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1、Gene Diagnosis疾病的诊断依据疾病的诊断依据u 实验室诊断技术：实验室诊断技术： 细胞学检查细胞学检查 生物化学代谢产物和酶的活性变化检查生物化学代谢产物和酶的活性变化检查 免疫学检验免疫学检验 基因诊断基因诊断u临床表现临床表现2*OpeningCeremonyofthe2008BeijingParalympicsonSep6th,2008GJB2GJB2基因基因线粒体基因突变（发生频率最高的为线粒体基因突变（发生频率最高的为A1555GA1555G突变）突变） PDSPDS基因基因Sign Language Performance: Hello Star 多数耳聋患者都是遗传所
2、致多数耳聋患者都是遗传所致We are different4*生命特征都是由遗传决定的生命特征都是由遗传决定的遗传特性是相对的，而变异是绝对的遗传特性是相对的，而变异是绝对的5*几乎所有的疾病都与基因改变有关几乎所有的疾病都与基因改变有关Disease6*? ? ? ? ?7*一致的遗传信息一致的遗传信息一致的表型？一致的表型？英国同卵双胞胎命运迥然不同英国同卵双胞胎命运迥然不同*8奥利维亚和伊莎贝拉奥利维亚和伊莎贝拉相同的基因型相同的基因型相同的基因型相同的基因型 不同的表现型不同的表现型不同的表现型不同的表现型 基因表达模式基因表达模式基因表达模式基因表达模式9 9表观遗传学表观遗传学9*
3、表观遗传学的研究内容表观遗传学的研究内容概 述l基因转录后的调控基因转录后的调控u基因组中非编码基因组中非编码RNARNAu微小微小RNARNA（miRNAmiRNA）u反义反义RNARNAu内含子、核糖开关等内含子、核糖开关等l基因选择性转录表达基因选择性转录表达的调控的调控uDNADNA甲基化甲基化u基因印记基因印记u组蛋白共价修饰组蛋白共价修饰u染色质重塑染色质重塑10*主要内容主要内容基因诊断的概念基因诊断的概念基因诊断技术基因诊断技术基因诊断的应用基因诊断的应用基因诊断的定义基因诊断的定义 采用分子生物学方法（采用分子生物学方法（核酸分子杂交核酸分子杂交、PCRPCR等技术）在等技术
4、）在基因基因（DNADNA）水平）水平及及转录水平转录水平对对基因的结构基因的结构和和功能功能进行分析，从而对特定进行分析，从而对特定的疾病进行诊断，因此基因诊断至少包括的疾病进行诊断，因此基因诊断至少包括DNADNA诊断和诊断和RNARNA诊断两大部诊断两大部分。分。DNADNA诊断诊断检测特定基因的检测特定基因的DNADNA序列中所存在的点突变、缺失和插入等变异情况，及序列中所存在的点突变、缺失和插入等变异情况，及特定特定DNADNA的拷贝数。分析的拷贝数。分析静态静态的的基因结构基因结构。RNARNA诊断诊断对待测基因转录物（对待测基因转录物（RNARNA）进行定量，检测其剪接和加工的缺
5、陷，以及外）进行定量，检测其剪接和加工的缺陷，以及外显子的变异等等。分析显子的变异等等。分析动态动态的的基因表达基因表达。12*意义意义 l 逆向诊断（逆向诊断（reverse diagnosisreverse diagnosis）: : 和传统的诊断方和传统的诊断方法主要差异在于法主要差异在于直接从基因型推断表型直接从基因型推断表型，即可以越过产物，即可以越过产物（酶和蛋白质）（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出诊断直接检测基因结构而作出诊断，这样就改变，这样就改变了传统的表型诊断方式，故基因诊断又称为了传统的表型诊断方式，故基因诊断又称为逆向诊断逆向诊断（reverse diagnosis
6、reverse diagnosis） 。l症状前诊断症状前诊断l预测疾病的易感者和检测携带者预测疾病的易感者和检测携带者l产前诊断产前诊断13*基因变异致病的类型基因变异致病的类型内源基因的变异内源基因的变异l基因结构的突变基因结构的突变 点突变、插入、缺失、重排、易位点突变、插入、缺失、重排、易位l基因表达异常基因表达异常 mRNAmRNA剪接异常剪接异常外源基因的插入外源基因的插入14* 基因突变对表型的影响大致上通过以下两种主要途径而实现：基因突变对表型的影响大致上通过以下两种主要途径而实现：（一）影响其产物组成或结构（一）影响其产物组成或结构（二）影响其表达的量（二）影响其表达的量 基
7、因突变改变表达产物的基因突变改变表达产物的“质质”和和“量量”引起疾病引起疾病(一一)基因突变改变表达产物组成和结构基因突变改变表达产物组成和结构同义突变同义突变 （cosense mutationcosense mutation）: :基因突变基因突变只在非只在非关键的部位发生，如在密码子第关键的部位发生，如在密码子第3 3位由于简并性而位由于简并性而发生的并发生的并不会改变氨基酸不会改变氨基酸，也不影响其产物的生物，也不影响其产物的生物学活性和性质学活性和性质碱基置换突变碱基置换突变 17错义突变错义突变 (missense mutation) (missense mutation) :
