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1、6h第十六章第十六章抗生素类药物的分析抗生素类药物的分析The Analysis of Antibiotic drugs青霉素的发现者是英国细菌学家弗莱明。青霉素的发现者是英国细菌学家弗莱明。19281928年的一天，年的一天，弗莱明弗莱明在他的一间简陋在他的一间简陋的实验室里研究导致人体发热的的实验室里研究导致人体发热的葡萄球菌葡萄球菌。由于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的由于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的琼脂琼脂上附了一层上附了一层青霉菌青霉菌。这是从楼上的一。这是从楼上的一位研究位研究青霉菌青霉菌的学者的窗口飘落进来的。的学者的窗口飘落进来的。使弗莱明感到惊讶的是，在使弗莱明感到惊讶的
2、是，在青霉菌的近旁，青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不见葡萄球菌忽然不见了。这个偶然的发现深深了。这个偶然的发现深深吸引了他，他设法培养这种霉菌进行多次吸引了他，他设法培养这种霉菌进行多次试验，试验，证明青霉素可以在几小时内将葡萄证明青霉素可以在几小时内将葡萄球菌全部杀死。球菌全部杀死。 葡萄球菌葡萄球菌来源来源发酵、半合成发酵、半合成发酵提、纯 本章内容本章内容第一节概述第一节概述第二节第二节 - -内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析第三节第三节 氨基糖苷类抗生素的分析氨基糖苷类抗生素的分析第四节第四节 四环素类抗生素的分析四环素类抗生素的分析第五节第五节 抗生素类药物中高分子杂质抗生素类药
3、物中高分子杂质 的检查的检查1.1.纯度较低：纯度较低： 三多（同系物、异构体、降解物或三多（同系物、异构体、降解物或聚合物聚合物）2.2.活性组分的变异活性组分的变异( (组成或比例组成或比例) )：3.3.多数不稳定：多数不稳定：一、抗生素自身的一、抗生素自身的特点特点第一节概述第一节概述【检查检查】【含量测定含量测定】【性状性状】【鉴别鉴别】二、二、 抗生素抗生素分析分析的的特点特点来源来源发酵、半合成、发酵、半合成、全合成全合成原料药定量原料药定量生物学法生物学法( (管碟法管碟法) )HPLC【含量测定含量测定】RS生物学法生物学法( (管碟法管碟法) )： 1.1.水分测定水分测定
4、: : 2.2.有机溶剂残留量有机溶剂残留量 （一）（一）一般杂质检查：一般杂质检查： 【检查检查】 3.3.安全性检查：安全性检查：生物试验生物试验无菌：无菌： 检查药品中有无杂菌污染检查药品中有无杂菌污染（+）（-）细菌内毒素细菌内毒素(引起热原反应的主要物质)：鲎G-分子分子（+）（-）L=？热源热源: : 控制药品中的致热杂质控制药品中的致热杂质降压：降压： 检查有降压作用的杂质检查有降压作用的杂质毒性试验毒性试验: : 控制药品中的毒性杂质控制药品中的毒性杂质 （二）（二）特殊杂质检查：特殊杂质检查： 【检查检查】晶体检查：晶体检查：IRIR、X-X-射线衍射法、射线衍射法、DTAD
5、TA 已知杂质已知杂质有关物质有关物质高分子聚合物高分子聚合物-内酰胺内酰胺大环内酯大环内酯氨基糖苷氨基糖苷四环素四环素三、抗生素的三、抗生素的分分 类类 1. 1. - -内酰胺类抗生素的结构与性质内酰胺类抗生素的结构与性质第二节第二节 - -内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析3.3.【含量测定含量测定】： R-HPLC R-HPLC阴离子对试剂，离子抑制剂、扫尾剂阴离子对试剂，离子抑制剂、扫尾剂4. 4. 【检查检查】：水分测定、：水分测定、晶型检查晶型检查3. 3. 原料药与制剂分析异同原料药与制剂分析异同物理常数、含量测定、有关物质检查检测波长为何不同？物理常数、含量测定、有关物
