力高，造成组织缺氧坏死，导致早产、死胎，个别能活到足月，也会于出生几小时内死亡。 胎儿有苍白、水肿、肝脾肿大，胸腹腔积液，大胎盘。孕妇容易合并妊娠高血压综合征及产后出血等并发症。 Hb电泳分析：电泳分析： Hb Barts 7080% Hb portland（ 2 2 ） 725% Hb A 0 Hb F 0
12、2021/5/2131胎儿水肿（一）胎儿水肿（一）2021/5/2132胎儿水肿（二）胎儿水肿（二）2021/5/2133中国人常见的缺失型中国人常见的缺失型地贫地贫0地贫：地贫：一条染色体上缺失两个连锁的一条染色体上缺失两个连锁的基因，即基因，即1和和2 基基因都缺失，如因都缺失，如- -SEA/ ，又称东南亚缺失型，又称东南亚缺失型; - -THAI / , 又称又称泰国型泰国型缺失缺失。 +地贫：地贫：是一条染色体上缺失是一条染色体上缺失1个个基因（基因（1或或2），分两种：），分两种： -3.7（右侧缺失）：（右侧缺失）：缺失缺失2的的3端和端和1的的5端，缺失片段约端，缺失片段约 3
13、.7kb。 -4.2 （左侧缺失）：（左侧缺失）：2 基因完全缺失，基因完全缺失，1 基因完整，缺失基因完整，缺失 片段为片段为4.2kb。 由于2基因的表达水平占整个基因的表达水平占整个基因表达量的基因表达量的70%左右，理论上左右，理论上左缺失型比右缺失型对左缺失型比右缺失型对基因表达的影响大。基因表达的影响大。 2021/5/2134实验室检测诊断技术实验室检测诊断技术筛查筛查+ +基因检测：基因检测：1、血细胞自动分析技术血细胞自动分析技术：获取数据：RBC、HGB，MCV MCH等数据。2、血红蛋白分析血红蛋白分析：获取数据：HbA、HbA2、HbF以及一些异常血红蛋白3、Gap-P
14、CRGap-PCR：获取数据：缺失型、缺失型4、反向点杂交（RDB)）：非缺失型、2021/5/2135缺失型缺失型地贫的诊断（地贫的诊断（Gap-PCRGap-PCR法）法） 益生堂益生堂检测中国人群常见4 4 种-地中海贫血缺失型：-SEA ，-3.7，-a4.2 和- -THAI ； 国内唯一唯一获得CFDA批准检测泰国型泰国型缺失的试剂，扩大了检测范围，减少漏诊风险;。 可用于抗凝外周血样本、羊水样本或胎绒毛样本等。灵敏度高。 单管多重PCR，检测流程简便、快速，结果准确、可靠。2021/5/2136Gap-PCRGap-PCR检测缺失型检测缺失型地中海贫血基因地中海贫血基因2021/
15、5/2137非缺失型非缺失型的诊断（的诊断（PCRPCR探针法）探针法）益生堂益生堂检测中国人群中常见的3种2 基因点突变: CSCS 、 QSQS、 WSWS检测非缺失型检测非缺失型和和地贫基因时各项控制参数相同，可地贫基因时各项控制参数相同，可同机扩增、同管杂交、洗涤、显色同机扩增、同管杂交、洗涤、显色杂交时间灵活（可杂交杂交时间灵活（可杂交2-18小时），便于合理安排实小时），便于合理安排实验时间验时间2021/5/2138非缺失型非缺失型地贫地贫基因检测基因检测 （RDBRDB法）法）3种非缺失型地贫突变位点(WS,CACCAG;QS,CTGCCG;CS,TAACAA)2021/5/2
