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1、噻托溴铵对哮喘模型小鼠气道噻托溴铵对哮喘模型小鼠气道炎症与气道重塑的治疗作用炎症与气道重塑的治疗作用Effect of tiotropium bromide on airway inflammation and remodeling in a mouse model of asthma From：Clinical and Experimental Allergy前前 言言 支气管哮喘是一种有支气管哮喘是一种有嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞，肥大细胞肥大细胞和和T T淋巴细胞淋巴细胞等多种炎性细胞参等多种炎性细胞参与的以气道与的以气道慢性炎症慢性炎症为特征的疾病。这种为特征的疾病。这种气道炎症是易感者
2、对各种激发因子具有气气道炎症是易感者对各种激发因子具有气道反应性，并可引起气道狭窄，表现为反道反应性，并可引起气道狭窄，表现为反复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽复发作性的喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽等症状。其存在的病因等症状。其存在的病因杂而多杂而多，包括遗传，包括遗传的、环境的、药物的、精神的等等。的、环境的、药物的、精神的等等。前前 言言哮喘的发病机制归结为四种：哮喘的发病机制归结为四种：变态反应变态反应气道炎症气道炎症 气道高反应性气道高反应性 神经机制神经机制内内 容容 研究背景研究背景1材料方法材料方法2实验结果实验结果3讨讨 论论4研究背景研究背景一、哮喘特征：一、哮喘特征：气流
3、阻塞气流阻塞 气道炎症性气道炎症性气道高反应性气道高反应性 二、炎症细胞：二、炎症细胞：肥大细胞肥大细胞 淋巴细胞淋巴细胞嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞研究背景研究背景一、哮喘的典型活性介质：一、哮喘的典型活性介质：IL4 IL4 IL5IL5IL13IL13 IFNIFNTGFTGF二、活性介质与哮喘的关系：二、活性介质与哮喘的关系：与与Th1Th1细胞的关系细胞的关系 与与Th2Th2细胞的关系细胞的关系与嗜酸性粒细胞（与嗜酸性粒细胞（EOSEOS）的关系）的关系 研究背景研究背景 噻托溴铵噻托溴铵( ( 商品名商品名思立华思立华) ) 是目前世界上是目前世界上推崇的新型推崇的新型抗胆碱能药物抗
4、胆碱能药物，它是一种季铵类，它是一种季铵类抗胆碱能类支气管扩张剂，对支气管扩张作抗胆碱能类支气管扩张剂，对支气管扩张作用可持续用可持续24 24 小时，明显改善喘鸣及气促的症小时，明显改善喘鸣及气促的症状，显著提高肺功能。状，显著提高肺功能。 因而，本实验的因而，本实验的目的目的是评估噻托溴铵是是评估噻托溴铵是否可以抑制哮喘模型小鼠变态反应导致的急否可以抑制哮喘模型小鼠变态反应导致的急性与慢性气道炎症、性与慢性气道炎症、Th2Th2类型细胞因子产生以类型细胞因子产生以及气道重塑。及气道重塑。实验材料与方法实验材料与方法实验动物：实验动物：BALB / cBALB / c小鼠、雌性、小鼠、雌性、
5、6-86-8周、周、 重量重量19-24 g19-24 g试试 剂：卵清蛋白（剂：卵清蛋白（OVAOVA）SigmaSigma 噻托溴铵噻托溴铵BoehringerBoehringer IngelheimIngelheim 4- 4-二苯乙酰氧基二苯乙酰氧基-N-N-甲基甲基- -哌啶甲碘哌啶甲碘 化物（化物（4-DAMP4-DAMP） BoehringerBoehringer IngelheimIngelheim实验流程图实验流程图检测指标检测指标动物造模动物造模记录并分记录并分析结果析结果 给药给药 BALFBALF肺病肺病理理气道气道反应反应离体离体细胞细胞PBMCsPBMCs急性和慢性
