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1、荧光定量荧光定量PCR的原理及临床运用的原理及临床运用苏晓霁苏晓霁如何做一个如何做一个“聪明的实习生聪明的实习生l实习的目的就是对在校所学的实际知识和实验技实习的目的就是对在校所学的实际知识和实验技艺，在临床的实践任务中进展实际、稳定和提高。艺，在临床的实践任务中进展实际、稳定和提高。l如何做到：如何做到：l 实习之前要复习实际知识和实验课内容实习之前要复习实际知识和实验课内容l “实际先行实际先行l 实习过程中要实习过程中要“聪明聪明l 做好实习笔记，用心思索，实习之外下功夫做好实习笔记，用心思索，实习之外下功夫如何做一个如何做一个“聪明的实习生聪明的实习生聪聪明明耳：仔细听教师的阐明和讲解
2、耳：仔细听教师的阐明和讲解看：仔细看教师的操作看：仔细看教师的操作问：有疑问要多提问，多讨论问：有疑问要多提问，多讨论心：要用心去思索心：要用心去思索日月：要每天每月坚持做到日月：要每天每月坚持做到内容概要内容概要lPCR的定义和原理的定义和原理l荧光定量荧光定量PCR的原理和分类的原理和分类l荧光定量荧光定量PCR结果的分析结果的分析l荧光定量荧光定量PCR在临床的运用在临床的运用PCR的定义的定义lPCR是是Polymerase Chain Reaction的缩写，中的缩写，中文称为聚合酶链式反响，由变性、退火及延文称为聚合酶链式反响，由变性、退火及延伸几步反响组成一个周期伸几步反响组成一
3、个周期,循环进展循环进展,可使目可使目的的DNA得以迅速扩增。得以迅速扩增。l由美国由美国PE公司遗传部的公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于发明，由于PCR技术的跨时代意义，技术的跨时代意义，Mullis获得了获得了1993年年诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。 PCR的原理的原理l变性：双链变性：双链DNA在高温下解开成单链的过程在高温下解开成单链的过程 。温。温度普通为度普通为95左右。左右。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT55CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGAC
4、TCGACACT5加热加热PCR的原理的原理l退火：温度下降后，两条配对的单链退火：温度下降后，两条配对的单链DNA重新重新结合为双链的过程。温度普通为结合为双链的过程。温度普通为5060。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT降温降温PCR的原理的原理l延伸：延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的聚合酶催化以引物为起始点的
5、DNA链延伸反响链延伸反响 。温度普通为。温度普通为72左右。左右。5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA33GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGAGGTGACGGAGAG GGACTCGACACT恒温恒温普通普通PCR的原理的原理普通普通PCR的原理的原理lPCR反响成分：反响成分：l 1.模板模板DNAl 2.引物引物l 3.四种脱氧核糖核苷酸四种脱氧核糖核苷
6、酸l 4.DNA聚合酶聚合酶(Taq酶酶)l 5.反响缓冲液、反响缓冲液、Mg2+等等l 6.荧光探针荧光定量荧光探针荧光定量PCRTaq酶的发现酶的发现l在在Taq酶发现之前，实验室的酶发现之前，实验室的PCR反响中运用的反响中运用的是大肠杆菌是大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶的的Klenow片段。片段。lKlenow酶不耐高温，酶不耐高温，90加热后会变性失活，加热后会变性失活，每次循环终了都要参与新颖的酶。每次循环终了都要参与新颖的酶。l而且而且DNA的延伸是在的延伸是在37完成，模板和引物容完成，模板和引物容易错配，呵斥反响的特异性很差。易错配，呵斥反响的特异性很差。Taq酶的发现酶的发现l
7、美国的嗜热菌研讨室在黄石国家公园温泉中发美国的嗜热菌研讨室在黄石国家公园温泉中发现了嗜热菌现了嗜热菌(Thermus aquaticus)株，株，Cetus公司公司研讨人员从中分别了研讨人员从中分别了Taq DNA聚合酶聚合酶l特点：特点：耐高温：耐高温：70 2h 活性活性90%，93 2h 活性活性60%，95 2h 活性活性40% ； 延伸延伸温度较高温度较高(普通为普通为72 )：大大提高了扩增特异：大大提高了扩增特异性、灵敏性和扩增效率。性、灵敏性和扩增效率。荧光定量荧光定量PCRl概念：在概念：在PCR反响中参与荧光基团，利用荧光反响中参与荧光基团，利用荧光信号累积或变化实时监测整