8、:碱基置换碱基置换发生在密发生在密码子上，码子上，改变其相对应的氨基酸类改变其相对应的氨基酸类型。型。 如果被改变的氨基酸位于多肽链的关键部分，如果被改变的氨基酸位于多肽链的关键部分，如活性中心、催化中心或分子结合部位，则有可能改如活性中心、催化中心或分子结合部位，则有可能改变这一产物的生物学活性和作用，改变的程度则视具变这一产物的生物学活性和作用，改变的程度则视具体情况而定。体情况而定。*18无义突变无义突变(nonsense mutation)(nonsense mutation)：基因突变基因突变在本来不在本来不是终止密码处是终止密码处产生终止密码产生终止密码，即所谓，会使基因表，即所谓
9、，会使基因表达产生的多肽链缩短，失去或大大减弱肽链的功能。达产生的多肽链缩短，失去或大大减弱肽链的功能。*终终止止密密码码突突变变（termination termination codon codon mutationmutation）：突突变变在在原原来来终终止止密密码码处处产产生生非非终终止止密密码码，变变成成编编码码氨氨基基酸酸密密码码，叫叫做做则则其其表表达达产产物物多多肽肽链链会会延延长长，也也会失去或大大减弱正常多肽链的功能。会失去或大大减弱正常多肽链的功能。移移码码突突变变（frame-shift frame-shift mutationmutation）： 当当基基因因核核苷
10、苷酸酸序序列列插插入入或或丢丢失失1 1个个、2 2个个或或不不构构成成三三联联体体密密码码或或其其倍倍数数的的多多个个碱碱基基后后，在在插插入入或或丢丢失失部部位位后后面面的的三三联联体体密密码码会会发发生生移移码码，造造成成其其表表达达的的多多肽肽链链截截短短或或延延长长，从从而而丧丧失失或或大大大大减减弱弱正正常多肽链的功能。常多肽链的功能。碱基缺失和插入突变碱基缺失和插入突变数目变异的串联重复数目变异的串联重复(Variable number tandem repeats)20*脆性脆性x综合症就是由于三核苷酸（综合症就是由于三核苷酸（CCG）n重复序列的拷贝数增加所致重复序列的拷贝数
11、增加所致染色体易位染色体易位 （Translocation） 21*Abnornal Processing of the Globin primary RNA Transcript剪切位点的突变剪切位点的突变22* 有不少有不少疾病基因本身并无突变发生疾病基因本身并无突变发生，但，但调控调控疾病基因的基因发生了突变疾病基因的基因发生了突变，这些突变可以发挥，这些突变可以发挥正调控作用，也可以发挥负调控作用，正调控作用，也可以发挥负调控作用，其产物通其产物通过改变疾病基因的表达程度过改变疾病基因的表达程度而引起相应表型的改而引起相应表型的改变。变。 如如某某些些酶酶基基因因表表达达缺缺失失或或过
12、过量量引引起起的的遗遗传传性性疾病就是这种情况。疾病就是这种情况。(二二)基因突变改变基因表达水平基因突变改变基因表达水平uBlood samples - the most widely used source of DNA from adults.uMouthwashes or buccal scrapes - being noninvasive, they are especially favored for population screening programs. Mouthwashes yield sufficient DNA for a few dozen tests, and
13、by using whole genome amplification more extensive testing of a single sample may be possible.uChorionic villus biopsy samples - the best source of fetal DNA (better than amniocentesis specimens).uOne or two cells removed from eight-cell stage embryos, for pre-implantation diagnosis after in vitro f
14、ertilization.uHair, semen, etc. for criminal investigations.uArchived pathological specimens, for typing dead people when no DNA has been stored, or testing tumors for genetic changes. Only short sequences, 250 bp or less, can be reliably amplified from fixed tissue specimens.Samples required for ge
15、netic testing24*基因诊断的特点基因诊断的特点u高敏感性高敏感性u高特异性高特异性u适用性强适用性强u早期诊断早期诊断25*Methods and techniques used in genetic testing基因诊断的方法和技术基因诊断的方法和技术u Mutation scanning technologies (突变扫描技术突变扫描技术) 未知突变未知突变u Mutation Screening technologies （突变筛选技术（突变筛选技术 ）已知突变）已知突变u Fluorescent-energy transfer techniques 27* （荧光共振