16、139地贫的遗传咨询（一）地贫的遗传咨询（一）2021/5/2140地贫的遗传咨询（二）地贫的遗传咨询（二）2021/5/2141地贫的遗传咨询（三）地贫的遗传咨询（三）2021/5/2142地贫产前诊断指征（一）地贫产前诊断指征（一）夫妇双方都携带-SEA /夫妇双方都携带-THAI /夫妇一方为-SEA /另一方为-THAI / 有1/4的机会生育Hb Barts 水肿胎水肿胎，需要产前诊断。2021/5/2143地贫产前诊断指征（二）地贫产前诊断指征（二）一方为一方为-SEA /或-THAI /,其配偶为T非缺失型突变（突变型为CS、QS）,需要产前诊断。2021/5/2144 地贫诊断
17、小结地贫诊断小结首先夫首先夫妇双方做地双方做地贫筛查（血常（血常规+Hb分析）分析）筛查提示提示 -地地贫时，双方做，双方做 -基因基因检查（注意同（注意同时检查缺失及非缺失缺失及非缺失 基因）若基因基因）若基因结果出果出现 -地地贫产前前诊断指征，需要做断指征，需要做产前前诊断断根据具体情况根据具体情况选择产前前诊断方法断方法胎儿胎儿为HbBarts水水肿胎胎时，建，建议终止妊娠；止妊娠；为HbH病病时，根据病人意愿，根据病人意愿处理理2021/5/2145地贫分子基础地贫分子基础大部分基因点突变和少部基因缺失2021/5/2146地贫的概念地贫的概念由于珠蛋白基因的突变，引起血红蛋白链合成
18、的减少或缺乏缺乏而形成的溶血性贫血。-基因缺陷 链不足 地贫基因在11号染色体上（11p15），每条染色体上有1个基因。2021/5/2147珠蛋白基因突变及其对基因功能的影响珠蛋白基因突变及其对基因功能的影响0 0 : 珠蛋白链不能合成 + + : 珠蛋白链合成减少2021/5/2148中国南方人群中国南方人群4646种种地贫点突变谱及其功地贫点突变谱及其功能影响能影响2021/5/2149珠蛋白基因突变及其对基因功能的影响珠蛋白基因突变及其对基因功能的影响2021/5/2150地贫常见的基因缺失突变地贫常见的基因缺失突变2021/5/2151 地贫病临床表现及分型地贫病临床表现及分型202
19、1/5/2152地贫病临床表现及分型地贫病临床表现及分型注：根据人体不同发育时期的血红蛋白及其组成，注：根据人体不同发育时期的血红蛋白及其组成，胎儿发育直至出生时胎儿发育直至出生时基因低水平表达，导致地中海贫血的突变对基因的抑制作用在出生时难以显示，因此重型地贫患儿出生时不会表现出疾病类型。出生后几个月发病（1周岁内）基因确诊！2021/5/2153地贫基因型与表型的关系地贫基因型与表型的关系2021/5/2154夫妇双方均为地贫携带者（0或+），有1/4的机会生育中、重型患儿。2021/5/2155地贫的实验室检测地贫的实验室检测1 1、筛查：筛查指指标（与前述 -地贫一样）：血常规+Hb分
20、析仪器：器：红细胞计数仪、Hb电泳仪或高效液相分析仪筛查阳性：阳性： MCV80 fL，MCH 3.5%HbA2升高升高对判断-地贫至关重要，几乎可筛查出所有-地贫基因携带者。2021/5/2156地贫的实验室检测地贫的实验室检测2 2、地贫的基因检测地贫的基因检测 PCR- RDB法注意：大部分所用基因检测方法只检测常见的17个基因点突变，不能检查少见或罕见的点突变。当检测阴性阴性时，应结合HbA2值判断。2021/5/2157地中海贫血基因检测试剂盒（地中海贫血基因检测试剂盒（PCRPCR探针探针法）法） （益生堂）（益生堂）起始样本为抗凝人全血，羊水或胎绒毛。检测高通量，一份标本只需做一
