2005版药典药品微生物限度检查法版药典药品微生物限度检查法 概念 §微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂及其原料，辅料受微生物污染程度的方法检查工程包括细菌数，霉菌数及酵母菌数及控制菌检查 环境条件 应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单项流空气区域内进行检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染洁净区域应定期进行洁净度验证 培养 温度§细菌为30～35℃§霉菌及酵母菌 为23～28℃§控制菌为35～37℃ 检验量 §一般供试品的检验量为10g或10ml，化学膜剂为100cm2贵重药品，微量包装药品的检验量可以酌减要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml§检验时应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片 供试液的制备 § 液体供试品液体供试品§ 固体、半固体或粘稠性供试品固体、半固体或粘稠性供试品§取取供供试试品品10 10 g g〔〔10ml) 10ml) ，，加加无无菌菌氯氯化化钠钠- -蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液100ml,100ml,混匀，为混匀，为1 1：：1010供试液，供试液， § §需用特殊供试液制备方法的供试品 § 非水溶性供试品§ 膜剂供试品 § 肠溶及结肠溶制剂供试品§ 气雾剂、喷雾剂供试品 非水溶性供试品§取本品10g，置输液瓶中加无菌十四烷酸异丙脂20ml，充分振摇，使供试品溶解。
§然后加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，充分振摇，将输液瓶倒置，静置使油水明显分层，分别取其水层1ml参加平皿 一 、目的：确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性二 、内容：细菌、霉菌及酵母菌数测定〔即：对5株阳性对照实验菌株的回收率逐一进行验证〕三 、菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B) 26003]、 大肠杆菌〔Escherichia coli〕[CMCC(F) 44102]、 白色念珠菌(Candida a lbicans )[CMCC(F ) 98001]、 黑曲霉菌(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]四 、方法：中国药典2005版微生物限度检查法方法验证实验五 、方法验证：细菌、霉菌酵母菌数测定，至少应进行3次独立的平行实验，每次平行实验回收率逐均应在70%以上验证试验验证试验 微生物检查方法§常规法§培养基稀释法§离心沉淀集菌法§薄膜过滤法§中和法 回收率测定1) 试验组：分别1：10供试液1 ml、50~100cfu/ ml 试 验菌株同时参加平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。
薄膜过滤法以最后一次的冲洗液参加试验菌2) 活菌组：测定每一菌株加的试验菌数3) 供试液对照：测定供试品本底菌数4) 稀释剂对照组 稀释剂对照组§供试品制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度 ¡1．取经37℃培养18-24小时，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌肉汤培养物1ml加9ml生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-9，为50~100个/ml，做活菌计数备用¡2．取经25℃ 培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml加9 ml生理盐水10倍稀释至10-5 ~10-7，为50~100个/ml，做活菌计数备用¡3．取经25℃ 培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 取1 ml 加9 ml生理盐水，逐管10倍稀释为10-4 ~10-6约50~100个/ ml，做活菌计数备用 菌液制备 常规法(1) 试验组: 分别取1：10供试液1 ml、试验菌株1ml同时参加平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果每株试验菌平行制备2个平皿 (2) 活菌组 测定每一菌株的试验菌数各取试验菌液1 ml参加平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。
