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1、第第三三章章 减毒活疫苗减毒活疫苗1第一个用于人体的减毒活疫苗第一个用于人体的减毒活疫苗19021902年，从患年，从患结核病的牛乳房里分离得到一核病的牛乳房里分离得到一株牛型株牛型结核杆菌核杆菌；CalmetteCalmette和和GuerinGuerin将此菌接种于将此菌接种于5%5%甘油胆汁甘油胆汁马铃薯培养基，薯培养基，进行行传代培养；代培养；每隔每隔2-32-3周周传代一次，代一次，经过230230余代，余代，历时1313年，年，终于制于制备出出减毒活疫苗减毒活疫苗卡介苗卡介苗(bacille(bacilleCalmette-GuerinCalmette-Guerin，BCG)BCG
2、)。2第一第一节减毒活疫苗的原理与减毒活疫苗的原理与现状状3一、一、减毒活疫苗的原理减毒活疫苗的原理 减毒活疫苗减毒活疫苗模模拟自然自然发生的感染后免疫生的感染后免疫过程。程。全身性感染全身性感染（病毒性病毒性/细菌性感染细菌性感染）临床感染临床感染或或亚临床感染亚临床感染(隐性感染隐性感染)持久性的持久性的免疫力免疫力临临床床现现象象41. 定定义减毒活疫苗减毒活疫苗通通过不同的方法手段不同的方法手段使使病原体的病原体的毒力毒力(致病性致病性)减弱减弱或或丧失失后后获得的一种得的一种 的疫苗制的疫苗制品品。由完整的微生物组成由完整的微生物组成52. 减毒活疫苗减毒活疫苗的特点的特点能能引引发
3、机体感染机体感染、但但不不发生生临床症状床症状其免疫原性其免疫原性足以足以能刺激机体的免疫系能刺激机体的免疫系统、产生生针对该病原体的免疫反病原体的免疫反应在以后暴露于在以后暴露于该病原体病原体时，能，能保保护机体机体不患不患病或减病或减轻临床床过程。程。6二、二、减毒活疫苗的使用减毒活疫苗的使用和研究和研究现状状1.1.使用使用现状状有的已完成有的已完成历史任史任务而退役而退役牛痘苗牛痘苗有的已有的已经并正在并正在继续发挥其良好的防病作用其良好的防病作用脊髓灰脊髓灰质炎、麻疹、甲型肝炎减毒活疫苗炎、麻疹、甲型肝炎减毒活疫苗有的在有的在长期使用后又面期使用后又面临新的挑新的挑战卡介苗卡介苗有的
4、在我国使用有的在我国使用时间不不长，尚待，尚待积累功累功绩水痘减毒活疫苗水痘减毒活疫苗72.2.传统减毒活疫苗的局限与不足减毒活疫苗的局限与不足无法无法或或很很难用用传统技技术研制疫苗研制疫苗不能培养或不能培养或难以培养的病原体以培养的病原体有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体保保护效果差、副反效果差、副反应大或使用不方便大或使用不方便解决办法：解决办法：使用基因工程技术对其进使用基因工程技术对其进行改造或取而代之行改造或取而代之83. 国内外使用的减毒活疫苗一国内外使用的减毒活疫苗一览表表分类分类名称名称接种途径接种途径国内使用国内使用国外使用国外使用病毒疫苗
5、病毒疫苗甲型肝炎减毒活疫苗甲型肝炎减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十麻疹减毒活疫苗麻疹减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十腮腺炎减毒活疫苗腮腺炎减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十黄热减毒活疫苗黄热减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十脊髓灰质炎减毒活疫苗脊髓灰质炎减毒活疫苗口服口服十十十十乙型脑炎活疫苗乙型脑炎活疫苗皮下注射皮下注射十十风疹减毒活疫苗风疹减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十水痘减毒活疫苗水痘减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十十十登革热减毒活疫苗登革热减毒活疫苗皮下注射皮下注射十十流感减毒活疫苗流感减毒活疫苗喷雾喷雾十十腺病毒减毒活疫苗腺病毒减毒活疫苗肌内注射肌内注射十十细菌疫苗菌疫苗炭疽减毒活
6、疫苗炭疽减毒活疫苗皮上划痕皮上划痕十十十十布氏菌减毒活疫苗布氏菌减毒活疫苗皮上划痕皮上划痕十十十十卡介苗卡介苗皮内注射皮内注射十十十十伤寒减毒活疫苗伤寒减毒活疫苗口服口服十十霍乱减毒活疫苗霍乱减毒活疫苗口服口服十十鼠疫减毒活疫苗鼠疫减毒活疫苗皮上划痕皮上划痕 十十十十9三、三、减毒活疫苗的研究策略减毒活疫苗的研究策略 选择标准的疫苗株准的疫苗株;新的新的抗原抗原结构构能能诱导广泛广泛的中和抗体的中和抗体;诱导在在多多样主要主要组织相容复合体相容复合体(major histocompatibility complex， MHC)背景人背景人群的多位点的群的多位点的CTL应答答;直接和直接和间接地