16、能量转移）（荧光共振能量转移）Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymerase Chain Reaction Kary Banks Mullis Kary received a Nobel Prize in chemistry in 1993 Michael Smith 28*PCR简单重复序列区间扩增简单重复序列区间扩增 指数后线性扩指数后线性扩增增PCRPCR技术技术 29*in situ PCR 原位原位PCRPCR是在单细胞或组织切片上是在单细胞或组织切片上对特异的核苷酸序列进行原位对特异的核苷酸序列进行原位PCRPCR扩增扩增，再进行再进行DNAD
17、NA分子分子原位杂交原位杂交的技术的技术-细胞内基因的定位。细胞内基因的定位。 30*Nucleic Acid Hybridization 核酸分子杂交核酸分子杂交31*核酸分子杂交核酸分子杂交 ： 是指单链核酸分子是指单链核酸分子（DNADNA或或RNARNA）在特定条件）在特定条件下下, ,与另一条互补的特异与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过核酸链形成稳定双链的过程。程。 主要依据主要依据： 碱基互补、碱基互补、变性和复性变性和复性 DNADNA: :DNADNA5ATGCCGAT3TACGGC5ATGCG T A3UA C G CAUDNADNA: :RNARNA5AUGCUA C
18、GRNARNA: :RNARNA3UACGAUGC几种分子间杂交几种分子间杂交SouthernblotNorthernblotdothybridizationFISH: fluorescence in situ hybridizationNucleic Acid Nucleic Acid HybridizationHybridizationSouthern blotting Southern Southern 印迹杂交法印迹杂交法 Southern Southern 法可用于检测特异的法可用于检测特异的DNADNA序列片断序列片断等。等。 （其基本过程类似于上述（其基本过程类似于上述South
19、ernSouthern法）法） 提取提取RNARNA样本样本RNARNA变性变性琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离转移至转移至膜膜探针（标记探针（标记DNADNA或或RNARNA）与之杂交）与之杂交显影或显色显影或显色检测信检测信号。号。 NorthernNorthern法可用于检测组织细胞中法可用于检测组织细胞中总总RNARNA或或mRNAmRNA Northern blotting Northern Northern 印迹杂交法印迹杂交法Mutation scanning technology突变扫描技术突变扫描技术未知突变uComplete gene sequencing uSingl
20、e-strand conformation analysis uDenaturing gradient gel electrophoresisuHeteroduplex analysisuDenaturing High Performance Liquid Chromatography uDNA chips uGWASScanning technologies aim to find unknown mutations in candidate or known disease genes. 36*Complete gene sequencing全基因测序全基因测序 对对已知基因组序列的物种已
21、知基因组序列的物种进行进行不同个不同个体的基因组体的基因组测序，并在此基础上对个体测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。或群体进行差异性分析。 37*全基因组测序支持治愈美国双胞胎全基因组测序支持治愈美国双胞胎全基因组测序支持治愈美国双胞胎全基因组测序支持治愈美国双胞胎多巴反应性肌张力障碍多巴反应性肌张力障碍多巴反应性肌张力障碍多巴反应性肌张力障碍墨蝶呤还原酶（墨蝶呤还原酶（SPR） 38* 当当SPRSPR发生变异时，它破坏了产生多巴胺以及其他两种神经递质发生变异时，它破坏了产生多巴胺以及其他两种神经递质五羟色胺和去甲肾上腺素的细胞途径。结果意味着双胞胎不仅缺五羟色胺和去甲肾上腺素的
22、细胞途径。结果意味着双胞胎不仅缺乏多巴胺，还缺乏五羟色胺。乏多巴胺，还缺乏五羟色胺。2014年1月人类基因组测序的花费降到了1000美元Single Strand Conformation Polymorphism 单链构象多态性分析单链构象多态性分析 (SSCP)(SSCP) 单链单链DNADNA片段片段在在中性条件下中性条件下形成复杂的空间折叠构象，这形成复杂的空间折叠构象，这种立体结构种立体结构依赖其内部碱基组成依赖其内部碱基组成，当有一个碱基发生改变时，当有一个碱基发生改变时，会影响其空间构象，空间构象有差异的单链会影响其空间构象，空间构象有差异的单链DNADNA分子在聚丙分子在聚丙烯
