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1、鱼类细胞工程基础实验鱼类细胞工程基础实验指导老师指导老师 王敏王敏 汤蓉汤蓉辅助研究生辅助研究生 尹晓燕尹晓燕 童娜童娜1课程安排课程安排234 动物细胞工程动物细胞工程 动物动物细胞工程细胞工程，是是应用细胞生物应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计，进行在细胞水平上的遗人们的设计，进行在细胞水平上的遗传操作传操作, ,从而获得新型生物。从而获得新型生物。5动物细胞工程常用技术动物细胞工程常用技术动物细胞培养技术动物细胞培养技术动物细胞融合技术动物细胞融合技术 单克隆抗体技术单克隆抗体技术胚胎移植技术胚胎移植技术细胞核移植技术细胞核移植技术6动
2、物细胞培养动物细胞培养 细胞培养是指从动物活体中取出小块细胞培养是指从动物活体中取出小块组织分离出细胞，在模拟机体内的生理环组织分离出细胞，在模拟机体内的生理环境条件下，进行培养，使之继续生存、生境条件下，进行培养，使之继续生存、生长、增殖。长、增殖。 原代培养原代培养传代培养传代培养永久细胞系永久细胞系7细胞培养在水产业的应用细胞培养在水产业的应用鱼类病毒学：鱼类病毒学：病毒的分离、鉴定以及病毒病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备疫苗的制备鱼类细胞毒理学：鱼类细胞毒理学：评价样品的细胞毒性等评价样品的细胞毒性等水产基础理论水产基础理论鱼类免疫学鱼类免疫学鱼类遗传学鱼类遗传学8本实验课的目的本实
3、验课的目的 培养实验的思维，提高实验技能，锻培养实验的思维，提高实验技能，锻炼动手能力。炼动手能力。 掌握无菌操作，养成规范的实验室工掌握无菌操作，养成规范的实验室工作习惯。作习惯。 为将来适应多种领域的工作打基础。为将来适应多种领域的工作打基础。9鱼类细胞培养的基本条件鱼类细胞培养的基本条件1.温度温度 温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致化能力。温度过高导致细胞死亡细胞死亡。这主要。这主要是由酶和是由酶和蛋白质蛋白质所需要的最适温度决定的。所需要的最适温度决定的。
4、适宜的温度：适宜的温度：25(温带鱼温带鱼) )、30(30(热带鱼热带鱼) )、15(15(寒带鱼寒带鱼) )、37 (水生哺乳动物水生哺乳动物) )。102. pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用用 NaHCO3。鱼类细胞培养的基本条件鱼类细胞培养的基本条件113.渗透压渗透压 细胞膜调节渗透压的能力是有限的。细胞膜调节渗透压的能力是有限的。 需需用平衡盐溶液配制各种试剂。用平衡盐溶液配制各种试剂。 常用的平衡盐溶液：常用的平衡盐溶液： PBS ：磷酸盐缓冲溶液：磷酸盐缓冲溶液
5、（phosphate buffered solution） D-Hanks鱼类细胞培养的基本条件鱼类细胞培养的基本条件124.营养物营养物 细胞培养基：细胞培养基：培养基中含有培养基中含有细胞增殖细胞增殖和生和生长所需要的各种物质。长所需要的各种物质。常用培养基：常用培养基：MEM 、M199、L-15 等等动物细胞离体培养常常需要动物细胞离体培养常常需要血清血清。血清提。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。矿物质和脂肪。小牛血清；胎牛血清小牛血清；胎牛血清。 鱼类细胞培养的基本条件鱼类细胞培养的基本条件135.支持物支持物 大多数动物细胞有
6、贴壁生长的习大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。惯。 离体培养常用离体培养常用玻璃或塑料培养瓶玻璃或塑料培养瓶等作为支持物。等作为支持物。6.气体交换气体交换 CO2培养箱培养箱, 调节调节CO2的比例为的比例为5%。 7.去离子水去离子水/三次蒸馏水三次蒸馏水鱼类细胞培养的基本条件鱼类细胞培养的基本条件148.无菌条件无菌条件 体外细胞培养仅仅是对所体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养无菌条件是细胞离体培养最基