7、接地诱导传播途径播途径的黏膜免疫的黏膜免疫应答答101.病原体病原体的的培养培养 如何如何减毒减毒？体外体外细胞培养胞培养低温培养低温培养传代以代以产生冷适生冷适应株株在特定温度下在特定温度下选育温度敏感株育温度敏感株动物体内分段或物体内分段或连续传代代111.病原体病原体的的培养培养 如何如何筛选？蚀斑法挑斑法挑选（产生生细胞病胞病变效效应的病毒的病毒）同一病毒同一病毒：蚀斑斑较大的大的：毒力相毒力相对强蚀斑小的斑小的：毒力毒力较弱弱其减毒性在人体中其减毒性在人体中必必须是是稳定定的的减毒减毒与与免疫原性之免疫原性之间的的平衡平衡减毒适度减毒适度：保保证人体使用安全人体使用安全良好免疫原性良
8、好免疫原性：足以足以诱生特异性免疫生特异性免疫应答答致细胞病变效应致细胞病变效应 (cytopathogenic effect，CPE ) 培养的单层细胞培养的单层细胞、接种病毒后接种病毒后导致细胞的萎缩、脱落等病变的导致细胞的萎缩、脱落等病变的现象。现象。12第一代减毒第一代减毒变异株异株12-1-7原代地鼠肾细胞原代地鼠肾细胞(PHK)连续传代连续传代：100代代SA14SA14-14-2/ PDK例：例：乙型脑炎减毒活疫苗乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株株乳鼠体乳鼠体内传代内传代SA14-14-2/ PHK蚀斑克隆蚀斑克隆病毒株病毒株SA14-5-3PHK细胞细胞性状不性状不稳定定
9、神神经毒力返祖毒力返祖减毒减毒过度，免度，免疫原性不足疫原性不足PHK细胞细胞恢复一定的免恢复一定的免疫原性疫原性蚀斑克隆蚀斑克隆原代狗肾细原代狗肾细胞胞(PDK) 传传9代代减毒减毒与与免疫原免疫原性性达到平衡达到平衡132. 减毒的策略减毒的策略传统传统方法：方法：细胞传代细胞传代动物传代动物传代蚀斑挑选蚀斑挑选化学诱变化学诱变营养突变等营养突变等现代方法：现代方法：应用基因工程技术应用基因工程技术，删删除致病基因除致病基因病原体病原体减毒更彻底减毒更彻底遗传性能遗传性能更稳定更稳定安全性和免疫原性安全性和免疫原性更平衡。更平衡。14四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的
10、构建策略1.1.基因缺基因缺失失活疫苗活疫苗(gene deleted live vaccine)将将与毒力有关的基因或基因片段与毒力有关的基因或基因片段删除，从而除，从而获得缺失突得缺失突变毒株毒株优点点：突突变性状明确性状明确稳定、不易定、不易发生毒力返祖生毒力返祖15四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略1.1.基因缺基因缺失失活疫苗活疫苗(gene deleted live vaccine)DNA病毒病毒去除毒力基因的去除毒力基因的腺病毒腺病毒，可用作减毒活疫苗株，可用作减毒活疫苗株，也可作也可作为载体疫苗的病毒体疫苗的病毒载体。体。RNA病毒病毒16四、四、
11、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略2. 遗传重重组疫苗疫苗(genetic recombinant vaccine)通通过强、弱毒株共同感染弱毒株共同感染细胞胞，二者，二者之之间进行基因片段的交行基因片段的交换，而而获得的减毒活疫苗。得的减毒活疫苗。特点：特点：很大的很大的盲目性盲目性，致使，致使筛选特定的特定的遗传重重组病毒比病毒比较困困难。17四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略2. 遗传重重组疫苗疫苗(genetic recombinant vaccine)反向反向遗传技技术的的发展，可以展，可以对分分节段的段的RNA病毒病毒进行行定向重
12、配定向重配，提高重配效率提高重配效率。研究研究热点：点：甲型流感病毒、甲型流感病毒、轮状病毒和状病毒和汉坦病毒等减毒活疫坦病毒等减毒活疫苗株。苗株。18四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略3.3.载体疫苗体疫苗(vector vaccine)利用非致病微生物作利用非致病微生物作为载体体、递呈外源抗原呈外源抗原的一种减毒疫苗的一种减毒疫苗。将将外源抗原外源抗原的的基因插入到基因插入到载体微生物基因体微生物基因组中，用中，用这种种表达外源抗原的微生物作表达外源抗原的微生物作为疫苗疫苗。19四、四、基因工程减毒活疫苗的构建策略基因工程减毒活疫苗的构建策略病毒载体疫苗病毒载
