长期毒性试验课件

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1、实验动物与动物实验实验动物与动物实验第第2讲讲 毒性毒性试验试验 2. Chronic Toxicity Test 2024/9/171长期毒性试验课件一、长期毒性试验的目的意义一、长期毒性试验的目的意义 确定毒性剂量：确定毒性剂量： Toxic dosage发现安全范围：发现安全范围： Safety margin 研究毒性反应：研究毒性反应： Toxic reaction: 性质、程度、性质、程度、量毒关系、产生时间，达峰时间量毒关系、产生时间，达峰时间, 持续时间及反持续时间及反复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性复产生毒性反应时间、迟发性、蓄积性、耐受性 找到毒性反应靶器官：找到毒

2、性反应靶器官： Target organ 明确毒性反应是否可逆：明确毒性反应是否可逆： Reversibility确定确定“DOSTR”长期毒性试验课件二、长期毒性试验的基本内容和要求二、长期毒性试验的基本内容和要求 1.1.试验动物试验动物二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用犬二种动物，啮齿类首选大鼠，非啮齿类用犬(Beagle犬犬), 必要时用猴；必要时用猴；动物应写明供应单位信息，品系及生产合格证号；动物应写明供应单位信息，品系及生产合格证号；大鼠大鼠6-8周龄，体重差异不超过平均体重的周龄，体重差异不超过平均体重的20。3个月个月以上可选以上可选5-6周龄大鼠；周龄大鼠；Beagle犬

3、犬4-12月龄；月龄；各半，数量相同各半，数量相同 。或选用敏感性别的动物选用敏感性别的动物长期毒性试验课件2.2.饲养管理饲养管理严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素。严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素。室内温度室内温度饲料或饲料配方饲料或饲料配方湿湿 度度光光 照照通风条件通风条件饮水质量饮水质量环境因素环境因素环境因素环境因素长期毒性试验课件2.2.饲养管理饲养管理啮齿类动物物适宜温度为适宜温度为 1827 。 相对湿度为相对湿度为 40%70%。光照宜持续光照宜持续 12 小时明亮，小时明亮，12 小时黑暗。小时黑暗。通风条件良好。通风条件良好。所用饲料应符合动物的营养标准。所用

4、饲料应符合动物的营养标准。雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过 5只只犬犬单笼饲养，定量喂食。单笼饲养，定量喂食。 Beagle 狗实验前至少驯狗实验前至少驯养养 12 周周; 杂种狗应先检疫，驱虫。杂种狗应先检疫，驱虫。长期毒性试验课件2.2.饲养管理饲养管理主要因素主要因素动物类别动物类别小鼠、大鼠小鼠、大鼠豚鼠、家兔豚鼠、家兔犬犬温度温度( )20-2618-2818-28湿湿 度度40-60%40-60%40-60%换气次数换气次数10-15次次/h10-15次次/h10-15次次/h气流速度气流速度13-18cm/s13-18cm/s13-18cm/s压压

5、 力力正正 压压正正 压压负负 压压洁洁 净净 度度100000级级100000级级落下细菌落下细菌3个个/皿皿3个个/皿皿照照 明明150-300 Lux150-300 Lux噪噪 声声60 db60 db臭臭 气气氨浓度氨浓度20 ppm氨浓度氨浓度20 ppm长期毒性试验课件3.3.受试物受试物受试物应能充分代表临床试验受试物和上市药品；受试物应能充分代表临床试验受试物和上市药品；因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试用质量因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的样品；标准规定的样品；一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源

6、、批号含量（或规格）含量（或规格） 、保存条件及配制方法等。、保存条件及配制方法等。长期毒性试验课件4.4.给药途径给药途径与临床给药途径一致与临床给药途径一致混入饲料或饮水中灌服时：混入饲料或饮水中灌服时： 保证受试药分布均匀保证受试药分布均匀 在配制饲料或溶于饮水后仍旧稳定在配制饲料或溶于饮水后仍旧稳定 计量准确计量准确临床临床iv 时时, 大鼠给药周期大鼠给药周期1月，可用月，可用ip代替，代替，im或或sc应应变换注射部位变换注射部位必要时改变给药途径必要时改变给药途径长期毒性试验课件5.5.剂量及分组剂量及分组至少至少3个给药组个给药组, 单位单位: mg(ml,IU) /kg 或或