每株试验菌平行制备2个平皿3) 供试液对照 测定供试品本底菌数取1：10供试液1 ml参加平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果细菌、霉菌及酵母菌平行制备2个平皿 回收率计算§样品回收率计算公式=((试验组平均菌数-供试液对照组平均数)÷活菌组平均菌数)*100% 表1 菌落计数〔cfu/ml〕§ § § § 试验菌试验菌 实验次数实验次数 试验组试验组 活菌组活菌组 供试液对照组供试液对照组 回收率回收率 § § 大肠杆菌大肠杆菌 1 54 49 62 60 0 84 1 54 49 62 60 0 84％％ § § 2 98 87 102 94 0 94 2 98 87 102 94 0 94％％ § § 3 45 50 55 57 0 88 3 45 50 55 57 0 88％％ § § 金黄色金黄色 1 60 58 67 75 0 83 1 60 58 67 75 0 83％％ § §葡萄球菌葡萄球菌 2 50 45 58 53 0 86 2 50 45 58 53 0 86％％ § § 3 71 73 78 73 0 95 3 71 73 78 73 0 95％％ § §枯草杆菌枯草杆菌 1 49 41 58 55 0 80% 1 49 41 58 55 0 80% § § 2 38 42 45 52 0 82% 2 38 42 45 52 0 82% § § 3 74 80 85 88 0 89% 3 74 80 85 88 0 89% § §白色念珠菌白色念珠菌 1 101 90 103 104 0 92% 1 101 90 103 104 0 92% § § 2 79 75 81 89 0 91% 2 79 75 81 89 0 91% § § 3 85 83 95 86 0 93% 3 85 83 95 86 0 93% § § 黑曲霉黑曲霉 1 61 57 68 65 0 89% 1 61 57 68 65 0 89% § § 2 49 47 51 54 0 91% 2 49 47 51 54 0 91% § § 3 95 94 105 96 0 94% 3 95 94 105 96 0 94% 培养基稀释法§当供试品五种菌中有一种菌的回收率未到达70％时，首先考虑用培养基稀释法。
§取规定量的供试液至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含菌量减少，至不含抑菌作用§一般可以皿，0.2 ml/皿，0.1 ml/皿 离心法§离心法有低速离心法和高速离心法§低速离心法是500转/别离心5分钟，取上清液备用§高速离心法是3000转/别离心20分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml用 薄膜过滤法取取相相当当于于每每张张滤滤膜膜含含1g1g或或1ml1ml供供试试品品的的供供试试液液, ,加加至至适适量量的的稀稀释释剂剂中中, ,混混匀匀, ,过过滤滤. .假假设设供供试试品品每每1g1g或或1ml1ml所所含含的的菌菌数数较较多多时时, ,可可取取适适宜宜稀稀释释级级的的供供试试液液1ml,1ml,过过滤滤. . 用用的的无无菌菌氯氯化化钠钠- -蛋蛋白白胨胨缓缓冲冲液液或或其其他他适适宜宜的的冲冲洗洗液液冲冲洗洗滤滤膜膜, ,冲冲洗洗方方法法和和冲冲洗洗量量同同计计数数方方法法的的验验证证冲冲洗洗后后取取出出滤滤膜膜, ,菌菌面面朝朝上上贴贴于于营营养养琼琼脂脂培培养养基基或或玫玫瑰瑰红红钠钠琼琼脂脂培培养养基基或或酵酵母母浸浸出出粉粉胨胨葡葡萄萄糖糖琼琼脂脂培培养养基平板上培养。
每种培养基至少制备一张滤膜基平板上培养每种培养基至少制备一张滤膜. . §验证时，加菌是在最后一次冲洗中，参加的菌量不要超过100个§同时应作稀释液回收 薄膜过滤法本卷须知：1.滤膜孔径应不大于0.45um,直径约为50nm.选择滤膜材质时应保证供试品及溶剂不影响微生物的充分被截留.滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌.2.使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性.水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液润湿滤膜.油类供试品,其滤膜和过滤器在使用前应充分枯燥.为发挥滤膜的最大过滤效率,应保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜外表.3.供试液经薄膜过滤后,假设需要用冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗冲洗量为100ml,每片滤膜的总过滤量不宜过大,以防止滤膜上的微生物受损. 4.阴性对照 取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照.阴性对照不得有菌生长.5.培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌数应不超过100.6.菌数报告规那么 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数.假设滤膜上无菌落生长,以＜1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1ml供试品),或＜1乘以稀释倍数的值报告菌数. 中和法§针对品种选用特殊的中和剂或灭活剂。
§中和剂或灭活剂可以加在所用的稀释液或培养基中 控制菌检查§控制菌检查方法的验证§当建立药品的微生物限度检查法时,应进行控制菌检查方法的验证,以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查.假设药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时,检查方法应重新验证. §菌种 对对试试验验菌菌种种的的要要求求同同细细菌菌、、霉霉菌菌和和酵酵母母菌菌计计数数方法的验证方法的验证§ §大肠埃希菌大肠埃希菌§ §金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌§ §乙型副伤寒沙门菌乙型副伤寒沙门菌§ §铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌§ §生孢梭菌生孢梭菌§菌液制备 接接种种大大肠肠埃埃希希菌菌、、金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌、、乙乙型型副副伤伤寒寒沙沙门门菌菌、、铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌的的新新鲜鲜培培养养物物至至营营养养肉肉汤汤培培养养基基或或营营养养琼琼脂脂培培养养基基中中，，生生孢孢梭梭菌菌的的新新鲜鲜培培养养物物至至硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐流流体体培培养养基基中中，，培培养养1818～～2424小小时时用用 0.9%0.9%无无 菌菌 氯氯 化化 钠钠 溶溶 液液 制制 成成 每每 1ml1ml含含 菌菌 数数 为为 1010～～100cfu100cfu的菌悬液。