13、体疫苗痘苗病毒痘苗病毒腺病毒腺病毒麻麻疹疹病毒病毒脊髓灰质炎病毒等脊髓灰质炎病毒等细菌载体疫苗细菌载体疫苗产单核细胞李斯特菌产单核细胞李斯特菌沙门菌沙门菌霍乱弧菌霍乱弧菌志贺菌志贺菌卡介苗卡介苗小肠耶尔森菌小肠耶尔森菌炭疽杆菌炭疽杆菌戈登菌属戈登菌属乳杆菌属乳杆菌属葡萄球菌属等葡萄球菌属等载体疫苗载体疫苗(vector vaccine)成本低成本低适适于于群体免疫群体免疫20五、五、减毒活疫苗研究面减毒活疫苗研究面临的的问题 1. 安全性安全性成功或比成功或比较成功的成功的预防性疫苗防性疫苗牛痘苗、脊髓灰牛痘苗、脊髓灰质炎、麻疹炎、麻疹、甲型肝炎、乙型甲型肝炎、乙型脑炎等减毒活疫苗炎等减毒活疫
14、苗不太成功的疫苗：不太成功的疫苗：卡介苗卡介苗半个多世半个多世纪、40余余亿人群使用人群使用对肺肺结核的核的免疫保免疫保护效果效果：差异甚大差异甚大(0-80%)迄今尚没有一个国家或地区有消迄今尚没有一个国家或地区有消灭结核的可能核的可能性性改造研究改造研究是是热点点21五、五、减毒活疫苗研究面减毒活疫苗研究面临的的问题 2.安全性和免疫原安全性和免疫原性之性之间的的协调难题Ty21a口服口服伤寒减毒活疫苗寒减毒活疫苗最最成功成功的的营养缺陷型突养缺陷型突变营养缺陷型突变营养缺陷型突变人结核菌人结核菌H37Rv 亮氨酸缺陷株亮氨酸缺陷株残余毒力残余毒力指数指数过高高22五、五、减毒活疫苗研究面
15、减毒活疫苗研究面临的的问题 2.安全性和免疫原安全性和免疫原性之性之间的的协调难题霍乱减毒活疫苗霍乱减毒活疫苗：基因缺失株基因缺失株CVD112：保保护率率：84%6名志愿者中名志愿者中：引起引起3人人轻度腹泻度腹泻CVD-103 HgR株株：对不同人群不同人群诱导 抗体抗体应答答悬殊殊免疫原性免疫原性不恒定不恒定23五、五、减毒活疫苗研究面减毒活疫苗研究面临的的问题 3. 载体疫苗体疫苗研究中存在的研究中存在的问题载体微生物蛋白的体微生物蛋白的过量表达量表达，严重干重干扰欲表达抗欲表达抗原原诱导机体免疫机体免疫应答答;非复制型非复制型载体微生物体微生物（如禽如禽痘痘病毒病毒）的）的减弱或消减
16、弱或消失，失，导致致目的目的抗原表达量降低抗原表达量降低，影响疫苗免疫原影响疫苗免疫原性性;目的抗原微生物和目的抗原微生物和载体微生物体微生物感染途径感染途径不一定相不一定相同同，而致使目的抗原不能而致使目的抗原不能经自然感染途径免疫，自然感染途径免疫，从而影响免疫效果。从而影响免疫效果。24第二第二节 减毒活疫苗减毒活疫苗设计与制与制备的技的技术要要求求25一、减毒活疫苗一、减毒活疫苗的的设计要求要求设计减毒活疫苗菌株或毒株减毒活疫苗菌株或毒株，要，要根据根据生物制生物制品的用途、使用范品的用途、使用范围、使用方式、生、使用方式、生产过程和生程和生产条件条件等因素来决定，等因素来决定，设计时
17、应注注意以下意以下问题：安全性安全性免疫原性免疫原性遗传稳定性定性生生产适适应性性261.安全性安全性残余毒力残余毒力残余毒力高残余毒力高：免疫原性免疫原性： 临床反床反应：残余毒力低残余毒力低：免疫原性免疫原性：临床反床反应：所所选用的菌、毒种必用的菌、毒种必须在减毒性能和免疫原在减毒性能和免疫原性之性之间达到达到平衡平衡好好大大差差小小271.安全性安全性致癌性致癌性菌、毒种及代谢菌、毒种及代谢物质物质：不应有致癌作用不应有致癌作用;传代细胞系传代细胞系：在在规定代次内使规定代次内使用，有效用，有效去去除细除细胞胞DNA，残余，残余DNA需需达达标标;诱变及筛选菌诱变及筛选菌/毒株毒株：不
18、用致癌性的药物不用致癌性的药物;载体疫苗载体疫苗：载体是无毒或减毒载体是无毒或减毒的的外源基因插入时，外源基因插入时，不应引起毒力的返不应引起毒力的返祖。祖。282. 良好的免疫原性良好的免疫原性能促使机体能促使机体产生生：高效价的保高效价的保护性抗体性抗体黏膜免疫黏膜免疫细胞介胞介导免疫免疫并具有良好的并具有良好的免疫持久性免疫持久性293. 遗传稳定性定性弱毒株弱毒株的来源？的来源？天然弱毒天然弱毒采用物理、化学和生物学方法将毒力采用物理、化学和生物学方法将毒力较强的菌毒株的菌毒株诱变为弱毒株弱毒株只有只有选择突突变遗传性能性能稳定定的菌毒株，才能最大的菌毒株，才能最大限度地限度地防止防止