7、 /m2以不等浓度等容量给药以不等浓度等容量给药低剂量组低剂量组-高于有效剂量，不出现毒性反应高于有效剂量，不出现毒性反应(一般一般为动物有效物有效剂量量或或临床治床治疗量的量的23倍倍)中剂量组（中剂量组（1-n个）个）-产生轻微或中等度毒性反应产生轻微或中等度毒性反应高剂量组高剂量组-产生明显或严重的毒性反应，或个产生明显或严重的毒性反应，或个 别动物死亡（别动物死亡（但死亡率但死亡率应控制在控制在 20% 以内）以内）；空白对照空白对照-溶媒或其它赋形剂，若溶媒或赋形剂有毒性时则增加正溶媒或其它赋形剂，若溶媒或赋形剂有毒性时则增加正常对照组常对照组3月，大鼠月，大鼠各各20只只/组组3月

8、，大鼠月，大鼠各各30只只/组组大动物大动物6-8只只/组（组（各半）各半）按按 计算计算 长期毒性试验课件5.5.剂量及分组剂量及分组 在选择合适的剂量时还应考虑到：在选择合适的剂量时还应考虑到： 药药物物在在体体内内的的生生物物蓄蓄积积作作用用。对对于于高高蓄蓄积积性性药药物物应应适适当当减减少少其其剂剂量量，否否则则在在长长期期毒毒性性试试验验结结束束时时各各剂剂量量均均有有可可能能出现毒性作用；出现毒性作用； 药药物物是是否否有有可可能能被被特特殊殊的的酶酶所所“解解毒毒”或或“活活化化增增毒毒”，而这些酶又是否易被药物本身所诱导或抑制。，而这些酶又是否易被药物本身所诱导或抑制。 药药

9、物物在在消消化化道道中中的的稳稳定定性性。与与胃胃肠肠道道内内容容物物有有亲亲和和性性的药物，则应酌情增加剂量。的药物，则应酌情增加剂量。 长期毒性试验课件可供参考的具体方法可供参考的具体方法可供参考的具体方法可供参考的具体方法（1）半数致死量法（）半数致死量法（LD50法）法）（2）短期蓄）短期蓄积试验过渡法渡法（3）药代代动力学法（力学法（MBS法）法）（4）最大耐受量法（）最大耐受量法（MTD法）法）（5）临床床拟用用剂量法（量法（ACD法）法）（6）等效）等效剂量法量法5.5.剂量及分组剂量及分组大鼠大鼠3个月个月:采用约采用约LD50的的1/10、1/50和和1/100剂量，狗各剂量

10、组可剂量，狗各剂量组可采用一半剂量。采用一半剂量。根据药代动力学最大有效安全浓根据药代动力学最大有效安全浓度（度（MCD）大鼠大鼠3个月个月:采用大鼠的采用大鼠的1.0 、3.36.6 和和1020 MCD;狗可采用大鼠一半左右的剂量。狗可采用大鼠一半左右的剂量。根据大鼠急性毒性根据大鼠急性毒性 (MTD)大鼠大鼠3个月：分别为个月：分别为1、1/3及及1/10MTD；狗和猴可采用大鼠一半左右的剂量。狗和猴可采用大鼠一半左右的剂量。根据临床拟用剂量（根据临床拟用剂量（3个月）个月）采用采用50100倍、倍、2550倍和倍和1020倍临床剂量倍临床剂量狗可分别采用狗可分别采用3050倍、倍、15

11、25倍和倍和510倍临床剂量倍临床剂量猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验长期毒性试验课件5.5.剂量及分量及分组限度试验限度试验 我国我国SFDASFDA规定规定： 如小鼠急性毒性的口服如小鼠急性毒性的口服给药剂量大于给药剂量大于 5g/kg5g/kg，注射给药剂量大于注射给药剂量大于 2g/kg 2g/kg 仍未产生毒性反仍未产生毒性反应和死亡应和死亡，或仅个别动或仅个别动物有毒性反应时物有毒性反应时，可考可考虑只做一个高于临床拟虑只做一个高于临床拟用剂量用剂量5050倍倍( (狗用狗用3030倍倍) )的剂量组。的剂量组。 经济合作