8、个反响过程，最后信号累积或变化实时监测整个反响过程，最后经过特定数学模型对未知模板进展定量分析的经过特定数学模型对未知模板进展定量分析的方法。方法。l实时荧光定量实时荧光定量PCR技术于技术于2019年由美国年由美国Applied Biosystems，ABI公司推出，实现了公司推出，实现了PCR从定性从定性到定量的飞跃。到定量的飞跃。实时荧光定量实时荧光定量PCR的原理的原理l利用荧光信号的变化实时监测利用荧光信号的变化实时监测PCR反反响的每个循环的扩增产物量的变化。响的每个循环的扩增产物量的变化。l经过经过Ct值和规范曲线分析对起始标本值和规范曲线分析对起始标本的模板量进展定量分析。的模
9、板量进展定量分析。与普通与普通PCR的比较的比较l普通普通PCR完成后，普通只对扩增的最终完成后，普通只对扩增的最终产物量进展分析，分析结果多为定性产物量进展分析，分析结果多为定性或者半定量结果。或者半定量结果。l荧光定量荧光定量PCR经过监测荧光值的变化，经过监测荧光值的变化，表达每一个循环的扩增产物量的变化，表达每一个循环的扩增产物量的变化，分析结果为定量结果。分析结果为定量结果。与普通与普通PCR的比较的比较l普通普通PCR完成后，才干进展扩增产物的分完成后，才干进展扩增产物的分析，而且分析的过程能够产生一定的生析，而且分析的过程能够产生一定的生物危害和环境污染。物危害和环境污染。l荧光
10、定量荧光定量PCR的扩增和产物分析过程是同的扩增和产物分析过程是同时完成的，而且在封锁的反响体系中进时完成的，而且在封锁的反响体系中进展，比较平安，易于处置。展，比较平安，易于处置。常用的名词概念常用的名词概念l本底信号本底信号Baselinel荧光阈值荧光阈值ThresholdlCt值值Ct valuel扩增曲线扩增曲线前前15个循环荧光信号的均值，可个循环荧光信号的均值，可手动调理选择手动调理选择默许是第默许是第315个循环的荧光信号的规个循环的荧光信号的规范偏向的范偏向的10倍，也可手动调理倍，也可手动调理扩增过程中，产物的荧光信号到达设定的阈值扩增过程中，产物的荧光信号到达设定的阈值时
11、所经过的扩增循环数时所经过的扩增循环数常用的名词概念常用的名词概念ThresholdBaselineCtvalue荧光强度荧光强度Rn扩增循环数扩增循环数对数增长期对数增长期实践中的运用实践中的运用左图为左图为5个数量级的规范品扩增后得到的荧光曲线，个数量级的规范品扩增后得到的荧光曲线，右图以右图以Ct值为纵坐标，值为纵坐标，lgXs为横坐标，可计算得出规范曲线为横坐标，可计算得出规范曲线实时荧光定量实时荧光定量PCR的分类的分类l目前的实时荧光定量目前的实时荧光定量PCR均是基于荧光共振能均是基于荧光共振能量转移量转移Fluorescence resonance energy transfe
12、r，FRET的原理。的原理。FQ10nmFFluorophore,荧光基团荧光基团QQuencher，淬灭基团淬灭基团FQ10nm荧光共振能量转移荧光共振能量转移FRET发生的条件发生的条件l荧光基团和淬灭基团都能发射荧光荧光基团和淬灭基团都能发射荧光l荧光基团的发射光谱和淬灭基团的激发光谱需荧光基团的发射光谱和淬灭基团的激发光谱需有效重叠有效重叠l荧光基团和淬灭基团应足够的近荧光基团和淬灭基团应足够的近500bp片段敏感片段敏感l 75%或无水乙醇溶液喷雾或无水乙醇溶液喷雾荧光定量荧光定量PCR在临床的运用在临床的运用l在反响体系中运用在反响体系中运用dUTP和和UNG酶消除以酶消除以往实验
13、的污染影响往实验的污染影响l UNG酶尿嘧啶酶尿嘧啶-N-糖基化酶：选择糖基化酶：选择性水解断裂含有性水解断裂含有dU的双链和单链中的尿的双链和单链中的尿嘧啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一嘧啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一步水解断裂，酶的最正确活性温度是步水解断裂，酶的最正确活性温度是50，在，在95 失活。失活。荧光定量荧光定量PCR在临床的运用在临床的运用气溶气溶胶污胶污染物染物50 2min， 95 灭活灭活参与参与UNG酶酶荧光定量荧光定量PCR在临床的运用在临床的运用5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3扩增扩