19、其使用其使用过程中程中毒力返祖毒力返祖的可能。的可能。304. 生生产适适应性性易于培养易于培养便于便于规模化生模化生产有利于生有利于生产工工艺流程流程的可操作性和的可操作性和简化化有利于保有利于保证产品的品的产量和量和质量量。31二、减毒活疫苗制二、减毒活疫苗制备技技术要求要求 1.1.基本要求基本要求设施与生施与生产质量管理量管理中国中国药品生品生产质量管理量管理规范范原、原、辅料料:中中华人民共和国人民共和国药典典、中国生物、中国生物制品主要原制品主要原辅材料材料质控控标准准纯化水和注射用水化水和注射用水： 中中华人民共和国人民共和国药典典 生生产用器具用器具:必必须清洗干清洗干净、灭菌
20、菌处理。理。生生产及及检定用定用动物物:鸡胚胚细胞的来源胞的来源鸡群群：SPF级提供提供肾脏的家兔、的家兔、狲猴猴：隔离隔离检疫合格疫合格小鼠、地鼠、豚鼠小鼠、地鼠、豚鼠：清清洁级32二、减毒活疫苗制二、减毒活疫苗制备技技术要求要求 2. 菌、毒种菌、毒种国家国家药品管理局品管理局批准批准由由国家国家药品品检定机构定机构或或国家国家药品管理局品管理局所所委委托的托的单位位保存、保存、检定及分定及分发。33二、减毒活疫苗制二、减毒活疫苗制备技技术要求要求 菌、毒种菌、毒种的的三三级管理管理：定期全面检定定期全面检定原始种子批原始种子批应验明其明其记录、历史、来源和生物学特性。史、来源和生物学特性
21、。主种子批主种子批从原始种子批从原始种子批传出、出、扩增后增后冻干或深低温保存的。干或深低温保存的。工作种子批工作种子批从主种子批制从主种子批制备，用于生，用于生产。主种子批和工作种子批在主种子批和工作种子批在规定代次内定代次内的生物学的生物学特性特性应与原始种子批一致与原始种子批一致343. 细菌性菌性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术要求要求 (1)培养基的制备培养基的制备菌种用菌种用培养基培养基疫苗生产用疫苗生产用培养基培养基检定用检定用培养基等培养基等(2)菌种培养菌种培养不同细菌不同细菌，要求不同：，要求不同：培养基培养基培养温度培养温度培养时间培养时间菌落形态菌落形态、颜色等颜色等严
22、格按照中国生物制品规程严格按照中国生物制品规程353. 细菌性菌性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术要求要求 (3)原液制原液制备液体培养基液体培养基：收集菌膜，收集菌膜，经洗洗涤、离心、离心、压干干等不同等不同处理步理步骤后，加后，加 适量保适量保护液制成所需液制成所需浓度的原液。度的原液。固体培养基固体培养基：将将菌苔刮入保菌苔刮入保护液，或用保液，或用保护液液洗下菌苔制洗下菌苔制备原液。原液。(4)分装、包装。分装、包装。 严格按照中国生物制品规程严格按照中国生物制品规程363. 细菌性菌性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术要求要求 (5)检定定对菌种、原液、半成品和成品菌种、原液、半成品和
23、成品进行行检定定保保证疫苗的疫苗的安全性和免疫原性安全性和免疫原性等等质量量标准准符符合合中国生物制品中国生物制品规程程严格按照中国生物制品规程严格按照中国生物制品规程37检定检定什么？什么？纯菌菌试验:生生长物做涂片物做涂片镜检，不得有，不得有杂菌。菌。噬菌体特异性噬菌体特异性试验:特异噬菌体特异噬菌体应能完全裂解待能完全裂解待检细菌，培养后菌，培养后应无无细菌生菌生长。菌落、菌形菌落、菌形检查: 应具有典型的菌落特征具有典型的菌落特征涂片涂片镜检：培养典型形培养典型形态特殊染色法特殊染色法：形形态学学鉴别38检定检定内容内容活菌数活菌数测定定:一定温度一定温度、时间培后，培后，单位体位体积
24、的的活活菌数菌数必必须在在规定范定范围内。内。浓度度测定定:按按中国中国细菌菌浊度度标准准测定定浓度。度。毒力毒力试验:一定量的菌种培养物分一定量的菌种培养物分别注射小白鼠或豚鼠，注射小白鼠或豚鼠，要求要求：实验动物存活物存活体重增加体重增加39检定检定内容内容效力或免疫力效力或免疫力试验:制制备菌液，注射小鼠、豚鼠等菌液，注射小鼠、豚鼠等实验动物物一般免疫两次一般免疫两次末次免疫后末次免疫后，用用野型株野型株进行攻行攻击一般一般应保保护50%80%的的动物存活。物存活。各制品的合格指各制品的合格指标不同，不同，应按按规程程进行判定。行判定。404.病毒性病毒性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术
25、要求要求(1)生生产细胞胞 适用于病毒性疫苗适用于病毒性疫苗生生产/检定定的的细胞胞有：有：二倍体二倍体细胞胞 传代代细胞胞原代原代细胞胞41人二倍体人二倍体细胞株胞株来源来源: 正常人胎肺或其他正常人胎肺或其他组织需需进行全面行全面检定定建立的建立的细胞株胞株的的审批批：新生物制品新生物制品审批批办法法建株建株资料料：所用胎儿的所用胎儿的胎胎龄和和性性别，终止止妊娠妊娠的原因的原因;胎儿胎儿父母父母的年的年龄、职业及健康状况，胎儿父及母及健康状况，胎儿父及母系系三代三代应无明无明显遗传缺陷疾病缺陷疾病历史史;原始原始组织种种类，原始，原始细胞培养的胞培养的细胞数量与生胞数量与生长情况情况;细