12、与开发组织经济合作与开发组织(OECD)提出提出： 如果一种化合物以如果一种化合物以1000mg/kg的剂量的剂量，按规定期限连续给药按规定期限连续给药，不产生任何可观察到的毒性反不产生任何可观察到的毒性反应应，而且根据结构相关药物的而且根据结构相关药物的已有资料已有资料，估计不会产生毒性估计不会产生毒性的话的话，就不需要再用三个剂量就不需要再用三个剂量来进行试验来进行试验，除非预期临床需除非预期临床需要更高的剂量。要更高的剂量。 长期毒性试验课件6.6.给药方法及时限给药方法及时限每天给药，每周必须给药每天给药，每周必须给药 7 7 天。给药期限长（天。给药期限长（3 3个月或以上）的个月或

13、以上）的药物每周至少应给药药物每周至少应给药6 6天。天。每天给药最好固定时间。每天给药最好固定时间。按我国药政管理部门的要求，长期毒性试验的给药期限一般为临按我国药政管理部门的要求，长期毒性试验的给药期限一般为临床疗程的床疗程的34倍时间。倍时间。 创新药品试验周期应不少于创新药品试验周期应不少于90天，天， 超过超过180天的新药可以在试验开始天的新药可以在试验开始90天后，同时进行天后，同时进行I期临床试验。期临床试验。长期毒性试验课件6.6.给药方法及时限给药方法及时限临床拟用临床拟用 毒性试验期限毒性试验期限 给药时间给药时间 啮齿类动物啮齿类动物 非啮齿类动物非啮齿类动物 5 5天

14、天 2 2周周 2 2周周 2 2周周 1 1月月 1 1月月 2-4 2-4周周 3 3月月 3 3月月 1-3 1-3月月 6 6月月 6 6月月 3 3月月 6 6月月 9 9月月 长期毒性试验课件7.7.观察及测定指标观察及测定指标 试验前，啮齿类动物至少应进行试验前，啮齿类动物至少应进行5 5天的适应性观察，非啮齿类动物天的适应性观察，非啮齿类动物至少应驯养观察至少应驯养观察1212周，应对动物进行一般观察及血液生化学指标的周，应对动物进行一般观察及血液生化学指标的检测。检测。 试验期间，至少应每天或每两天作一次详细的观察。试验期间，至少应每天或每两天作一次详细的观察。 试验结束时，

15、必须留试验结束时，必须留1/31/3的动物做恢复期的观察试验，其观察期时的动物做恢复期的观察试验，其观察期时间一般不超过间一般不超过2828天。天。9/17/202415长期毒性试验课件7.1 7.1 7.1 7.1 日常观察日常观察日常观察日常观察 1） 一般一般观察观察内容内容 包括对实验动物被毛、皮肤、眼睛、粘膜、孔道包括对实验动物被毛、皮肤、眼睛、粘膜、孔道 ( 及其分泌物及其分泌物 ) 、呼吸、循环、自主神经系统、躯体、呼吸、循环、自主神经系统、躯体和肢体活动情况以及精神行为进行仔细地观察和肢体活动情况以及精神行为进行仔细地观察；对对动物粪便的量、色泽和内含物动物粪便的量、色泽和内含

16、物，散失的食物散失的食物，饮水饮水瓶中残余的水以及一切可以反映动物生活情况变化瓶中残余的水以及一切可以反映动物生活情况变化的各种迹象的各种迹象，都必须加以注意。都必须加以注意。 所有出现的症状都必须记录在案。所有出现的症状都必须记录在案。9/17/202416长期毒性试验课件1） 一般一般观察观察内容内容 如果发现动物死亡如果发现动物死亡，必须尽可能快地进行尸体剖检必须尽可能快地进行尸体剖检，以减少以减少组织自溶。将组织置于组织自溶。将组织置于 10% 10% 的中性福尔马林或其它适宜的固定液的中性福尔马林或其它适宜的固定液中。如果尸体剖检不能立即进行中。如果尸体剖检不能立即进行，则必须将动物

17、冷藏起来以延缓则必须将动物冷藏起来以延缓组织自溶组织自溶 。 对濒死的动物也应立即处死作尸体剖检。对濒死的动物也应立即处死作尸体剖检。 尸体剖检尸体剖检后行组织病理学检查、评价后行组织病理学检查、评价。9/17/202417长期毒性试验课件2）生长率）生长率体重体重 3）食耗）食耗食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响食耗的计算食耗的计算 将加入供食器具中饲料的重量减去剩余的饲料重量再除以给食天数 如如对对食欲有影响食欲有影响，则则每日每日进进食量必然减少食量必然减少, 体重增体重增长长亦受影亦受影响响, 但此但此时时食物利用率并不一定降低食物利用