6、气道炎症小鼠模型的建立急性和慢性气道炎症小鼠模型的建立Day 0Day 12Day 0Day 12 Day 21-23Day 23-26 Day21-63 50 g/mouse OVA i.p. 0.1mM (50 g/mL) Inhalation for 3 min/mouse 2.5% OVA inhalation for 20 min/mouse 气道反应的测量气道反应的测量操作流程：麻醉小鼠操作流程：麻醉小鼠 插管插管 装箱装箱测测 量量 记录结果记录结果计算公式：计算公式：( (吸入吸入5 5 -羟色胺后的气道阻力羟色胺后的气道阻力/ 吸入前的气道阻力吸入前的气道阻力) ) 100%
7、 100% 支气管肺泡灌洗和细胞的分析支气管肺泡灌洗和细胞的分析 操作流程：处死动物操作流程：处死动物 钝性分离气钝性分离气管管 固定气管固定气管 生理盐水冲洗生理盐水冲洗 收集收集BALF BALF 冰块保存冰块保存 离心收集细胞离心收集细胞 细胞细胞冲洗与悬浮冲洗与悬浮 细胞计数细胞计数 细胞分类细胞分类肺组织病理分析肺组织病理分析 操作流程：提取操作流程：提取BALFBALF后后 打开胸腔打开胸腔 剪取肺组织剪取肺组织 PBSPBS浸泡过夜浸泡过夜 乙醇脱乙醇脱 水水 包蜡包蜡 染色显微镜观察染色显微镜观察 分析指分析指 标标上皮细胞增生、气道平滑肌增生、上皮细胞增生、气道平滑肌增生、
8、胶原纤维沉积、胶原纤维沉积、M3M3受体受体脾细胞因子的测量脾细胞因子的测量操作流程：分离脾细胞操作流程：分离脾细胞 悬浮培养悬浮培养 添添加噻托溴铵加噻托溴铵 OVAOVA（100 100 g/mLg/mL)刺激刺激获取培养上清液获取培养上清液 测量细胞因子测量细胞因子培养液成分：培养液成分：RPMI 1640RPMI 1640、胎儿牛血清和、胎儿牛血清和 抗生素抗生素细胞悬浮浓度：细胞悬浮浓度：4.04.010106 6 个个/mL./mL.人类外周血单核细胞因子的测量人类外周血单核细胞因子的测量操作流程：获取患者全血操作流程：获取患者全血 分离分离PBMCPBMC 细胞培养细胞培养 植物
9、血凝素（植物血凝素（PHAPHA）激发）激发噻托溴铵治疗噻托溴铵治疗 获取细胞培养液上清获取细胞培养液上清 ELISAELISA测量测量IL5IL5与与IL13IL13分离方法：运用淋巴细胞分离器采取分离方法：运用淋巴细胞分离器采取密度密度梯度离心法梯度离心法细胞因子的测量细胞因子的测量操作方法：酶联免疫吸附测定操作方法：酶联免疫吸附测定法法 （ELISAELISA法）法）检测样品：检测样品：BALFBALF与细胞培养上清与细胞培养上清 因子种类：因子种类：IL4IL4、IL5IL5、IL13IL13、 IFNIFN、TGFTGF1 1实验结果实验结果一、对气道一、对气道炎症反应炎症反应的影响
10、的影响 噻托溴铵能有效地防止变态反应导致噻托溴铵能有效地防止变态反应导致 的的急性炎症反应急性炎症反应 噻托溴铵能同样有效地抑制噻托溴铵能同样有效地抑制慢性慢性哮喘哮喘 模型小鼠的炎症反应模型小鼠的炎症反应实验结果实验结果二、对支气管肺泡灌洗液中二、对支气管肺泡灌洗液中Th2Th2类型类型细细 胞因子胞因子水平的影响水平的影响 选取并被测量的细胞因子是选取并被测量的细胞因子是IL4IL4、ILIL5 5与与IL13IL13，这三者与哮喘的发生和发展有着，这三者与哮喘的发生和发展有着密切的关系。同时，慢性模型还考虑了密切的关系。同时，慢性模型还考虑了TGF-TGF-1 1，然而，噻托溴铵对模型小
11、鼠中，然而，噻托溴铵对模型小鼠中IgEIgE的含的含量影响不大。量影响不大。实验结果实验结果三、对三、对气道重塑气道重塑的作用的作用 气道重塑涉及到气道重塑涉及到上皮细胞增生上皮细胞增生、嗜酸性嗜酸性粒细胞募集粒细胞募集、 - -肌动蛋白增多肌动蛋白增多、气道纤维气道纤维化化等病理改变，因而，可以从这几项指标检等病理改变，因而，可以从这几项指标检测噻托溴铵对气道重塑的改善作用。同时测噻托溴铵对气道重塑的改善作用。同时由由于于M3M3受体受体的发现，为阐明其作用机制提供可的发现，为阐明其作用机制提供可能的依据。能的依据。实验结果实验结果四、慢性哮喘模型小鼠四、慢性哮喘模型小鼠气道高反应性气道高反