23、酰胺凝胶中受排阻大小不同。烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。 39*Single Strand Conformation Polymorphism 单链构象多态性分析单链构象多态性分析 (SSCP)(SSCP)正常基因正常基因突变基因突变基因PCRPCR变性变性中性中性PAGEPAGE+/+ -/+-/-杂合子杂合子40*ATATCGACGCHeteroduplex Analysis 异源双链分析异源双链分析 由由突突变变和和野野生生型型D DN NA A形形成成的的异异源源杂杂合合双双链链D DN NA A在在其其错错配配处处会会形形成成一一个个凸凸起起, ,在在非非变变性性胶胶中中电电泳泳时时,
24、 ,会会产产生生与与相相应应的的同同源源双双链链D DN NA A不不同同的的迁迁移移率率, ,从从而而使使两两者者被被分分离离开开。 41*Denaturing High Performance Liqid Chromatography DHPLC,DHPLC,变性的高效液相色谱检测变性的高效液相色谱检测42*异源双链异源双链DNADNA与同源双链与同源双链DNADNA的解链特性不同，的解链特性不同，在部分变性条件下在部分变性条件下，异源双链异源双链因有错配区的因有错配区的存在而存在而更易变性更易变性，在，在色谱柱中的保留时间短色谱柱中的保留时间短于同源双链于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱
25、图中，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。表现为双峰或多峰的洗脱曲线。43*Denaturing Gradient Gel Electrophoresis( (DGGE)DGGE)变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳原理原理: :双链双链DNADNA分子在一定变性剂浓度梯度的凝胶上电泳时分子在一定变性剂浓度梯度的凝胶上电泳时, ,会会在一定的时间发生在一定的时间发生部分解链部分解链, AT, AT对较丰富的部位容易解链，错对较丰富的部位容易解链，错配的碱基部分更容易解链，导致电泳迁移率下降配的碱基部分更容易解链，导致电泳迁移率下降 当正常的当正常的DNADNA分子和发生突变的分子
26、和发生突变的DNADNA分子之间即使只有一个碱分子之间即使只有一个碱基对的差异时基对的差异时, ,也会在不同时间发生部分解链也会在不同时间发生部分解链, ,从而被分离成两从而被分离成两条带条带45*DNA变性：变性：解链解链:错配碱基错配碱基A/TG/CDGGEDGGEHighmeltingdomainLowmeltingdomainDNA变性：变性：解链解链:错配碱基错配碱基A/TG/C46* 变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳 (DGGE)(DGGE)GGGG正常正常DNADNA分子分子GGGG突变突变DNADNA分子分子PCRGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCCGGGGCCCC
27、正常正常DNADNA分子分子突变突变DNADNA分子分子凝胶电泳凝胶电泳增加变性条件增加变性条件DNA变性：变性：解链解链:错配碱基错配碱基A/TG/C47*?Gene Chip基因芯片基因芯片 基因芯片基因芯片, ,又称又称DNADNA微阵列微阵列(DNA microarray(DNA microarray），将许多特定），将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地高密度地排列的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地高密度地排列固固定定于支持物上，制成基因微于支持物上，制成基因微阵列阵列, ,样品样品 DNA / RNADNA / RNA通过通过PCRPCR扩增、扩增、体外转录等
28、技术掺入体外转录等技术掺入荧光标记荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行分子，然后按碱基配对原理进行杂杂交交，再通过荧光检测系统等对芯片进行，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描扫描，并配以计算机系统，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。信息。 可对基因序列及功能进行可对基因序列及功能进行大规模、高通量大规模、高通量地研究。地研究。48*DNA Microarray analysis of gene expressionDNA Microarray analysis of gene expressio
29、n49* Gene Chip 50*Image of a DNA MicroarrayImage of a DNA Microarray51*Microarray-based Comparative Genomic Hybridization (aCGH(aCGH(aCGH(aCGH，基于基因芯片的比较基因组杂交技术），基于基因芯片的比较基因组杂交技术），基于基因芯片的比较基因组杂交技术），基于基因芯片的比较基因组杂交技术）52*Genome-Wide Association StudiesGenome-Wide Association Studies（GWASGWAS，全基因组关联研究），全