18、率并不一定降低如果不影响食欲如果不影响食欲,而体重增而体重增长却下降却下降,表明表明药物有可能影响食物有可能影响食物的吸收或合成代物的吸收或合成代谢,此此时食物利用率就必然会有食物利用率就必然会有变化化9/17/202418长期毒性试验课件7.2 7.2 7.2 7.2 测定指标测定指标测定指标测定指标 1）器官重量）器官重量 涉及的主要器官有涉及的主要器官有： 心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、 肾上腺、甲状腺、肾上腺、甲状腺、睾丸睾丸、前列腺、子宫、前列腺、子宫等等。 目的：确定靶器官9/17/202419长期毒性试验课件药物研究技术指导原则药物研究技术指导原

19、则药物研究技术指导原则药物研究技术指导原则规定规定规定规定长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：l脑脑l肝脏肝脏l肾上腺肾上腺l脾脏脾脏l附睾附睾l子宫子宫l心脏心脏l肾脏肾脏l胸腺胸腺l睾丸睾丸l卵巢卵巢l肺脏肺脏1）器官重量）器官重量甲状腺、甲状腺、前列腺前列腺9/17/202420长期毒性试验课件长期毒性试验中进行病理组织学检查的组织或器官：长期毒性试验中进行病理组织学检查的组织或器官：l脑（大脑、小脑、脑干）脑（大脑、小脑、脑干）l垂体垂体l甲状腺甲状腺l食管食管l胃胃l肝脏肝脏l肾脏肾脏l脾脏脾脏l气管气管l主动脉主动脉l附睾附睾l卵巢卵

20、巢l前列腺前列腺l坐骨神经坐骨神经l眼（眼科检查发现异常时）眼（眼科检查发现异常时）l给药局部给药局部l淋巴结淋巴结l脊髓脊髓l胸腺胸腺l甲状旁腺甲状旁腺l唾液腺唾液腺l小肠和大肠小肠和大肠l胆囊胆囊l肾上腺肾上腺l胰腺胰腺l肺肺l心脏心脏l睾丸睾丸l子宫子宫l乳腺乳腺l膀胱膀胱l视神经视神经l骨髓骨髓注：注：为啮齿类动物可不物可不进行行组织病理学病理学检查的的组织或器官或器官长期毒性试验课件2 2）血液学）血液学u常规的血液学参数常规的血液学参数u骨髓涂片骨髓涂片l红细胞计数红细胞计数l红细胞容积红细胞容积l平均红细胞血红蛋白平均红细胞血红蛋白l网织红细胞计数网织红细胞计数l血小板计数血小板

21、计数l血红蛋白血红蛋白l平均红细胞容积平均红细胞容积l平均红细胞血红蛋白浓度平均红细胞血红蛋白浓度l白细胞计数及分类白细胞计数及分类l凝血酶原时间凝血酶原时间红细胞压积红细胞压积血液学指标血液学指标9/17/202422长期毒性试验课件血液学指标血液学指标观察时间观察时间非非啮啮齿类动物齿类动物：一般于整个试验周期中每隔一般于整个试验周期中每隔 1.5 2 个月采血测定一次各项指标。个月采血测定一次各项指标。啮啮齿类动物齿类动物：试验周期为试验周期为 6 个月时个月时，可于试验中期、试验末期以及恢复期分别剖可于试验中期、试验末期以及恢复期分别剖杀部分动物杀部分动物 ( 约约 1/4 、2/4

22、、 1/4)，进行各项检查进行各项检查；试验周期为试验周期为 3 个月时个月时，可于试验未期以及恢复期分别剖杀部分动物可于试验未期以及恢复期分别剖杀部分动物 ( 约约 2/3、1/3)，取血，取血检查。检查。9/17/202423长期毒性试验课件3） 血液生化学血液生化学 注意注意事项：事项：q采血时从各组中随机捉取动采血时从各组中随机捉取动物，物，样本不能溶血样本不能溶血q使用足够数量的动物使用足够数量的动物q采样前禁食采样前禁食 12 小时小时q使用合适的统计学分析方法使用合适的统计学分析方法，注意剂量注意剂量反应关系反应关系；将所得资料将所得资料和数据与同种、同龄、同性别、同生理状况的实