6、质检查检测波长为何不同？2. 2. 【鉴别鉴别】：羟肟酸铁反应、茚三酮反应：羟肟酸铁反应、茚三酮反应本章内容本章内容& &要求要求青霉素青霉素类类头孢头孢菌素类菌素类碳青霉烯类碳青霉烯类亚胺培南亚胺培南RH 美洛培南美洛培南RCH3一、一、 结构与代表性药物结构与代表性药物 酸性酸性 有羧基，具有酸性有羧基，具有酸性 pKapKa值在值在2.52.52.82.8之间之间 与碱成盐与碱成盐 如：如：青霉素青霉素G G钠、青霉素钠、青霉素G G钾等钾等二、二、 - -内酰胺类抗生素的主要性质内酰胺类抗生素的主要性质 旋光性：旋光性： 青青霉霉素素类类母母核核没没有有共共轭轭系系统统，没有紫外吸收。
7、没有紫外吸收。 侧侧链链中中有有苯苯环环取取代代基基的的药药，在紫外区也有吸收。在紫外区也有吸收。紫外吸收紫外吸收有共轭体系：有共轭体系：（O OC CN NC CC C）在在260260nmnm处有最大吸收。处有最大吸收。无共轭体系，无紫外吸收。无共轭体系，无紫外吸收。氨苄西林氨苄西林阿莫西林阿莫西林 IR显色反应：显色反应：羟肟酸铁反应羟肟酸铁反应各种盐的鉴别各种盐的鉴别硫酸及硫酸硫酸及硫酸- -甲醛反应甲醛反应硫酸硫酸- -变色酸反应变色酸反应与茚三酮反应：与茚三酮反应：氨基酸结构氨基酸结构1.1.不不能产生羟肟酸铁反应的化合物（）能产生羟肟酸铁反应的化合物（）单选题单选题A. B. C
8、. D. 2.2. 能与茚三酮试液反应的化合物（）能与茚三酮试液反应的化合物（）A. B. C. D. 氨苄西林氨苄西林阿莫西林阿莫西林3.IR头孢克洛及其片剂检验头孢克洛及其片剂检验（ChP2015二部）显色剂？显色剂？色谱条件：色谱条件：离子对试剂？离子对试剂？离子抑制剂？离子抑制剂？扫尾剂？扫尾剂？分离度？分离度？P421P417-420要求：要求：1. 1. 分别写出分别写出Ch.pCh.p与与USPUSP色色谱条件与系统适用性试验要求。谱条件与系统适用性试验要求。2. 2. Ch.p系统适用性试验加系统适用性试验加头孢克洛头孢克洛-3异构体目的？异构体目的？3. USA3. USA流
9、动相加戊烷磺酸钠与三乙胺的目的？流动相加戊烷磺酸钠与三乙胺的目的？ 【含量测定含量测定】例：头孢克洛的含量测定例：头孢克洛的含量测定（P P421421）1.色谱条件：色谱条件：固定相：固定相：流动相：流动相：检测器：检测器：ChP：C18PH3.4磷酸二氢钾缓冲液磷酸二氢钾缓冲液-乙腈乙腈（92:8）UV-254nm固定相：固定相：流动相：流动相：检测器：检测器：USP：PH2.50.1,戊烷磺酸钠戊烷磺酸钠- -三乙胺三乙胺- -甲醇甲醇C18UV-254nmH+2.系统适用性试验：系统适用性试验：n、R、T、RSD对照品对照品3.测定法：测定法：（按无水物计（按无水物计95.0%）R R
10、S S小结：小结： - -内酰胺类抗生素的含量测定内酰胺类抗生素的含量测定R-HPLC离子抑制剂离子抑制剂离子对试剂离子对试剂扫尾剂扫尾剂（三乙胺、乙腈等）（三乙胺、乙腈等）R？入？入？头孢克洛及其片剂检验头孢克洛及其片剂检验（ChP2015二部）容量分析？容量分析？P421P417-420264nm264nm254nm254nm（等度）（等度）220nm220nm（梯度）（梯度）264nm(UV)264nm(UV)第一法：费休氏法第一法：费休氏法【检查检查】：水分：水分（3.0%6.5%）ChP（2015）四部第二法：烘干法第二法：烘干法第三法：减压干燥法第三法：减压干燥法第四法：甲苯法第四
11、法：甲苯法第五法：第五法：GC（热导检测器）计算：计算：反应式：反应式：滴定管：滴定管：溶剂：溶剂：CH3OH(V-V0)T1935 Karl Fischer结晶水、吸附水、游离水第一法：费休氏法第一法：费休氏法（P127 ）非水滴定法：非水滴定法：青霉素青霉素V V钾及其片剂检验钾及其片剂检验（ChP2015二部）268nm268nm268nm268nm溶解度溶解度总论？总论？P417-420268nm268nm第一法：第一法：偏光显微镜法偏光显微镜法第二法：第二法：X-X-射线粉末衍射法射线粉末衍射法文献：文献：DTADTA、 IR IR 、拉曼、拉曼 【检查检查】：结晶性：结晶性ChP（