12、应性 气道高反应性是哮喘的典型特征，尤其气道高反应性是哮喘的典型特征，尤其在慢性哮喘中表现明显，这可通过测量在慢性哮喘中表现明显，这可通过测量气道气道阻力阻力来反映是否具有气道高反应性。来反映是否具有气道高反应性。实验结果实验结果五、对五、对脾细胞因子脾细胞因子的含量的影响的含量的影响由于在由于在BALFBALF中已证实体内噻托溴铵对中已证实体内噻托溴铵对细胞因子的抑制作用，因而需进一步证明在细胞因子的抑制作用，因而需进一步证明在体外其对体外其对细胞细胞的直接作用。通过脾细胞离的直接作用。通过脾细胞离体培养，再测量特定细胞因子的含量从而确体培养，再测量特定细胞因子的含量从而确定其体外活性。同时
13、也验证了定其体外活性。同时也验证了DAMPDAMP的的作用。作用。实验结果实验结果六、对患者六、对患者外周血单核细胞因子外周血单核细胞因子 的含量的影响的含量的影响 选取哮喘典型的选取哮喘典型的细胞因子细胞因子IL5IL5与与IL13IL13，从临床患者，从临床患者的角度直接考的角度直接考察噻托溴铵的治疗作用。察噻托溴铵的治疗作用。讨讨 论论一、改善气道重塑的可能作用机制一、改善气道重塑的可能作用机制 实验结果已证实噻托溴铵能抑制急性与慢性气道炎实验结果已证实噻托溴铵能抑制急性与慢性气道炎症、降低症、降低Th2Th2类型细胞因子水平，而类型细胞因子水平，而Th2Th2类型细胞因子类型细胞因子能
14、直接诱导上皮细胞增生，同时，上皮细胞增生是气能直接诱导上皮细胞增生，同时，上皮细胞增生是气道重塑的重要因素，因而其改善气道重塑可能与其抑道重塑的重要因素，因而其改善气道重塑可能与其抑制制T T细胞分泌细胞分泌Th2Th2类型细胞因子有一定的关联。类型细胞因子有一定的关联。 另外，另外，TGF-TGF- 能诱导成纤维细胞增殖、分化以及肌能诱导成纤维细胞增殖、分化以及肌纤维母细胞外基质蛋白的合成、粘蛋白的形成。因此纤维母细胞外基质蛋白的合成、粘蛋白的形成。因此, ,降低降低TGF-TGF-11的生成，也可能与噻托溴铵改善气道重塑的生成，也可能与噻托溴铵改善气道重塑有直接或间接的关系。有直接或间接的
15、关系。 讨讨 论论二、二、对对Th2Th2类型细胞因子可能作用机制类型细胞因子可能作用机制 体内与体外实验已证实噻托溴铵对体内与体外实验已证实噻托溴铵对IL5IL5、IL13IL13与与IFNIFN具有直接抑制作用，但具有直接抑制作用，但IL4IL4的体内体外实验的体内体外实验却有明显的区别，这表明其并非直接作用于却有明显的区别，这表明其并非直接作用于IL4IL4，而，而IL4IL4在哮喘发生发展中具有重要的调控作用，因而需在哮喘发生发展中具有重要的调控作用，因而需要进一步研究其对要进一步研究其对IL4IL4的作用机制。的作用机制。 另外，血浆中另外，血浆中IgEIgE浓度变化实验已证实噻托溴
16、铵的浓度变化实验已证实噻托溴铵的抗炎作用只局限于气道，并非全身。还有抗炎作用只局限于气道，并非全身。还有乙酰胆碱乙酰胆碱能能促进细胞因子的产生，但体外实验是在缺乏乙酰胆碱促进细胞因子的产生，但体外实验是在缺乏乙酰胆碱下进行的，这表明抑制下进行的，这表明抑制T T细胞信号传导并不只局限于细胞信号传导并不只局限于拮抗受体作用。拮抗受体作用。讨讨 论论三、三、与与M3M3受体的受体的作用作用 实验已证实模型小鼠的实验已证实模型小鼠的M3M3受体受体出现在气道平滑肌出现在气道平滑肌细胞、炎症细胞、上皮细胞以及嗜酸性粒细胞上，由细胞、炎症细胞、上皮细胞以及嗜酸性粒细胞上，由于于M3M3受体受体的辅助，噻
17、托溴铵对气道炎症具有广谱作用，的辅助，噻托溴铵对气道炎症具有广谱作用，因此，这促使我们去研究噻托溴铵治疗作用的因此，这促使我们去研究噻托溴铵治疗作用的最初靶最初靶点点。 同时，内源性的乙酰胆碱在气道炎症与气道重塑的同时，内源性的乙酰胆碱在气道炎症与气道重塑的发生与发展发挥重要的作用，这表明噻托溴铵的治疗发生与发展发挥重要的作用，这表明噻托溴铵的治疗作用与作用与胆碱途径胆碱途径（经（经M3M3受体激活受体激活T T细胞）密切相关，细胞）密切相关，但这并非唯一，可能还与但这并非唯一，可能还与JAK-STATJAK-STAT途径以及途径以及NF-BNF-B信信号通路等因素有关，这还需进一步研究与论证。号通路等因素有关，这还需进一步研究与论证。