23、验动物的资料加和数据与同种、同龄、同性别、同生理状况的实验动物的资料加以比较分析以比较分析 血液生化学指标血液生化学指标l天门冬氨酸氨基转换酶天门冬氨酸氨基转换酶l碱性磷酸酶碱性磷酸酶l尿素氮尿素氮l总蛋白总蛋白l血糖血糖l总胆固醇总胆固醇l谷氨酰转移酶谷氨酰转移酶l氯离子浓度氯离子浓度l丙氨酸氨基转换酶丙氨酸氨基转换酶l肌酸磷酸激酶肌酸磷酸激酶l肌酐肌酐l白蛋白白蛋白l总胆红素总胆红素l甘油三酯甘油三酯l钾离子浓度钾离子浓度l钠离子浓度钠离子浓度9/17/202424长期毒性试验课件4）尿液分析）尿液分析 尿液分析指标尿液分析指标l尿液外观尿液外观lpHpH值值l尿蛋白尿蛋白l尿胆原尿胆原l

24、潜血潜血l比重比重l尿糖尿糖l尿胆红素尿胆红素l酮体酮体l白细胞白细胞9/17/202425长期毒性试验课件5）心电图心电图导联导联大动物长期毒性必须做大动物长期毒性必须做 ；主要观察指标：主要观察指标：心率、心率、P波电压、波电压、P-R间期、间期、R波电压、波电压、QRS时间、时间、ST段、段、T波电压和波电压和Q-T间期间期长期毒性试验课件8.恢复期恢复期观察观察 最后一次给药物后最后一次给药物后24小时，每组活杀部分动小时，每组活杀部分动物检测上述各项指标，留下物检测上述各项指标，留下1/31/2动物进行恢复动物进行恢复期观察。观察期一般不超过期观察。观察期一般不超过28天，而后再活杀

25、检天，而后再活杀检查上述所有指标，以了解毒性反应的可逆程度和查上述所有指标，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。可能出现的延迟性毒性反应。 9/17/202427长期毒性试验课件9 9）资料整理）资料整理 首首页页写写明明: 负负责责者者的的姓姓名名、职职称称、实实验验开开始始及及结结束束日日期、实验承担单位、研究室负责人和资料保存单位期、实验承担单位、研究室负责人和资料保存单位试试验验指指导导者者、课课题题负负责责人人、病病理理学学检检查查、血血液液生生化化指指标标测测定定、血液学指标测定及给药观察者血液学指标测定及给药观察者第二页书写试验摘要第二页书写试验摘要第三页开始写正

26、文、引言、材料与方法、结果第三页开始写正文、引言、材料与方法、结果合理的统计图、表合理的统计图、表有差异的指标应进行统计处理有差异的指标应进行统计处理应客观地描述尸检及组织病理学检查结果应客观地描述尸检及组织病理学检查结果对各种异常现象可用半定量的方式表述，揭示量对各种异常现象可用半定量的方式表述，揭示量-时关系时关系 长期毒性试验课件三、综合评价三、综合评价 长期毒性试验是药物非临床安全性长期毒性试验是药物非临床安全性研究的有机组成部分，是药物非临床毒理学研研究的有机组成部分，是药物非临床毒理学研究中综合性最强、获得信息最多和对临床指导究中综合性最强、获得信息最多和对临床指导意义最大的一项毒

27、理学研究。对其结果进行评意义最大的一项毒理学研究。对其结果进行评价时，应结合受试物的药学特点，药效学、药价时，应结合受试物的药学特点，药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果，以及已取代动力学和其他毒理学研究的结果，以及已取得的临床研究的结果，进行综合评价。得的临床研究的结果，进行综合评价。9/17/202429长期毒性试验课件确实做好预试确实做好预试 pretest周密设计剂量周密设计剂量 dosage 精心饲养动物精心饲养动物 housing细心观察反应细心观察反应 observation认真测定指标认真测定指标 examination实事求是总结实事求是总结 conclusion长期毒性试验的关键：长期毒性试验的关键：长期毒性试验课件