的菌悬液 验证方法〔1〕试验组 取规定量供试液及10~100cfu试验菌参加增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查如常规法取10ml供试液加1ml菌液参加增菌培养基当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中 §〔2阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌阴性对照菌不得检出 §〔2阴性菌对照组§如常规法作大肠埃希菌检查：取无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml及金黄色葡萄球菌菌液1ml参加100ml胆盐乳糖培养基中，按大肠埃希菌检查法进行检查 §结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌假设试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；假设试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证 检查法 供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行。
供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行阳阳性性对对照照试试验验 进进行行供供试试品品控控制制菌菌检检查查时时，，应应做做阳阳性性对对照照试试验验阳阳性性对对照照试试验验的的加加菌菌量量为为10~100cfu10~100cfu，，方方法法同同供供试试品品的的控控制制菌菌检检查查阳阳性对照试验应检出相应的控制菌性对照试验应检出相应的控制菌阴性对照试验阴性对照试验 取稀释液取稀释液10ml10ml照相应控制菌检照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照阴性对照应无菌生查法检查，作为阴性对照阴性对照应无菌生长 举例 一一.六味地黄丸微生物限度检查法六味地黄丸微生物限度检查法§检验方法检验方法 §取本品10g，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，使分散均匀，作为1：10供试液；取供试液按常规法测定细菌数、霉菌及酵母菌数，并进行控制菌和大肠菌群检查 § §方法说明方法说明方法说明方法说明§ §六味地黄丸处方为熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、六味地黄丸处方为熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、六味地黄丸处方为熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、六味地黄丸处方为熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻，均没有明显抑菌作用。
验证实验中，采用常规法测定泽泻，均没有明显抑菌作用验证实验中，采用常规法测定泽泻，均没有明显抑菌作用验证实验中，采用常规法测定泽泻，均没有明显抑菌作用验证实验中，采用常规法测定5 5株验证菌株〔枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希株验证菌株〔枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希株验证菌株〔枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希株验证菌株〔枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉〕的回收率，均符合要求，故进行菌、白色念珠菌和黑曲霉〕的回收率，均符合要求，故进行菌、白色念珠菌和黑曲霉〕的回收率，均符合要求，故进行菌、白色念珠菌和黑曲霉〕的回收率，均符合要求，故进行细菌、霉菌及酵母菌计数时可采用常规法测定对于控制菌细菌、霉菌及酵母菌计数时可采用常规法测定对于控制菌细菌、霉菌及酵母菌计数时可采用常规法测定对于控制菌细菌、霉菌及酵母菌计数时可采用常规法测定对于控制菌和大肠菌群检查，采用大肠埃希菌为对照，与不加供试液的和大肠菌群检查，采用大肠埃希菌为对照，与不加供试液的和大肠菌群检查，采用大肠埃希菌为对照，与不加供试液的和大肠菌群检查，采用大肠埃希菌为对照，与不加供试液的阳性对照比较，生长正常，故控制菌和大肠菌群检查亦可按阳性对照比较，生长正常，故控制菌和大肠菌群检查亦可按阳性对照比较，生长正常，故控制菌和大肠菌群检查亦可按阳性对照比较，生长正常，故控制菌和大肠菌群检查亦可按常规法检验。