30、基因组关联研究），全基因组关联研究），全基因组关联研究） 是指通过对大规模的群体是指通过对大规模的群体DNADNA样本进行样本进行全基因组全基因组高密高密度度遗传标记遗传标记（如（如SNPSNP或或CNVCNV等）等）分型分型，检测，检测全基因组范围的全基因组范围的遗传变异遗传变异与与可观测的性状之间可观测的性状之间的的关联关联，从而寻找与复杂疾，从而寻找与复杂疾病相关的遗传因素的研究方法。病相关的遗传因素的研究方法。53*关联研究关联研究是基于是基于群体中群体中无亲缘关系的无亲缘关系的病例组病例组和表型正常的和表型正常的对照组对照组在某一个遗传位点上会在某一个遗传位点上会出现不同的频率而设计
31、的。出现不同的频率而设计的。全基因组关联研究全基因组关联研究54* Francis Collins, 2008 Francis Collins, 2008GWASGWAS为全面系统为全面系统研究复杂疾病研究复杂疾病的遗传因素的遗传因素掀开了新的一页，为我们了解人类复杂疾掀开了新的一页，为我们了解人类复杂疾病的发病机制提供了更多的线索。病的发病机制提供了更多的线索。Mutation Screening technologies突变筛选技术突变筛选技术urestriction fragment length polymorphismuAllele-specific oligonucleotide
32、hybridization uAmplification refractory mutation systemScreening techniques aim to find known mutations, preferably with high throughput. 56*Restriction Fragment Length PolymorphismRestriction Fragment Length Polymorphism ( ( ( (RFLP, RFLP, 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 ) )限制性内切酶片段长度多态性限制性内切酶片段长度多态性RFLPRFLP：
33、该技术是利用限制性内切酶能识别：该技术是利用限制性内切酶能识别DNADNA分子的特异序列，并在特定序列处切开分子的特异序列，并在特定序列处切开DNADNA分子，对于不同种群的生分子，对于不同种群的生物个体而言，他们的物个体而言，他们的DNADNA序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的本来不是内切酶识别位点的DNADNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切
34、酶酶切该了用限制性内切酶酶切该DNADNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种酶切割不同物种DNADNA序列时，序列时，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段片段。 57*Allele II Allele II 产生了新的酶切点产生了新的酶切点 Allele IAllele I Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb RFLPSouthern blot检
35、测结果检测结果 58*Allele II Allele II 酶切位点消失酶切位点消失 Allele IAllele I Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb59*restriction fragment length polymorphismrestriction fragment length polymorphism RFLP RFLP ( (限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 ) )Schematic for RFLP by cleavage site loss Analysis and inheritance of allelic RFLP fragm
36、ents Schematic for RFLP by VNTR length variation 60*Allele-specific oligonucleotide hybridizationAllele-specific oligonucleotide hybridizationASOASO ( ( ( (等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交) ) ) )突变探针突变探针正常探针正常探针杂交杂交突变基因突变基因正常基因正常基因调整杂交温度调整杂交温度61*wild-typeoligonucleotidemutatedoli