26、胞培养胞培养的方法、的方法、历史、生史、生长特征和寿命的世代特征和寿命的世代数数;细胞的胞的生生长液液成分。成分。42人二倍体细胞株人二倍体细胞株的的建株建株染色体染色体检查：每每8-12世代作一次世代作一次至少至少应随机取随机取1000个分裂中期个分裂中期细胞，胞，进行行染色体染色体数目、形数目、形态和和结构构检查;至少至少选择50个分裂中期个分裂中期细胞胞进行行显微照相，做出微照相，做出核核型分析型分析;粗数粗数500个分裂中期个分裂中期细胞，胞，检查多倍体的多倍体的发生率生率;每次染色体每次染色体检查标本片本片应长期保存期保存，以，以备复复查;细菌、真菌、支原体及病毒菌、真菌、支原体及病
27、毒检查致致肿瘤性瘤性检查43传代细胞系传代细胞系由人或由人或动物物肿瘤瘤组织或正常或正常组织传代代转化而化而来，可来，可悬浮培养或用浮培养或用载体培养，能大体培养，能大规模生模生产;可无限可无限传代代，但到一定代次后，致，但到一定代次后，致肿瘤性会瘤性会增增强，所以，所以对生生产用的用的传代代细胞系胞系应进行行严格格检查。44传代细胞系传代细胞系的相关资料的相关资料需得到国家需得到国家药品品监督管理局的批准，并提供督管理局的批准，并提供有关有关资料料:a.a.细胞系来源，胞系来源，供者供者的种属、年的种属、年龄、性、性别和健康状和健康状况的描述况的描述;b.b.细胞胞传代培养方法、生代培养方法
28、、生长特征、特征、传代数，用于生代数，用于生产的最高限制代数，所用生的最高限制代数，所用生长液以及液以及传代史等描代史等描述述;c.c.初步确定可能存在的外源因子初步确定可能存在的外源因子检查结果果;45传代细胞系传代细胞系的相关资料的相关资料d. 细胞系的生胞系的生长类型及形型及形态学特征、学特征、细胞胞鉴别的特殊的特殊标志、志、遗传特征特征(如如HLA、DNA指指纹图谱);e. 提供提供细胞系用于胞系用于预定目的的定目的的资料料;f. 细胞系的生胞系的生产用限制代次和超用限制代次和超过该代次代次10代以代以上的生物学特征，要做出上的生物学特征，要做出说明。明。46原代细胞原代细胞来源来源：
29、猴猴肾、鸡胚、地鼠胚、地鼠肾、沙鼠、沙鼠肾、家兔、家兔肾、狗、狗肾和和鹌鹑胚，以及其他胚，以及其他组织等。等。正常正常组织经消化消化后、后、进行行细胞胞培养。培养。只限于只限于原始或少数几代原始或少数几代(一般在一般在5代代)以内使用，以以内使用，以生物学性状不生物学性状不发生改生改变为原原则。47原代细胞原代细胞的使用注意事项的使用注意事项a.a.在接种病毒或用于生在接种病毒或用于生产前，前，应进行行外外观和和镜下下检查，应无任何可疑、异常和病无任何可疑、异常和病变。b.b.每批每批细胞培养留取胞培养留取5%-10%（至少留有至少留有500ml）悬液，不接种病毒，至少液，不接种病毒，至少观察
30、察14天，并做天，并做细菌、真菌菌、真菌和支原体和支原体检查。48原代细胞原代细胞的使用注意事项的使用注意事项c. 原代原代细胞来源的胞来源的动物必物必须健康健康，尽量使用，尽量使用无无特定病特定病原体原体(SPF)动物物d. 对拟订用于生用于生产的的动物种群，物种群，应定期定期检查有无有无相关相关病毒抗体病毒抗体，应严格格筛选。e. 用于用于细胞制胞制备的的动物剖物剖检应正常，取留的器官正常，取留的器官组织亦亦应正常，如有异常，不能用于制正常，如有异常，不能用于制备细胞。胞。494.病毒性病毒性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术要求要求(2)生生产细胞的三胞的三级管理管理 原始原始细胞胞库通通
31、过检定定证明明（适合于生物制品生适合于生物制品生产和和检定定）的）的原始原始细胞群体胞群体，按一定量均匀分装，按一定量均匀分装于安瓿，于液氮或于安瓿，于液氮或-100以下以下冻存存备用用。504.病毒性病毒性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术要求要求(2)生生产细胞的三胞的三级管理管理 主主细胞胞库取原始取原始细胞种子，通胞种子，通过细胞胞传代，增殖到一定代，增殖到一定数量，将数量，将所有的所有的细胞均匀混合成一批胞均匀混合成一批，定量分，定量分装于安瓶，于液氮或装于安瓶，于液氮或-100以下以下冻存存备用。用。目的：目的：主主细胞胞库的的细胞胞通通过全面全面检定定后后，建立工建立工作作细胞胞库