常规法检验常规法检验常规法检验§ §本卷须知本卷须知本卷须知本卷须知§ §用于检验的供试品应按药典规定取自至少两个独立包装，取用于检验的供试品应按药典规定取自至少两个独立包装，取用于检验的供试品应按药典规定取自至少两个独立包装，取用于检验的供试品应按药典规定取自至少两个独立包装，取样前混匀，供试品须经研磨、匀浆等方法尽量分散均匀样前混匀，供试品须经研磨、匀浆等方法尽量分散均匀样前混匀，供试品须经研磨、匀浆等方法尽量分散均匀样前混匀，供试品须经研磨、匀浆等方法尽量分散均匀 二、非水溶性供试品〔含凡士林基质及乳膏剂〕供试液制备§ §1 1、样品：红霉素软膏、样品：红霉素软膏§ §2 2、薄膜过滤法：取供试品、薄膜过滤法：取供试品10g10g，加至，加至20ml20ml十四烷酸异丙酯〔十四烷酸异丙酯〔必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量〕，充分振摇，使供试必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量〕，充分振摇，使供试品溶解然后参加品溶解然后参加45℃45℃左右的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液左右的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml100ml，振摇，振摇5-105-10分钟，萃取后，静置使油水明显分层，取分钟，萃取后，静置使油水明显分层，取其水层为其水层为1 1：：1010的供试液的供试液§ § 3 3、取供试液、取供试液1ml1ml注入开放式滤器，用冲洗液冲洗滤膜，每次注入开放式滤器，用冲洗液冲洗滤膜，每次冲洗量为冲洗量为100ml100ml，消除抗菌作用后，取出滤膜贴于规定的琼，消除抗菌作用后，取出滤膜贴于规定的琼脂平板，置规定温度培养脂平板，置规定温度培养24-7224-72小时，逐日观察结果小时，逐日观察结果§ §4 4、阳性对照：薄膜过滤法以最后一次的冲洗液参加试验菌、阳性对照：薄膜过滤法以最后一次的冲洗液参加试验菌 三三.双黄连口服液微生物限度检查法双黄连口服液微生物限度检查法 §细菌数测定细菌数测定 §取本品原液，加无菌氯化钠取本品原液，加无菌氯化钠- -蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液100ml100ml，，使分散均匀，采用薄膜过滤法，滤过，以无菌氯化使分散均匀，采用薄膜过滤法，滤过，以无菌氯化钠钠- -蛋白胨缓冲液冲洗滤膜〔约蛋白胨缓冲液冲洗滤膜〔约100ml/100ml/次，冲洗次，冲洗3 3次次〕，测定细菌数。
以金黄色葡萄球菌〕，测定细菌数以金黄色葡萄球菌[CMCC[CMCC〔〔B B〕〕26 26 003]003]为阳性对照为阳性对照§霉菌及酵母菌数测定霉菌及酵母菌数测定§取本品原液，按常规法测定霉菌及酵母菌数取本品原液，按常规法测定霉菌及酵母菌数§控制菌检查控制菌检查§取本品原液取本品原液1ml1ml参加参加100ml100ml胆盐乳糖增菌液，按常规胆盐乳糖增菌液，按常规法测定 §本品对金黄色葡萄球菌较敏感，实验中为保证结果本品对金黄色葡萄球菌较敏感，实验中为保证结果的准确性，可以增加金黄色葡萄球菌作为阳性对照，的准确性，可以增加金黄色葡萄球菌作为阳性对照，如阳性菌能正常生长，说明冲洗等操作正确如阳性菌能正常生长，说明冲洗等操作正确 §对于控制菌检查，虽然本品对大肠埃希菌具有一定对于控制菌检查，虽然本品对大肠埃希菌具有一定抑菌活性，但取原液抑菌活性，但取原液1ml1ml参加参加100ml100ml胆盐乳糖增菌液胆盐乳糖增菌液〔〔1 1：：100100倍稀释〕后，再参加倍稀释〕后，再参加1010～～100cfu100cfu大肠埃希大肠埃希菌，与不加供试液的阳性对照比较，生长正常，故菌，与不加供试液的阳性对照比较，生长正常，故控制菌检查仍可按常规法检验。
控制菌检查仍可按常规法检验 四四. 培养基稀释法微生物限度检查培养基稀释法微生物限度检查 §控制菌检查控制菌检查§取取1:10供试液供试液10ml，加至，加至100ml 45℃℃ 0.1%无菌蛋白胨水溶液中，混匀，全量通过薄膜无菌蛋白胨水溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以后，以45℃℃ 0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜〔约〔约100ml/次，冲洗次，冲洗3次〕，取膜至含次〕，取膜至含2mlβ-内酰胺酶的胆盐乳糖增菌培养基〔内酰胺酶的胆盐乳糖增菌培养基〔100ml/瓶瓶〕中，检查控制菌以大肠埃希菌〕中，检查控制菌以大肠埃希菌[CMCC〔〔B〕〕44 102]为阳性对照为阳性对照 革兰染色、镜检革兰染色、镜检•操作步骤•制片-过火固定，防止水冲，破坏细胞结构使染料易透过• 结晶紫染色-1分•碘液媒染-1分•乙醇脱色-30秒•沙黄复染-30秒 染色结果•革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作质控株 革兰染色本卷须知•玻片必须洁净•涂片菌量宜少，菌不可浓•新鲜培养物•脱色是关键 革兰染色意义• 初步识别细菌，利于进一步鉴定•初步选择治疗用药物•与致病性相关，阳性以外毒素为主，阴性菌以内毒素为主 一、大肠埃希菌检查法 •对照用菌液对照用菌液对照用菌液对照用菌液•菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ〔Ｂ〕菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ〔Ｂ〕菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ〔Ｂ〕菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ〔Ｂ〕44102441024410244102］］］］•对照菌液参加量：含菌对照菌液参加量：含菌对照菌液参加量：含菌对照菌液参加量：含菌50505050～～～～100100100100菌落形成单位的控菌落形成单位的控菌落形成单位的控菌落形成单位的控制菌菌液制菌菌液制菌菌液制菌菌液•制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml5ml5ml5ml营养肉汤培养基内，营养肉汤培养基内，营养肉汤培养基内，营养肉汤培养基内，36±1℃36±1℃36±1℃36±1℃培养培养培养培养18181818～～～～24h24h24h24h后，用后，用后，用后，用％无菌氯化钠溶液稀释至％无菌氯化钠溶液稀释至％无菌氯化钠溶液稀释至％无菌氯化钠溶液稀释至1 1 1 1：：：：106106106106•其用途：其用途：其用途：其用途：•做阳性对照做阳性对照做阳性对照做阳性对照•检查培养基灵敏度检查培养基灵敏度检查培养基灵敏度检查培养基灵敏度 操作步骤•增菌培养增菌培养增菌培养增菌培养•取胆盐乳糖〔ＢＬ〕培养基取胆盐乳糖〔ＢＬ〕培养基取胆盐乳糖〔ＢＬ〕培养基取胆盐乳糖〔ＢＬ〕培养基3 3 3 3瓶，每瓶各瓶，每瓶各瓶，每瓶各瓶，每瓶各100ml100ml100ml100ml•2 2 2 2瓶分别参加规定量的供试液，其中瓶分别参加规定量的供试液，其中瓶分别参加规定量的供试液，其中瓶分别参加规定量的供试液，其中1 1 1 1瓶参加含对瓶参加含对瓶参加含对瓶参加含对照菌照菌照菌照菌50505050～～～～100100100100个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性对照，第对照，第对照，第对照，第3 3 3 3瓶参加与供试液等量的稀释剂作阴性对瓶参加与供试液等量的稀释剂作阴性对瓶参加与供试液等量的稀释剂作阴性对瓶参加与供试液等量的稀释剂作阴性对照照照照•37℃37℃37℃37℃培养培养培养培养18181818～～～～24h24h24h24h〔必要时可延至〔必要时可延至〔必要时可延至〔必要时可延至48h48h48h48h〕。
阴性对〕阴性对〕阴性对〕阴性对照应无菌生长摇匀上述照应无菌生长摇匀上述照应无菌生长摇匀上述照应无菌生长摇匀上述BLBLBLBL增菌培养液增菌培养液增菌培养液增菌培养液 MUG试验原理•4-甲基伞形酮葡糖苷酸〔MUG〕试验的原理MUG被β-葡糖苷酸酶〔GUD〕水解，产生荧光•实验证明96％的大肠杆菌含GUD，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG，靛基质试验结合，用EMB琼脂平板别离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99％•由于荧光反响的敏感度较颜色反响强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测•MUG阳性〔有荧光〕、靛基质阳性〔玫瑰红色〕,MUG阴性〔无荧光〕、靛基质阴性〔无色〕•如MUG、I试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与I试验不一致时，那么需别离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别 MUG试验操作•以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液各，分别参加MUG培养基，37℃培养5、24h后，将各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后加靛基质试液4～5滴于上述MUG管内，观察液面颜色 结果观察•取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。
供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置〔阴性管居中〕，适当倾斜试管如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管 MUG与靛基质试验结果判定•如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24h，观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆菌菌落生长当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品别离平板无菌落生长，或有菌落但不同于下表所列特征，可判为供试品1g或1ml未检出大肠杆菌 大肠杆菌在不同培养基上菌落形态特征 培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽麦康凯琼脂典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色•当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、IMViC试验 疑似菌落的挑选•如生长菌落与上表所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的外表中心，沾取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18～24h，作检查•无单个可疑菌落，但有可疑菌团〔紫黑色，或有金属光泽〕，应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，培养18～24h，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下革兰染色、镜检以及生化试验 乳糖发酵试验•操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24～48h，观察产酸〔指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色〕，产气〔小倒管内有气泡，气泡无论大小〕•假阴性的处理：为防止缓慢发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5％乳糖发酵管。