37、gonucleotideAmplification refractory mutation system ARMSARMS（扩增阻滞突变体系）扩增阻滞突变体系）特点：灵敏、快速、简便，适用突变基因的结构、定位明确的样品。特点：灵敏、快速、简便，适用突变基因的结构、定位明确的样品。能检出杂合子个体能检出杂合子个体 野生型野生型- -野生型野生型突变型突变型- -突变型突变型野生型野生型- -突变型突变型突变型突变型- -野生型野生型野生型野生型- -野生型野生型突变型突变型- -突变型突变型62*Fluorescent-energy transfer techniquesFluorescent-
38、energy transfer techniques荧光共振能量转移荧光共振能量转移荧光共振能量转移荧光共振能量转移当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量、供体）的两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量、供体）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团。荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团。 63*64*Q65*Real-Time PCR: Real-Time PCR: the TaqMan Methodthe TaqMan Method66*A schemati
39、c representation of SNP analysis A schematic representation of SNP analysis by the TaqMan methodby the TaqMan method67*突变模板突变模板正常模板正常模板molecular beacon SNP analysis method 基于分子信标技术检测基于分子信标技术检测SNPSNP Molecular beacon will emit fluorescence once it meets the complimentary DNA of the loop sequence68*69
40、*Application of gene diagnosis基因诊断技术应用基因诊断技术应用70*基因诊断的应用基因诊断的应用u用于遗传病诊断用于遗传病诊断 u用于肿瘤诊断用于肿瘤诊断 u用于诊断感染性疾病用于诊断感染性疾病 u在器官移植组织配型中的应用在器官移植组织配型中的应用 u在法医学中的应用在法医学中的应用71*对不同疾病采用不同基因诊断的策略对不同疾病采用不同基因诊断的策略 人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基因诊断上也有不同途径和策略。因诊断上也有不同途径和策略。 1 1、对、对致病基因已经找到致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病，、发生
41、机制清楚的疾病，可以通过可以通过直接检测致病基因直接检测致病基因进行基因诊断。进行基因诊断。 如：如：病原微生物的感染病原微生物的感染：病毒、细菌、寄生虫、真：病毒、细菌、寄生虫、真菌等，及菌等，及与疾病有关的内源性基因与疾病有关的内源性基因。 72*2 2、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全、对致病基因还没找到，发生机制也没有完全清楚，但清楚，但致病基因已定位于染色体或基因组的致病基因已定位于染色体或基因组的特定区域的疾病特定区域的疾病，可以通过检测致病基因的，可以通过检测致病基因的联联锁遗传标记锁遗传标记进行基因诊断。进行基因诊断。对不同疾病采用不同基因诊断的策略对不同疾病采用不同基因
42、诊断的策略73*3 3、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通、对一些因基因表达异常出现的疾病，可通过基因表达的定量分析进行基因诊断。过基因表达的定量分析进行基因诊断。 对与基因表达异常出现的疾病，可以在转对与基因表达异常出现的疾病，可以在转录水平上对该基因的表达的录水平上对该基因的表达的mRNAmRNA量进行分析，量进行分析，作出诊断。作出诊断。对不同疾病采用不同基因诊断的策略对不同疾病采用不同基因诊断的策略74*sickle cell anemia镰刀型细胞贫血病镰刀型细胞贫血病75遗遗传传病病直直接接接接诊诊断断*血红蛋白亚基76 A A A S S S SMstMstMstMst： CC
43、TNAGGCCTNAGGCCTNAGGCCTNAGG 1.15Kb 1.15Kb 0.2Kb0.2Kb1.35 Kb1.35 Kb1.15 Kb1.15 Kb0.20 Kb0.20 Kb镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血镰状细胞贫血(HbS)(HbS)： 第第第第5 57 7位密码子对应的位密码子对应的位密码子对应的位密码子对应的DNADNA序列序列序列序列 A A A A： CCTGCCTGCCTGCCTGA A A AGGAGGGAGGGAGGGAG S S S S： CCTGCCTGCCTGCCTGT T T TGGAGGGAGGGAGGGAG正常人正常人 突变携带着突变携带着患者患者