21、管PCR即可鉴别临床意义重大的1717种种点突变点突变。全过程大约6-8小时。寡核苷酸探针杂交，特异性高，操作简便，重复性、稳定性良好易于推广应用，凡能开展PCR实验的单位(有PCR仪和分子杂交炉/恒温水浴摇床)均能采用本试剂盒。与非缺失非缺失-地中海贫血基因检测试剂盒扩增条件相同扩增条件相同。采用。采用相相 同同的扩增和杂交参数，一台的扩增和杂交参数，一台PCR PCR 仪仪同时同时扩增，同管杂交扩增，同管杂交，且同，且同一一 份杂交物份杂交物可经过可经过1-21-2次的重新杂交，可进行结果的复核与验证次的重新杂交，可进行结果的复核与验证。2021/5/2158检测原理检测原理( (PCR-
22、RDBPCR-RDB用于检测用于检测和和点突变点突变) )2021/5/2159重型重型地贫：地贫：0突变双重杂合子突变双重杂合子2021/5/2160地贫复合地贫复合地贫地贫指同指同时携携带有有地地贫和和地地贫，因，因为是不同是不同类型型的地的地贫，患者一般无症状，患者一般无症状。地地贫筛查的表的表现同同地地贫（MCV, Hb A2MCV, Hb A2），），因此无法与因此无法与单纯的的地地贫区区别开。开。检查地地贫携携带者的者的地地贫基因是唯一的区基因是唯一的区别方法方法。2021/5/2161地贫复合地贫复合地贫地贫因此，当夫妇双方的一方是地贫，另一方是地贫时，地贫携带者应检查地贫基因。
23、若是地贫复合 地贫，则根据情况产前诊断。2021/5/2162地贫复合地贫复合地贫示例地贫示例2021/5/2163地贫复合地贫复合地贫示例地贫示例2021/5/2164基因诊断方法基因诊断方法Gap-PCR技术技术，缺失型，缺失型-地中海贫血基因检测的首选地中海贫血基因检测的首选方法方法PCR-探针法探针法(RDB)技术技术，-地中海贫血突变基因检测、地中海贫血突变基因检测、非缺失型非缺失型-地中海贫血突变基因检测的首选方法地中海贫血突变基因检测的首选方法MLPA (缺失型、分子诊断技术）DHPLC（地中海贫血突变分析）DNA序列测定序列测定法法（direct sequencing,DS）基
24、因突变检测方法的金标准高分辨熔解曲线熔解曲线分析系统（HRM或HRMA）:DNA序列突变的检测2021/5/2165主要内容主要内容地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的实验室检测及应用地中海贫血的实验室检测及应用少见型地中海贫血应用范例少见型地中海贫血应用范例技术服务简介技术服务简介2021/5/2166少见型地贫基因检测指征及流程少见型地贫基因检测指征及流程2021/5/2167示例示例一：一：地贫的基因诊断（基因测序）地贫的基因诊断（基因测序）试剂盒检测范围只包括试剂盒检测范围只包括1717个个基因点突变，不能检测少见或罕见的点突变，当检测到阴性时，应结合HbA2HbA
25、2值综合判断。2021/5/2168地贫的基因诊断地贫的基因诊断 ( (基因测序）基因测序） 7195测序结果： 在在nt397处出现双峰，处出现双峰，GA，对应于，对应于CD37(TGGTAG)，已知文献报道与已知文献报道与-地贫地贫有关有关。2021/5/2169示例一中示例一中地贫的基因诊断地贫的基因诊断 ( (基因测序）基因测序）2021/5/2170示例二：示例二：地贫的基因诊断（基因测序地贫的基因诊断（基因测序）2015年11月深圳市 医院， 1 孕妇遗传咨询父亲 41-42M杂合子 母亲 未检出17种突变先证者（？岁）夫妻俩第一个孩子检出41-42M杂合子但每月需定期输血！母亲可