12、2015）四部：双折射现象双折射现象第一法：第一法：偏光显微镜法偏光显微镜法2dhklsin=n第二法：第二法：X-X-射线粉末衍射法射线粉末衍射法例例:氨苄西林的氨苄西林的X射线衍射图射线衍射图例：例：氨苄西林不同晶型氨苄西林不同晶型的的DTADTA曲线：曲线：晶型晶型1 1晶型晶型2 2晶型晶型1 1 DTA甲苯咪唑中晶型的检查甲苯咪唑中晶型的检查RSP112图图3-3 IRIRAR640AR662AS640AS662规定：规定：青霉素青霉素V V钾及其片剂检验钾及其片剂检验（ChP2015二部）溶解度溶解度P417P417，第五节？第五节？P417-420 本章内容本章内容第一节概述第一
13、节概述第二节第二节 - -内酰胺类抗生素的分析内酰胺类抗生素的分析第三节第三节 氨基糖苷类抗生素的分析氨基糖苷类抗生素的分析第四节第四节 四环素类抗生素的分析四环素类抗生素的分析第五节第五节 抗生素类药物中高分子杂质抗生素类药物中高分子杂质 的检查的检查三、控制（三、控制（检查）方法检查）方法一、一、定义、毒副作用定义、毒副作用第五节第五节 抗生素类药物中高分子杂质的检查抗生素类药物中高分子杂质的检查二、来源与分类及结构二、来源与分类及结构一、一、定义及毒副作用定义及毒副作用致敏致敏M：100010000分子量大于药物本身的杂质总称分子量大于药物本身的杂质总称定义：定义：毒副作用：毒副作用：
14、-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素青霉素族青霉素族1.外源性外源性二、来源与分类及结构二、来源与分类及结构2.内源性内源性.外源性杂质：外源性杂质：发酵过程引入的蛋白、多肽、多糖与发酵过程引入的蛋白、多肽、多糖与抗生素结合产生高分子产物，如抗生素结合产生高分子产物，如青霉噻唑多肽等。青霉噻唑多肽等。2.2. 内源性杂质：内源性杂质：青霉素族聚合物青霉素族聚合物羧苄羧苄青霉素青霉素氨苄氨苄青霉素青霉素三、控制（三、控制（检查）方法检查）方法A.C18B.C8C.硅胶硅胶D.凝胶凝胶1.固定相：固定相：2.分离机理：分离机理：A.键合色谱键合色谱B.离子色谱离子色谱C.分子排阻色谱分子排阻色谱D.吸附
15、色谱吸附色谱HPLC凝胶（亲水凝胶）凝胶（亲水凝胶）1 1、测定成分：、测定成分：2 2、固定相：、固定相：3 3、流动相：、流动相：4 4、检测器：、检测器：5 5、分离机理：、分离机理：6、出柱顺序：出柱顺序：大分子大分子分子排阻色谱法分子排阻色谱法大分子、小分子大分子、小分子3.色谱条件与分离机制色谱条件与分离机制水溶液或缓冲液水溶液或缓冲液UV4.检测方法检测方法自身对照自身对照外标法外标法主成分自身对照法（主成分自身对照法（L）面积归一化法（面积归一化法（P）限量法（限量法（L）例例: :青霉素青霉素V V钾中青霉素钾中青霉素V V聚合物的检查聚合物的检查(P(P418418) )1
16、. 写出色谱条件。写出色谱条件。2. 系统适用性试验中加蓝色葡聚糖系统适用性试验中加蓝色葡聚糖2000的目的？的目的？3.分别写出供试溶液与对照溶液中样品是什么？分别写出供试溶液与对照溶液中样品是什么？4.用、两种流动相的目的？用、两种流动相的目的？5.画出供试溶液与对照溶液可能输出画出供试溶液与对照溶液可能输出HPLC图谱。图谱。6. 自身对照外标法与主成分自身对照法的主要区别？自身对照外标法与主成分自身对照法的主要区别？7.有时在流动相中加入适量葡萄糖或甘氨酸，为什么？有时在流动相中加入适量葡萄糖或甘氨酸，为什么？问题：问题：抑制抑制抑制抑制剂剂剂剂1.色谱条件：色谱条件：固定相：固定相：