绝大多数缓慢发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性或适当延长培养时间 靛基质试验〔I〕•操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24～48h，沿管壁参加欧－波试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性•阴性培养物的进一步检查：一般24h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24h，作试验 甲基红试验〔Ｍ〕•操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养液中参加甲基红指示液2～3滴〔约每ml培养液加指示液1滴〕，轻微摇动，立即观察•结果观察：呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性 乙酰甲基甲醇生成试验〔V-P〕•操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于2ml培养液中参加α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40％氢氧化钾试液，充分振摇，在4h〔通常在30min〕内观察结果•结果观察：出现红色应判为阳性，无红色反响为阴性 枸橼酸盐利用试验〔C〕•操作：取营养琼脂斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2～4天•结果观察：培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性•本卷须知：枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2天，根据试验资料，发现培养3天后，枸橼酸盐利用试验产生阳性。
仅培养2天是不够的，故试验培养时间改为2～4天 结果判断• 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性，供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告lg或1ml供试品检出大肠杆菌MUG阴性、靛基质阴性，报告lg或1ml供试品未检出大肠杆菌• MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为-+--、革兰阴性杆菌，报告lg或1ml供试品检出大肠杆菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为++--、革兰阴性杆菌，报告lg或1ml供试品检出大肠杆菌•供试品培养物检查不符合上述二项中的任一项，报告lg或1ml供试品未检出大肠杆菌n n当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不能作出检验报告肠杆菌，不能作出检验报告 IMViC试验的顺序•以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果 大肠菌群的检查•大肠菌群的检查与大肠杆菌有相似之处，应当将分纯的菌种进行大量的生化试验来区分菌种利用乳糖产酸产气者进行进一步鉴别 大肠菌群菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。
麦康凯琼脂呈鲜桃红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润•菌落疑似者再进行确证试验•菌落接种到胆盐乳糖发酵管，产酸产气报告检出大肠菌群，否那么判未检出 大肠菌群数的推算各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数N（cfu/g(ml)0.1g(0.1ml)0.01g(0.01ml)0.001g(0.001ml) + + +>103 + + -102
阳性对照管应呈现混浊 别离培养•轻微摇动供试品增菌培养瓶和阳性对照增菌培养瓶，以接种环分别沾取1～2环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝(EMB)琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24～48h检查平板上有无疑似沙门菌菌落 沙门菌在别离平板上的菌落形态特征见表平板沙门菌属亚属ⅠⅡⅣⅤ沙门菌亚属Ⅲ胆盐硫乳琼脂(DHL)无色或微带橙色，透明或半透明，边缘整齐、光滑、中等大小或较小，产H2S的菌落中心或几乎全黑色发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，中心带黑色，迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株菌落与亚属ⅠⅡⅣⅤ同沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)无色或微带粉色，透明或半透明，边缘整齐、光滑，中等大小或较小，产H2S的菌落，中心呈黑色同一平板上常有多数菌落无黑色中心同胆盐硫乳琼脂平板但发酵乳糖无黑色中心的菌落与大肠埃希菌不能区别曙红亚甲蓝琼脂(EMB)无色或微带橙色，透明或半透明，中等大小，边缘整齐光滑发酵乳糖的菌株菌落为紫色迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属ⅠⅡⅣⅤ同麦康凯琼脂(MacC)同曙红亚甲蓝琼脂平板发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属ⅠⅡⅣⅤ同 