26、能存在试剂盒检测范围外的突变，先证者、母亲均进行测序母亲：CD8-9(+G)突变，突变，已知文献报道与已知文献报道与-地贫有关地贫有关先证者：先证者： CD8-9(+G)和和CD41-42（ -TCTT ）突变）突变胎儿胎儿：未检出未检出突变（突变（测序结果有效范围：珠蛋白基因-90至IVS-2-100、IVS-2-500至3，Poly A部分，包含了地中海贫血预防控制操作指南中报道的46种中国南方人群-地中海贫血突变位点及在此区域内的未知突变位点。）2021/5/2171示例二中先证者测序图示例二中先证者测序图2021/5/2172示例二中先证者测序图示例二中先证者测序图2021/5/217
27、3示例三：示例三：地贫基因检测（缺失型地贫基因检测（缺失型）父亲： -SEA /27-28M/27-28M母亲： -SEA /N/N胎儿(脐血）： /N/N小孩未遗传到父亲的27-28M位点突变，不符合遗传规律父亲是否有缺失（无筛查指标）2021/5/2174示例三：示例三：地贫基因检测（缺失型地贫基因检测（缺失型）2021/5/2175示例四：少见示例四：少见缺失缺失女，39岁，福建永泰人，汉族，2015年4月进行孕期检查。查体：贫血面容。HGB 96 gL、(MCV)52.4 fl、(MCH)15.2 Pg、Hb A2 1.5，常规地贫基因检测检出东南亚型地贫缺失片段(-SEA/-SEA)
28、，提示怀疑存在其他缺失片段。 确认基因型：确认基因型：-27.6/-SEA2021/5/2176问题一：问题一：MCVMCV低一定是地贫吗低一定是地贫吗2021/5/2177问题二：血红蛋白异常一定是地贫吗问题二：血红蛋白异常一定是地贫吗2021/5/2178问题三问题三2021/5/2179问题四问题四2021/5/2180问题五：什么情况下需要作地贫的产前诊问题五：什么情况下需要作地贫的产前诊断断双方为同一种地贫携带者双方为同一种地贫携带者怀孕或分娩过巴氏水肿胎怀孕或分娩过巴氏水肿胎分娩过重度分娩过重度地贫患儿地贫患儿夫妇双方之一为夫妇双方之一为地贫基因携带者，另一地贫基因携带者，另一方为
29、方为合并合并地贫基因携带者地贫基因携带者2021/5/2181主要内容主要内容地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的遗传学基础地中海贫血的实验室检测及应用地中海贫血的实验室检测及应用少见型地中海贫血应用范例少见型地中海贫血应用范例技术服务简介技术服务简介2021/5/2182少见型地中海贫血基因检测服务（一）少见型地中海贫血基因检测服务（一）益生堂益生堂缺失型地贫：-2.4、-27.6、-21.9、HK等2021/5/2183香港型缺失香港型缺失HK检测示例检测示例2021/5/2184少见型地中海贫血基因检测服务（二）少见型地中海贫血基因检测服务（二）益生堂益生堂点突变（测序法）1:CD74(G
30、ACCAC)、CD78(-C)CD118（+TCA)2:CD13（GCCTCC)、CD30(-GAG)、CD31(AGGAAG)、CD43/44(-C)、CD49(-GC)、CD59(GGCGAC)2021/5/2185少见型地中海贫血基因检测服务（三）少见型地中海贫血基因检测服务（三）益生堂益生堂2021/5/2186少见型地中海贫血基因检测服务（四）少见型地中海贫血基因检测服务（四）益生堂益生堂缺失地贫中国型（chinese）东南亚型（S.E.Asian）中国台湾型（Taiwanese）2021/5/2187深圳益生堂生物企业有限公司深圳益生堂生物企业有限公司2021/5/2188 谢谢 谢谢2021/5/2189部分资料从网络收集整理而来，供大家参考，感谢您的关注！