44、镰镰镰镰刀型刀型刀型刀型红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 S S： AA 1.35 Kb 1.35 Kb 0.2Kb 0.2KbMstMstMstMst： CCTNAGGCCTNAGGCCTNAGGCCTNAGG*Cystic fibrosis 囊性纤维化囊性纤维化 囊性纤维化跨膜传导调节因子囊性纤维化跨膜传导调节因子 77*CFTR含含1 480个氨基酸个氨基酸遗传性外分泌腺疾病，主要影响胃肠道和呼遗传性外分泌腺疾病，主要影响胃肠道和呼吸系统，通常具有慢性梗阻性肺部病变、胰吸系统，
45、通常具有慢性梗阻性肺部病变、胰腺外分泌功能不足和汗液电解质异常升高的腺外分泌功能不足和汗液电解质异常升高的特征特征。是一种是一种cAMP依赖性氯离子通道，依赖性氯离子通道，广泛分布于上皮细胞顶膜上。广泛分布于上皮细胞顶膜上。ASO dot-blot analysis of CF mutationswild-typeoligonucleotidemutatedoligonucleotide78*DMDDMD是一种严重致死性疾病（是一种严重致死性疾病（XRXR），临床症状表现肌肉进行），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。性萎缩和乏力。BMDBMD临床症状与临床症状与DMDDMD相似，但症状较轻。相
46、似，但症状较轻。 DMD/BMD的缺失诊断的缺失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）（进行性肌营养不良或假肥大型）79Gene Gene 定位定位Xp21 Xp21 ， Gene Gene 2300kb,79 2300kb,79 个个Exon Exon ，cDNAcDNA全全长长13974bp 13974bp 编码编码3685 Aa3685 Aa，分子量分子量427kD427kD。DMD/BMD 70%DMD/BMD 70%左右为缺失型，左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重同的部位。应用多重PCRPCR扩增扩增检测，判断缺失状态。检测，判断缺失状态
47、。*Duchenne muscular dystrophy80*DMD的基因诊断的基因诊断DMDDMD属属XRXRDMDDMD基因是最大的基因，有基因是最大的基因，有7979个外显子个外显子DMDDMD基因突变主要以缺失为主基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位可涉及基因的不同部位E1E1E2E2E3E381*多重多重PCR扩增后电泳检测结果扩增后电泳检测结果病例病例外显子外显子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp53511382*遗遗传传病病间间接接诊诊断断 当当致病基因致病基因虽然已知，但其虽然已知，但其异常尚属未知异常尚属未知时，或时，或疾病疾病Ge
48、neGene本身尚未知本身尚未知时，主要通过时，主要通过GeneGene和和遗传标记遗传标记的的连锁连锁分析间接地作出诊断。分析间接地作出诊断。 83*多态性连锁分析多态性连锁分析DNADNA多态（多态（DNA PolymorphismDNA Polymorphism）：）： 群体中每个个体群体中每个个体DNADNA区域中等位基因（或片段）存在区域中等位基因（或片段）存在两种两种或或两种以上两种以上的形式的形式，对，对基因功能没有影响基因功能没有影响，称，称DNADNA多多态。常用做遗传分析中的标记。态。常用做遗传分析中的标记。DNADNA多态多态RFLPRFLP、VNTRVNTR、SNPSN
49、P多态性连锁分析：多态性连锁分析： 应用应用DNADNA多态为遗传标记进行连锁分析，多态为遗传标记进行连锁分析，确定待测者确定待测者是否得到带有致病的染色体是否得到带有致病的染色体，从而，从而间接间接地作出诊断。地作出诊断。84*一一) ) 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLPRFLPl由于碱基变异可能导致限制酶切点由于碱基变异可能导致限制酶切点消失消失或新的酶切点或新的酶切点出现出现，引起不同个体引起不同个体DNA
50、DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNADNA片段，称片段，称 RFLPRFLPl RFLP RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。85*二二) )数目变异串联重复，数目变异串联重复，variable number variable number tandem repeats, VNTRtandem repeats, VNTR）重复序列以各自的重复序列以各自的核心序列核心序列（重复单元），（重复单元），首尾相连首尾相连多次重复多次重复，称为，称为串串联重复序列联重复序列，其重复次数