菌落特征补充•由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显•在SS琼脂平板上，H2S特征有时不明显，沙门菌属亚属Ⅲ因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心•在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别•阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否那么，应查明原因。
假设为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分影响后再行检查•由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意区分 菌落传纯•从每个供试品的别离平板上挑取2～3个疑似菌落(无色或微带橙色，产H2S的菌落；无色或微带橙色、不产H2S的菌落；红色，产H2S的菌落)分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面〔或者克氏双糖铁琼脂斜面，制备可以查阅相关工具书〕并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养24±2h，观察结果 三糖铁琼脂反响•疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反响•①斜面红色(产碱)，底层黑色(产H2S)并显示黄色(产酸)；•②斜面红色，底层黄色；•③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色•多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种•对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌•疑似沙门菌，应取三糖铁琼脂斜面得培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验确认是否为沙门菌 三、铜绿假单胞菌检查法 •对照用菌液对照用菌液•铜绿假单胞菌〔铜绿假单胞菌〔CMCC (B) CMCC (B) 1010410104〕〕•营养琼脂斜面培养物少许，接营养琼脂斜面培养物少许，接种至种至5ml5ml营养肉汤培养基内，于营养肉汤培养基内，于36±1℃36±1℃培养培养1818～～24h24h后，用后，用0.9%0.9%无菌氯化钠溶液稀释至无菌氯化钠溶液稀释至1 1：：106106，使对照菌参加量含，使对照菌参加量含5050～～100100个个cfu (cfu (一般用量为一般用量为0.1ml)0.1ml)，菌数在做阳性对照实验的同，菌数在做阳性对照实验的同时用营养琼脂平板涂布经培养时用营养琼脂平板涂布经培养后计数确定后计数确定 增菌培养•取胆盐乳糖培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别参加1：10供试液10ml(相当于供试品1g或1ml)，其中一瓶参加含对照菌50～100个菌落形成单位的菌液作为阳性对照。
第3瓶参加与供试液等量的稀释剂作阴性对照•36±1℃培养18～24h(必要时可延至48h) 别离培养•增菌培养液1～2环 (如有菌膜应挑取之)，划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板•于36±1℃培养18～24h•铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株菌落还有粗糙型和粘液型等，应注意挑选•当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品平板无菌落生长或无疑似菌落生长，可报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌当阳性对照平板无菌落生长或生长菌落经检查不是铜绿假单胞菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响 纯培养•供试品别离平板生长上述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的外表中心，沾取培养物，应挑取2～3个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养，作以下检查 初步鉴别试验•革兰染色镜检铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列•氧化酶试验：铜绿假单胞菌呈阳性•绿脓菌素试验:铜绿假单胞菌呈阳性 结果报告•供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌•供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐复原产气试验、41℃生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌•凡与上述结果不符时报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌 四、金黄色葡萄球菌检查法 •对照用菌液对照用菌液•金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌［［CMCC(B)26003CMCC(B)26003］］•营养琼脂斜面新鲜培养物少许，营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至接种至5ml5ml营养肉汤培养基中，营养肉汤培养基中，36℃±1℃36℃±1℃培养培养1818～～24h24h，用，用0.9%0.9%无菌氯化钠溶液，按无菌氯化钠溶液，按1010倍倍递增稀释至递增稀释至1 1：：106106，参加含，参加含5050～～100100个个cfucfu的对照菌菌液的对照菌菌液( (一般一般用量为用量为1 1：：106 0.1ml)106 0.1ml)，同时用，同时用营养琼脂平板计数营养琼脂平板计数 增菌培养•取营养肉汤(或亚碲酸钠肉汤)培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别参加10ml供试液，其中1瓶参加含50～100个cfu的对照菌菌液作为阳性对照，第3瓶参加与供试液等量的0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为阴性对照•置36℃±1℃培养18～24h(必要时可延至48h) 别离培养•将上述供试品增菌培养液及阳性对照增菌液轻轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置36℃±1℃培养24～72h。
当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品别离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于所列特征，可报告为1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌•当供试品别离平板生长菌落与表1所列特征相似的典型形态，应挑取该菌落作纯培养，对非典型形态的菌落，可增加血琼脂平板别离鉴别金黄色葡萄球菌在三种选择性培养基上菌落形态特征见下表 金黄色葡萄球菌在三种选择性培养基上菌落形态特征 培养基菌落形态特征卵黄氯化纳琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈，菌落直径1～2mm甘露醇氯化纳琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环，菌落直径0.7～1mm 血琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有溶解红细胞后产生的透明溶血环，菌落直径较大，2～4mm 纯培养•当供试品别离平板生长菌落与表中所列菌落特征相似或疑似时，应选取2～3个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心外表培养物，接种于营养琼脂斜面上，于36℃±1℃培养18～24h，取其培养物作革兰染色、镜检及血浆凝固酶试验 初步鉴别试验：•3.4.1 革兰染色、镜检金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，一般不产生荚膜。
排列呈不规那么的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列 血浆凝固酶试验•取无菌试管(10×100mm)3支，各参加血浆：0.9%无菌氯化钠溶液(1：，1支参加被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液，其余2支作对照管：1支参加金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］营养肉汤培养液或菌悬液作为阳性对照；另一支参加营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液作阴性对照三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h检查时，轻轻将试管倾斜，(动作勿大)仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反响；不凝固为阴性反响阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验 结果判断•当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验呈阳性结果，供试品培养物按以下情况报告或处理：•5.1 革兰阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性反响者，报告1g或1ml供试品检出金黄色葡萄球菌〔少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种〕•5.2 革兰染色镜检不是革兰阳性球菌，或血浆凝固酶试验阴性反响，报告1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌•阴性对照有菌生长或阳性对照试验呈阴性结果，试验结果无效 本卷须知本卷须知•金黄色葡萄球菌在上述三种别离培养基上的典型菌落为金黄色。
但由于受药物影响或非典型菌株存在，亦可呈橙黄色、柠檬色或白色•做控制菌检查，对非典型菌落也有必要进行凝固酶试验做金黄色葡萄球菌的筛查，以防漏检金黄色葡萄球菌•培养基存放时间和培养时间影响色素产生，故培养基应新鲜配制培养时间宜48h以上 谢谢！ 。