14、增参与参与dUTP5CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA35CCACUGCCUCUC CCUGAGCUGUGA3潜在气溶胶污染物潜在气溶胶污染物502min参与参与UNG酶酶5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3
15、5断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段35断裂的核苷酸片段断裂的核苷酸片段3荧光定量荧光定量PCR在临床的运用在临床的运用l乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)lEB病毒病毒DNA(EBV-DNA)l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)l肺炎支原体肺炎支原体DNA(MP-DNA)l肺炎衣原体肺炎衣原体DNA(CP-DNA)临
16、床标本的采集临床标本的采集检检 测测 项项 目目标标 本本 类类 型型 及及 要要 求求HBV-DNA血清或者血浆血清或者血浆 100l(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)EBV-DNA血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml(不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)HCMV-DNA血清血清100l或抗凝全血或抗凝全血 1ml (不可用肝素抗凝不可用肝素抗凝)MP-DNA CP-DNA咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液 1ml人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l用于器官移植、骨髓移植及用于器官移植、骨髓移植及HIV阳性阳性/AIDS患者人巨细胞病毒感染的辅助诊断患者
17、人巨细胞病毒感染的辅助诊断和疗效监控。和疗效监控。l临床上可以采用的标本类型：尿液、乳临床上可以采用的标本类型：尿液、乳汁、血清、血浆或淋巴细胞样本中人巨汁、血清、血浆或淋巴细胞样本中人巨细胞病毒细胞病毒DNA。人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取血清或血浆的提取血清或血浆100l血清血清或血浆或血浆100l DNA浓浓缩液缩液去除上清去除上清液，保管液，保管沉淀沉淀12000rpm，10min人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取血清或血浆的提取血清或血浆参与参与50lDNA提提取液取液猛烈振荡猛烈振
18、荡混匀混匀5-10s100加热加热10min人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取血清或血浆的提取血清或血浆4放放置或用置或用于于PCR振荡混匀振荡混匀510s12000rpm，5min人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取尿液和乳汁的提取尿液和乳汁1ml尿液尿液或乳汁或乳汁去除上清去除上清液，保管液，保管沉淀沉淀12000rpm，5min人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取尿液和乳汁的提取尿液和乳汁参与参与50lDNA提提取液取液猛烈振荡猛烈振荡混匀混匀
19、5-10s100加热加热10min人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l巨细胞病毒巨细胞病毒DNA的提取尿液和乳汁的提取尿液和乳汁4放放置或用置或用于于PCR振荡混匀振荡混匀510s12000rpm，5min人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取淋巴细胞的提取的提取淋巴细胞的提取l 1ml抗抗凝全血凝全血1ml生生理盐水理盐水0.3ml淋巴淋巴细胞分别液细胞分别液人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取淋巴细胞的提取的提取淋巴细胞的提取程度离心机程度离心机2500rpm，15min淋