32、。514.病毒性病毒性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术要求要求(2)生生产细胞的三胞的三级管理管理 工作工作细胞胞库细胞由主胞由主细胞胞库传代代扩增而来，增而来，冻存存时细胞的胞的传代水代水平需平需确保确保细胞复胞复苏后后、传代增殖的代增殖的细胞数量能胞数量能满足生足生产一批或一个一批或一个亚批批产品品。传代水平必代水平必须在在该细胞用于生胞用于生产限制限制最高代次之内最高代次之内。524.病毒性病毒性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术要求要求(2)生生产细胞的三胞的三级管理管理 生生产用用细胞胞取取冻存的工作存的工作细胞胞库中一个或多个安瓶，中一个或多个安瓶，混合后混合后培养，培养，传一定代次
33、后供生一定代次后供生产制品使用。制品使用。传代次代次不得超不得超过该细胞可用于生胞可用于生产的的最高限制代最高限制代次次。剩余的生产用剩余的生产用细胞，细胞，不再冻存不再冻存和和再用于生产再用于生产。534.病毒性病毒性减毒活疫苗制减毒活疫苗制备技技术要求要求(2)生生产细胞的三胞的三级管理管理 体外培养体外培养细胞胞龄计算算一定稀一定稀释倍数倍数进行行传代，每代，每传一次一次为一代一代根据根据每个每个细胞系的胞系的实践践经验数据数据，确定确定生生产使用使用细胞最后胞最后限制代次限制代次生生产用用细胞胞龄限制在限制在细胞寿命期限的胞寿命期限的2/3以内以内。544.病毒性病毒性减毒活疫苗制减毒
34、活疫苗制备技技术要求要求(3)(3)生生产程序程序 细胞培养胞培养离体离体细胞胞的的病毒敏感病毒敏感谱广广而而易被病毒感染易被病毒感染，可提，可提供大面供大面积微生物繁殖的基微生物繁殖的基质以以保保证产量量。在生在生产过程中程中：不得使用青霉素不得使用青霉素或其他或其他-内内酰胺胺类抗生素抗生素55(3) 生生产程序程序病毒培养病毒培养将适量病毒接种到将适量病毒接种到细胞中胞中（感染复制数感染复制数），），在在合适的温度合适的温度及及时间内培养病毒内培养病毒致致细胞病胞病变(CPE）病毒病毒脊髓灰脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒炎病毒、麻疹病毒可可参考参考CPE程度程度在培养限定在培养限定时间内内终止
35、培养止培养;不不产生生细胞病胞病变的病毒的病毒甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒：在在规定培养定培养时间内内终止培养。止培养。4.病毒性病毒性减毒活疫苗制备技术要求减毒活疫苗制备技术要求56(3) 生生产程序程序病毒收病毒收获及及释放放经一定培养一定培养时间达达病毒的增殖高峰期病毒的增殖高峰期，即，即应终止止培养收培养收获病毒病毒；用研磨、用研磨、冻融、超声波等融、超声波等处理以理以释放病毒放病毒。半成品制半成品制备、糖丸加工、分装、包装、糖丸加工、分装、包装按按规程程进行。行。57(4) 检 定定病毒病毒的的鉴别试验用一定量的病毒用一定量的病毒特异性高价血清特异性高价血清或有中和抗体特或有中和抗体特性
36、的性的单克隆抗体，与克隆抗体，与一定量的病毒一定量的病毒混合混合，置，置37中中和一定和一定时间后接种后接种细胞培养，以最适温度培养一定胞培养，以最适温度培养一定时间后判定后判定结果果：病毒病毒应完全被中和完全被中和蚀斑法斑法、病病变法法、ELISA法法个个别制品也用制品也用小鼠小鼠脑内接种内接种来来判定判定结果。果。58病毒病毒的的鉴别试验-蚀斑法斑法病毒病毒特异性高价血清特异性高价血清有中和抗体特性的单有中和抗体特性的单克隆抗体克隆抗体接种接种细胞细胞病病毒毒蚀斑蚀斑细胞细胞接种接种培养培养不产生不产生蚀斑蚀斑59(4) 检 定定无无菌菌试验按生物制品无菌按生物制品无菌试验规程程进行。行。
37、病毒滴定病毒滴定样品作品作系列稀系列稀释，至少取，至少取3个稀个稀释度分度分别接种接种细胞，胞，在最适温度培养一定在最适温度培养一定时间判定判定结果。果。蚀斑法、病斑法、病变法或法或ELISA法以及法以及动物物试验60(4) 检 定定外源因子外源因子检查病毒外源因子病毒外源因子对照照细胞外源因子胞外源因子每批每批生生产用用细胞胞应留取一定量作留取一定量作为对照照细胞胞（不接种病毒不接种病毒），与接种病毒的，与接种病毒的细胞用胞用相同的相同的细胞胞维持液持液，在相同条件下培养后，在相同条件下培养后进行外源因子行外源因子检查61(4) 检 定定免疫原性免疫原性检查用用主种子批主种子批制成制成疫苗疫