7、本的条件。最基本的条件。 鱼类细胞培养的基本条件鱼类细胞培养的基本条件超净工作台超净工作台15实验室仪器设备实验室仪器设备 实验室条件：实验室条件：干燥、紫外灯干燥、紫外灯 仪器设备：仪器设备： 高压灭菌锅高压灭菌锅: 用于高压灭菌用于高压灭菌干燥箱干燥箱: 用于干燥用于干燥超净工作台超净工作台: 用于无菌操作用于无菌操作 玻璃三蒸水器玻璃三蒸水器: 用于制三蒸馏水用于制三蒸馏水恒温生化培养箱恒温生化培养箱: 用于恒温培养细用于恒温培养细胞胞倒置生物显微镜倒置生物显微镜: 用于观察细胞生用于观察细胞生长长液氮罐：液氮罐：用于细胞长期保存用于细胞长期保存16考核方法考核方法实验报告（论文格式）实
8、验报告（论文格式） 一一. 目的与意义目的与意义 二二. 材料与方法材料与方法三三. 实验结果实验结果四四. 讨论（问题讨论（问题经验经验体会）体会）要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。17修读要求修读要求1无菌操作，严格规范操作；无菌操作，严格规范操作；2实验是连续性的，需要每天来观察实验是连续性的，需要每天来观察和处理细胞；和处理细胞；3. 每天来做实验的时间与老师和研究每天来做实验的时间与老师和研究生协商，各组时间要相对集中和固定。生协商，各组时间要相对集中和固定。18实验一实验一&二二 思考题思考题1.培养基过滤后需要加哪些物质？为什么培养基过滤
9、后需要加哪些物质？为什么？2.为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，不能高压灭菌不能高压灭菌 ？3.生长培养基的生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜值应为多少？呈什么颜色？为什么？色？为什么？4.为什么要培养基中需加入为什么要培养基中需加入L- 谷氨酰胺？谷氨酰胺？5.为什么复苏细胞时，要迅速解冻？为什么复苏细胞时，要迅速解冻？19实验五实验五 染色体制备染色体制备每一物种的细胞一般都具有一定数目、形每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。状和大小的染色体。在在秋水仙素秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在的作用下可使分裂细胞阻断在中期中期，此时染色体形
10、态最典型，然后通过，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。下呈现出其形态。 20一、准备细胞一、准备细胞1.接种细胞：接种细胞：T 75cm2 瓶子瓶子 1个个2.培养培养24 h3.换换10mL新鲜新鲜medium和和0.1mL秋水仙素秋水仙素（1g/L）4.培养培养13-15h 5.消化细胞，消化细胞，1000rpm离心，离心，5分钟，收集沉淀分钟，收集沉淀细胞细胞6.加加2 mL PBS混匀细胞混匀细胞7.将细胞悬液移到将细胞悬液移到T 75cm2的培养瓶内的培养瓶内操作步骤操作步骤218.慢慢加慢慢加10m
11、L双蒸水（双蒸水（4）9.室温孵育室温孵育10min10.慢慢加慢慢加10mL现配的现配的GAA固定液（冰醋酸：固定液（冰醋酸：甲醇甲醇1：3）11.室温放置室温放置10min 12.移到一个离心管，移到一个离心管，1000 rpm离心，离心，10min13.弃去上清，留约弃去上清，留约 2mL14.加加3mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞新鲜固定液，轻轻混匀细胞15.1000rpm离心，离心，5min2217.加加0.5mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加4mL新鲜固定液，轻轻混匀新鲜固定液，轻轻混匀18.孵育孵育 5分钟分钟19.1000 rpm离心，离心，5