20、巴细胞层淋巴细胞层汲取淋巴汲取淋巴细胞悬液细胞悬液人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取淋巴细胞的提取的提取淋巴细胞的提取淋巴细胞淋巴细胞悬液悬液去除上清去除上清液，保管液，保管沉淀沉淀12000rpm，5min人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA定量检测试剂盒定量检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取淋巴细胞的提取的提取淋巴细胞的提取参与参与50lDNA提提取液取液猛烈振荡猛烈振荡混匀混匀5-10s100加热加热10min人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA检测试剂盒检测试剂盒l人巨细胞病毒人巨细胞病毒DNA的提取淋巴细胞的提取的提取淋巴细胞的
21、提取4放放置或用置或用于于PCR振荡混匀振荡混匀510s12000rpm，5min荧光定量荧光定量PCR扩增过程扩增过程50942min5min9315s5730sStage1Stage2Stage345 1 1251minStage4 1DNA浓缩液的作用浓缩液的作用lDNA浓缩液的成分：浓缩液的成分：PEG6000、NaCllPEG聚乙二醇的作用：聚乙二醇的作用：PEG与自在水分子与自在水分子结合，同时蛋白质外表的水化膜被夺走，与水结合，同时蛋白质外表的水化膜被夺走，与水分子结合的极性集团转而与多聚物的氧原子或分子结合的极性集团转而与多聚物的氧原子或者氢氧根结合，构成蛋白质与多聚物的复合体
22、，者氢氧根结合，构成蛋白质与多聚物的复合体，从溶液中沉淀析出。提高低浓度标本的检出率。从溶液中沉淀析出。提高低浓度标本的检出率。lPEG的浓度与沉淀出的的浓度与沉淀出的DNA片段大小成反比。片段大小成反比。 DNA浓缩液的作用浓缩液的作用lNaCl的作用：在细胞内的作用：在细胞内DNA与蛋白质结合成脱与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白氧核糖核蛋白DNP ，而，而RNA与蛋白质结合成为与蛋白质结合成为核糖核蛋白核糖核蛋白RNP,在不同盐浓度中二者溶解度不在不同盐浓度中二者溶解度不一样。一样。lDNP在纯水或者在纯水或者12M的的Nacl溶解度较大，在溶解度较大，在0.14M溶解度较低，而溶解度较低，而
23、0.14M中中RNP溶解度较大，溶解度较大，因此利用因此利用0.14M可分别可分别RNP和和DNP。 DNA提取液的作用提取液的作用lDNA提取液的主要成分：提取液的主要成分：l NP-40 l TritonX-100l Chelex-100l EDTA(pH8.0) l Tris-HCl (pH 8.0) l NaOH 乙基苯基聚乙二醇很温暖的去垢剂，乙基苯基聚乙二醇很温暖的去垢剂，1%浓度的根本可以破浓度的根本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱 聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚 一种非离子性去垢剂，一种非离子性去垢剂，被用来做细胞破膜剂被用来做细胞破膜剂
24、/细胞通透剂细胞通透剂 聚苯乙烯二乙烯基苯提取聚苯乙烯二乙烯基苯提取DNA过程中，过程中，Chelex100能有效除去非核酸有机物能有效除去非核酸有机物螯合螯合Mg、Ca等二价金属离子，抑制依赖金属离等二价金属离子，抑制依赖金属离子的脱氧核糖核酸酶对子的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用的降解作用 三羟甲基氨基甲烷与盐三羟甲基氨基甲烷与盐酸按比例混合后构成的一种酸按比例混合后构成的一种缓冲液体系，缓冲液体系，DNA在这一在这一体系中呈稳定态体系中呈稳定态核酸在pH59是稳定的，pH12/3会引起双链之间氢键解离而变性淋巴细胞分别液的作用淋巴细胞分别液的作用l人外周血中各种细胞的密度不同，红细胞为
25、人外周血中各种细胞的密度不同，红细胞为1.093，粒细胞为，粒细胞为1.092，淋巴细胞为，淋巴细胞为1.0740.001。l淋巴细胞分别液密度为淋巴细胞分别液密度为1.0771.080g/ml，密度，密度梯度离心法原理是根据各类血细胞比重的差别，梯度离心法原理是根据各类血细胞比重的差别，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分别液对利用比重介于某两类细胞之间的细胞分别液对血液进展离心，使血细胞按照相应的密度梯度血液进展离心，使血细胞按照相应的密度梯度分布于不同的位置，从而到达分别的效果。分布于不同的位置，从而到达分别的效果。？问？题？问？题？lPCR的中文称号，普通包括哪几个反响过程？的中文称号，普通包括哪几个反响过程？l在在PCR中我们常用到的酶是什么？有什么优点？中我们常用到的酶是什么？有什么优点？l荧光共振能量转移的原理？荧光共振能量转移的原理？l有效防止和消除气溶胶污染的方法？有效防止和消除气溶胶污染的方法？l在临床血液标本采集中哪种抗凝剂不能运用？在临床血液标本采集中哪种抗凝剂不能运用？l淋巴细胞分别液的作用原理？淋巴细胞分别液的作用原理？