38、苗常常规接种接种易感者易感者检测抗体：抗体：免疫前和免疫后免疫前和免疫后4-6周周阳阳转率率：不低于不低于规程要求程要求人数人数：一般一般不少于不少于30人人。个个别制品制品：也可以小鼠免疫、攻也可以小鼠免疫、攻击试验检查其免疫原性。其免疫原性。62(4) 检 定定 热稳定性定性试验疫苗成品在疫苗成品在37放一定放一定时间后后，测其其病毒滴度病毒滴度，其其病毒滴度下降不得大于病毒滴度下降不得大于规程程规定。定。63第第三三节 减毒活疫苗的减毒活疫苗的综合合评价价 64一、减毒活疫苗的优缺点 优点：点：诱导体液免疫体液免疫和和细胞免疫胞免疫两种免疫反两种免疫反应有的制品有的制品：通通过自然感染途
39、径接种，自然感染途径接种，还可以可以诱导出出黏膜免疫黏膜免疫，使机体使机体获得得较广泛的免疫保广泛的免疫保护。使用的是活的微生物，可在机体内使用的是活的微生物，可在机体内长时间起作用起作用、而而诱导较强的免疫反的免疫反应。活的微生物有再增殖的特性，理活的微生物有再增殖的特性，理论上上只需只需接种一次接种一次，即可以达到，即可以达到满意的免疫效果。意的免疫效果。65一、减毒活疫苗的优缺点 优点：点：可能引起水平可能引起水平传播，播，扩大免疫效果，增大免疫效果，增强群群体免疫屏障体免疫屏障；无无需添加佐需添加佐剂；生生产工工艺一般不需要一般不需要浓缩纯化化；价格低廉。价格低廉。66一、减毒活疫苗的
40、优缺点 缺点：缺点：一般减毒活疫苗均保留一定一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力残余毒力，对一些个体一些个体（如如免疫缺陷者免疫缺陷者）可能可能诱发严重重疾病疾病。由于种种原因由于种种原因（如基因修如基因修饰等等），减毒活，减毒活疫苗有可能出疫苗有可能出现毒力返祖毒力返祖现象。象。是活微生物制是活微生物制剂，可能造成，可能造成环境境污染染、而而引引发交叉感染等。交叉感染等。67一、减毒活疫苗的优缺点 缺点：缺点：缺缺损颗粒可能干粒可能干扰疫苗的免疫效果。疫苗的免疫效果。产品的分析品的分析评估估较为困困难。保存、运保存、运输等条件要求等条件要求较高高，如需冷如需冷链等。等。68二、减毒活疫苗二、减毒
41、活疫苗使用策略使用策略的评估的评估 1.免疫程序免疫程序 理理论上上:活微生物在体内的再增殖特性活微生物在体内的再增殖特性：单剂免疫方案免疫方案实际上：上：单剂免疫免疫：往往达不到理想保往往达不到理想保护效果效果因因为：传统减毒活疫苗往往减毒活疫苗往往减毒减毒又又减减免疫原性免疫原性新型疫苗新型疫苗（非复制型微生物非复制型微生物载体疫苗体疫苗等）等）所表达的抗原量也往往偏低所表达的抗原量也往往偏低691.免疫程序免疫程序 脊髓灰脊髓灰质炎减毒活疫苗炎减毒活疫苗（1960-）单价、双价价、双价、三价三价剂型型1、2、3、4剂免疫方案免疫方案目前方案：目前方案：三价疫苗三价疫苗4剂免疫免疫（198
42、6）首次免疫首次免疫：2月月龄间隔隔4-6周周：再再连续免疫免疫2次次 4岁：加加强免疫免疫1次。次。70脊髓灰脊髓灰质炎减毒活疫苗炎减毒活疫苗不同免疫程序不同免疫程序比比较三价疫苗单剂免疫三价疫苗单剂免疫三价疫苗三价疫苗4剂免疫剂免疫抗体阳转率抗体阳转率70 % -90%95%-100%中和抗体水平中和抗体水平+本疫苗已使我国本土消灭了由野型株引起的脊髓灰质炎本疫苗已使我国本土消灭了由野型株引起的脊髓灰质炎71甲型肝炎减毒活疫苗甲型肝炎减毒活疫苗免疫效果免疫效果比比较:诱导的抗体反的抗体反应与与剂量正相关量正相关两两针免疫接种方案免疫接种方案：受到日益广泛的受到日益广泛的重重视和研和研讨。第
43、一针免疫第一针免疫后后4-8周周加强免疫加强免疫抗体阳转率抗体阳转率80 % - 100 %95 % - 100 %抗体滴度抗体滴度偏低偏低提高提高抗体持续时间延长抗体持续时间延长721.免疫程序免疫程序应根据对疫苗保护效果及其持久应根据对疫苗保护效果及其持久性的要求来性的要求来制订并完善制订并完善732.免疫途径免疫途径 自然感染自然感染：绝大部分病原体通大部分病原体通过黏膜黏膜入侵机体入侵机体减毒活疫苗的免疫接种减毒活疫苗的免疫接种：大多数采用大多数采用非非肠道途径道途径(如皮下注射、皮上划痕如皮下注射、皮上划痕)74非非肠道途径道途径免疫接种免疫接种途径的途径的缺点缺点免疫免疫诱导位点不
44、定向位点不定向产生的免疫反生的免疫反应仅为系系统免疫免疫、缺乏局部缺乏局部应答答;免疫接种人免疫接种人员需要培需要培训，需使用接种器材，需使用接种器材，不不仅造成造成给药成本成本较高高，且有，且有潜在交叉潜在交叉污染可能染可能;接种接种时引起的局部疼痛以及其后的局部反引起的局部疼痛以及其后的局部反应往往往往不易被免疫不易被免疫对象所接受象所接受75自然感染途径自然感染途径免疫接种免疫接种脊髓灰脊髓灰质炎减毒活疫苗炎减毒活疫苗（口服口服）取得了非常成功的个体和群体免疫保取得了非常成功的个体和群体免疫保护效果。效果。黏膜途径免疫黏膜途径免疫：受到日益重受到日益重视和深入研究和深入研究消化道消化道呼