12、分钟分钟20.弃去弃去 4.8mL 上清，仅留上清，仅留 0.2 mL21.加加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀二、清洁玻片二、清洁玻片1.6-8个干净的玻片，浸泡在个干净的玻片，浸泡在95% 乙醇里乙醇里2.烘干烘干3.浸泡在冰水里至少浸泡在冰水里至少30 min23三、准备玻片和染色三、准备玻片和染色1.用滴管吸取来自于步骤用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液的细胞悬液0.2mL 2.滴在湿玻片上滴在湿玻片上3.火焰上拖动，固定火焰上拖动，固定2-3次次4.放在预热的切片烘干机上，放在预热的切片烘干机上，15 min （蒸发液体）（蒸发液体）5.把装
13、有把装有1N HCl的染色缸，浸入的染色缸，浸入60水浴中加热，水浴中加热，6.把玻片插入培育把玻片插入培育 10min7.倾去倾去HCl溶液溶液8.用双蒸水清洗玻片用双蒸水清洗玻片2次次9.空气干燥空气干燥2410.将玻片浸入装有将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中（现稀溶液的染色缸中（现稀释的释的1：25）11.孵育孵育 15 min12.用双蒸水冲洗玻片用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液次，除去残液13.空气干燥空气干燥14.显微镜下观察计数显微镜下观察计数25实验六实验六 细胞冻存细胞冻存细胞冻存是细胞冻存是细胞保存细胞保存的主要方法之一。的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于利用
14、冻存技术将细胞置于 -196液氮液氮中低温保存，中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种细胞保种的作用。的作用。可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。送某些细胞。 26冻存原理冻存原理细胞冻存时向培养基中加入保
15、护剂细胞冻存时向培养基中加入保护剂 - 终浓度终浓度5% - 15% 的的二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSO），），可使溶液冰点可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，降低，加之在缓慢冻结条件下， 细胞内水分透出，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，减少了冰晶形成， 从而避免细胞损伤。从而避免细胞损伤。采用采用“慢冻快融慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。的方法能较好地保证细胞存活。 标准冷冻速度开始为标准冷冻速度开始为 -1 - -2/min， 当温度低于当温度低于 - 25时可加速，到时可加速，到 - 80之后可直接投入液氮之后可直接投入液氮内（内（-196）。）。27操作步骤操作步骤1.冻存
16、冻存2个个75cm2培养瓶里的细胞，取培养瓶里的细胞，取68个个 1.5mL的的冻存管。冻存管。 如果每个冻存管需要装如果每个冻存管需要装1 mL的细胞悬浮液，的细胞悬浮液，需要配需要配68mL的冻存液。的冻存液。1.在离心管中依次加入：在离心管中依次加入：轻吹打混匀，轻吹打混匀， 立即立即放入冰里；放入冰里； 另在收集消化好的细胞的离心另在收集消化好的细胞的离心管里加入管里加入培养液培养液 3mL, 轻轻吹打使细胞均轻轻吹打使细胞均匀悬浮。匀悬浮。281.吸取细胞悬液，轻轻加入装有冻存液的离心管内。吸取细胞悬液，轻轻加入装有冻存液的离心管内。注意从底部向上缓慢拖着滴加，边加边转动离心管，注意从底部向上缓慢拖着滴加，边加边转动离心管，使细胞均匀分布冻存液中。将细胞悬液分装在使细胞均匀分布冻存液中。将细胞悬液分装在6个冻个冻存管中，各管加存管中，各管加1mL。 3.盖上冻存管盖子，用膜封口，作好标记。盖上冻存管盖子，用膜封口，作好标记。4.在装有在装有异丙醇的降温盒异丙醇的降温盒中，放装有细胞的中，放装有细胞的冻存管，冻存管， 加盖后盒子放入加盖后盒子放入-80过夜过夜；5.盒子转移到盒子转移到液氮内液氮内，进行登记。，进行登记。29