17、流动相：流动相：检测器：检测器：2.系统适用性试验系统适用性试验：RSD 5.0%( (对照液对照液) )葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-10A磷酸盐缓冲磷酸盐缓冲液液B水水UV-254nmR(a/b)2.0%( (样品样品) )蓝色蓝色葡聚糖葡聚糖2000：蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖2000： tR(A)/ tR(B)：0.931.07tR(s)/tR(蓝蓝) ：0.931.07n 400（蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖20002000 ）T2.0（蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖20002000 ）R：？：？3.样品测定：样品测定：（含含青霉素青霉素V V聚合物聚合物按按青霉素青霉素V V计计0.60.6%）青霉素青霉素V钾
18、样品中的钾样品中的高分子聚合物（高分子聚合物（杂质杂质）青霉素青霉素V对照品在纯对照品在纯水中形成高分子水中形成高分子缔缔合物合物小结小结自身对照自身对照外标法外标法（HPLC）2.流动相：流动相：A、B两种两种3.对照溶液对照溶液：目标物标准品临用新制目标物标准品临用新制而成的大分子缔合物。而成的大分子缔合物。5.检测结果：检测结果：定量法（外标法）定量法（外标法）4.杂质色谱峰：杂质色谱峰：所有高分子杂质为所有高分子杂质为单一单一色谱峰色谱峰1.分子排阻色谱分子排阻色谱一、阿莫西林颗粒剂服用办法（）一、阿莫西林颗粒剂服用办法（）思考题思考题A.开水冲后及时服开水冲后及时服B.凉开水冲后及时
19、服凉开水冲后及时服C.开水冲后，随时服开水冲后，随时服D.凉凉开水冲后，随时服开水冲后，随时服要求：要求：1. 1. 写出色谱条件与系统适用性试验要求。写出色谱条件与系统适用性试验要求。2. 2. 系统适用性试验调系统适用性试验调PHPH至至4.44.4的目的？的目的？3. 3. 画出标准品溶液与供试品溶液的色谱图。画出标准品溶液与供试品溶液的色谱图。4. 4. 分别写出两种成分的计算公试。分别写出两种成分的计算公试。二、二、Ch.PCh.P阿莫西林克拉维酸钾片的含量测定阿莫西林克拉维酸钾片的含量测定（P P422422）思考题思考题1.色谱条件：色谱条件：固定相：固定相：流动相：流动相：检测
20、器：检测器：C18PH4.40.1,磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液- -甲醇（甲醇（95:595:5）UV-220nm2.系统适用性试验：系统适用性试验：n、R、T、RSD标准品标准品3.测定法：测定法：（规定：（规定：90.0%120.0%）3.3.5 5三三: :头孢呋辛酯中异构体与有关物质的检查头孢呋辛酯中异构体与有关物质的检查(P(P419419) )问题：问题：1.1.写出色谱条件。写出色谱条件。2.2.写出活性成分异构体名称？写出活性成分异构体名称？3.3.写出有关物质的名称？写出有关物质的名称？4.4.标准品溶液与对照溶液有何不同？其用途分别为什么？标准品溶液与对照溶液有何不同？其用途
21、分别为什么？5.5.分别画出对照液与样品液的色谱图。分别画出对照液与样品液的色谱图。呋喃呋喃1.色谱条件：色谱条件：固定相：固定相： ODS柱柱流动相：流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵溶液磷酸二氢铵溶液-甲醇（甲醇（62：38）检测器：检测器： UV-278nm2.系统适用性试验：系统适用性试验： n、R、T、RSD3.测定测定（1）异构体测定）异构体测定（2）杂质对照品的制备杂质对照品的制备（3）有关物质检查）有关物质检查minAA头孢呋辛酯头孢呋辛酯A A、B B异构体异构体A/AB:48%55%（1）异构体）异构体头孢呋辛酯头孢呋辛酯A A、B B异构体异构体60UVBA（2）有关物质对照品的制备及保留时间）有关物质对照品的制备及保留时间杂质定位杂质定位RRminAA（3）有关物质定位）有关物质定位 1.51.5和和(1. (1. 5 5%)%) 和（和（1.0%1.0%）其它杂单其它杂单1/2和（和（0.5%）；杂总杂总3 3和（和（3.0%3.0%）（4）有关物质限量检查）有关物质限量检查