45、吸道呼吸道泌尿生殖道泌尿生殖道黏膜某黏膜某处受抗原刺激的免疫受抗原刺激的免疫活性活性细胞会在胞会在其他其他黏膜部黏膜部位位产生相生相应的特异免疫反的特异免疫反应76黏膜免疫黏膜免疫的的优势:发挥黏膜黏膜第一屏障作用第一屏障作用，阻止病原体入侵甚，阻止病原体入侵甚至在局部清除至在局部清除;诱导包括包括局部局部和和系系统应答答在内的全面免疫保在内的全面免疫保护效果效果;免疫方便，副反免疫方便，副反应小，安全性好，易被免疫小，安全性好，易被免疫对象接受象接受;给药成本低，疫苗制成本低，疫苗制备成本也低。成本也低。773.母体免疫母体免疫 (MATERNAL IMMUNIZATION)传统：孕孕妇是是
46、免疫接种的免疫接种的禁忌者禁忌者近近20年年：“孕孕妇免疫免疫”新新动向向作用作用: 提高提高妇女女怀孕期的健康水平孕期的健康水平（预防防急性急性传染病染病)母体母体抗体抗体可通可通过胎胎盘、乳汁等垂直、乳汁等垂直传递给胎儿和胎儿和新生儿，使其在出生后的一段新生儿，使其在出生后的一段时间具具备抵抗外来抵抗外来微生物侵犯和微生物侵犯和预防疾病的能力。防疾病的能力。78孕孕妇免疫免疫用疫苗用疫苗十余种十余种疫苗疫苗试验：如破如破伤风类毒素，乙肝、毒素，乙肝、流感和脊髓灰流感和脊髓灰质炎疫苗等。炎疫苗等。流感疫苗流感疫苗母体母体：流感抗体升高流感抗体升高新生儿新生儿：得到被得到被动免疫保免疫保护美国
47、疾病控制和美国疾病控制和预防中心推荐防中心推荐：在流感高在流感高发季季节，孕孕妇在在怀孕期第孕期第4个月以后个月以后可以使用。可以使用。79母体免疫需要母体免疫需要逐步、慎重逐步、慎重地开展地开展有利的有利的母体免疫母体免疫：呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒(RSV)引起新生儿下呼吸道感染的主要病原体引起新生儿下呼吸道感染的主要病原体母体破母体破伤风抗毒素抗毒素：对胎儿胎儿有有保保护作用作用不利的不利的母体免疫母体免疫：B组链球菌疫苗免疫球菌疫苗免疫（怀孕期第孕期第7-9个月个月）：可能可能导致胎儿死亡。致胎儿死亡。80三、疾病性三、疾病性质与疫苗效果的与疫苗效果的评估估 疫苗疫苗的的效果效果取决
48、于取决于：疫苗的疫苗的质量量疾病的特性疾病的特性社会生社会生态环境境经济条件条件管理水平管理水平81天花天花为什么能被为什么能被消灭消灭？宿主宿主单一：一：人人：天花病毒的天花病毒的唯一宿主唯一宿主，疫苗覆盖面明确，疫苗覆盖面明确;症状明症状明显：几乎所有感染者有明几乎所有感染者有明显的、有特点的皮疹的、有特点的皮疹；传染期染期较短短传染源易被染源易被发现、监控控传播途径易于切断播途径易于切断疾病的特性疾病的特性82天花天花为什么能被为什么能被消灭消灭？感染后感染后终生免疫生免疫，获得性免疫效果好得性免疫效果好;牛痘苗安全有效，牛痘苗安全有效，价格低廉价格低廉，利于大面，利于大面积免免疫接种保
49、疫接种保护易感人群易感人群;1958年年，世界世界卫生大会通生大会通过了在了在全球全球开展开展消消灭天花运天花运动的决的决议。管理水平管理水平经济条件经济条件83传染病染病人人类独有的疾病独有的疾病：麻疹、脊髓灰麻疹、脊髓灰质炎、腮腺炎、炎、腮腺炎、风疹、乙型肝炎、疹、乙型肝炎、白喉、百日咳等白喉、百日咳等人人兽共患性疾病共患性疾病：狂犬病、乙型狂犬病、乙型脑炎、森林炎、森林脑炎、出血炎、出血热、鼠疫、鼠疫、炭疽等炭疽等宿主宿主：人、：人、家畜、鼠家畜、鼠类等。等。有可能被消灭有可能被消灭不不可能可能被消灭被消灭84四、减毒活疫苗的前景四、减毒活疫苗的前景 存在存在问题：安全性安全性毒力返祖毒
50、力返祖疫苗相关病例疫苗相关病例优势：最近似于病原体的自然感染最近似于病原体的自然感染过程，可以程，可以诱导较为全面的免疫全面的免疫应答答85四、减毒活疫苗的前景四、减毒活疫苗的前景 自然界中的自然界中的病原体病原体变种种，在在病原微生物种群平衡上病原微生物种群平衡上的可能的可能走向？走向？2001年以来，在中美洲分离到几株在自然循年以来，在中美洲分离到几株在自然循环过程中程中发生生重重组的脊髓灰的脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒炎减毒活疫苗病毒因此因此在相当在相当时期内期内，有大量的探索工作要做有大量的探索工作要做，还将将继续在多种在多种传染病的染病的预防中防中发挥其重要作用。其重要作用。86谢谢！87