51、在人群中存在变异，形成多态即，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即 VNTRVNTR散在分布于染色体上。散在分布于染色体上。重复单位重复单位625bp625bp长，长，称为小卫星称为小卫星DNADNA。重复单位重复单位26bp26bp长，如（长，如（TATA）n, (CGG)nn, (CGG)n等，等，称为微卫星称为微卫星DNADNA。短串联重复短串联重复序列（序列（shorttandemrepeats，STR）VNTRVNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。后产生不同长度的片段。DNA
52、DNA多态可以通过多态可以通过PCRPCR扩增后电泳来检出，称扩增后电泳来检出，称扩增扩增片段长度多态片段长度多态（amplified fragment length polymorphism, amplified fragment length polymorphism, Amp-FLPAmp-FLP）86*Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs，单核苷酸多态性），单核苷酸多态性）单核苷酸多态性是指基因组单核苷酸多态性是指基因组DNADNA中某一特定核苷酸位置上发生置中某一特定核苷酸位置上发生置换、颠换等变化，而且任何一种等位基因在群体中的换、颠换等变化，
53、而且任何一种等位基因在群体中的频率不小于频率不小于1%1%。SNPSNP具有数量多、分布广和稳定遗传等特点。具有数量多、分布广和稳定遗传等特点。 87*u APKD APKDGeneGene定位定位16p1316p13，已证实，已证实APKD GeneAPKD Gene与与珠蛋白基因珠蛋白基因33端附端附近的一段小卫星近的一段小卫星DNADNA序列（序列（3HVR3HVR）紧密连锁，因此，可以通过紧密连锁，因此，可以通过RFLPRFLP连连锁分析进行诊断。锁分析进行诊断。uu成年型多囊肾病成年型多囊肾病成年型多囊肾病成年型多囊肾病( (adult polycystic kidney disea
54、se)，临床表，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。终导致肾功能衰竭和尿毒症。autosomal dominant polycystin kidney diseaseautosomal dominant polycystin kidney disease（ADPKD，常染色体显性多囊肾病），常染色体显性多囊肾病）88*以以3HVR3HVR为为probeprobe与与PvuIIPvuII酶切后的家系有关成员酶切后的家系有关成员的的GeneGene组组DNADNA杂交杂交Southern Blo
55、tSouthern Blot杂交杂交 GeneGene组组DNADNAprobe probe （3HVR3HVR）DNADNA片段片段 杂交杂交 结果结果PvuIIPvuII酶切酶切89*3.4kb3.4kb结结 果果 3.4kb1 12 21 12 23 34 45 5患者（患者（I1I1、II1II1和和II2II2）有）有3.4kb3.4kb片段片段, ,说明致病基因与说明致病基因与3.4kb3.4kb片段连锁片段连锁, ,并按并按孟德尔方式遗传孟德尔方式遗传.II5.II5不含不含3.4kb3.4kb片段片段, ,产前诊断正常产前诊断正常. .90*u多囊多囊肾病肾病的两个致病基因的两
56、个致病基因目前已目前已被克隆，按被克隆，按照发现先后命名为照发现先后命名为PKDlPKDl和和PKD2PKD2，功能为，功能为维持维持正常肾小管形态发生和分化。正常肾小管形态发生和分化。u当当PKD1PKD1或或PKD2PKD2基因突变，引起基因突变，引起PC-1PC-1（多囊蛋（多囊蛋白白-1-1）或多或多PC-2PC-2结构和功能异常，进而导致结构和功能异常，进而导致肾小管细胞内信号转导异常，正常肾小管形肾小管细胞内信号转导异常，正常肾小管形态不能维持，遂发生肾囊肿，进而引发多囊态不能维持，遂发生肾囊肿，进而引发多囊肾。肾。*91肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因
57、素；发生过程肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素；发生过程呈多阶段性，其发生发展机制十分复杂，同时不同的呈多阶段性，其发生发展机制十分复杂，同时不同的肿瘤发生机制也不相同，因此在肿瘤的基因诊断时，肿瘤发生机制也不相同，因此在肿瘤的基因诊断时，无法采用统一的策略。无法采用统一的策略。92*93显显示示有有BRCA1基基因因突突变变者者，患患乳乳腺腺癌癌和和卵卵巢巢癌癌的的风风险险分分别别是是50%85%和和15%45%，有有BRCA2基基因因突突变变者者，患患乳乳腺腺癌癌和和 卵卵 巢巢 癌癌 的的 风风 险险 分分 别别 是是 50% 85%和和 10% 20%。 安吉丽娜遗传乳腺癌基因安吉丽娜遗
58、传乳腺癌基因 感染性疾病的分子诊断感染性疾病的分子诊断l 定性或定量检测致病微生物的核酸定性或定量检测致病微生物的核酸，已经用于病，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断。毒、细菌和寄生虫感染的诊断。l 动态动态、定量定量地检测病原体核酸能地检测病原体核酸能对疗效判断和病对疗效判断和病情预后情预后提供客观的依据。提供客观的依据。94*SARSSARS相关冠状病毒的分子诊断相关冠状病毒的分子诊断95*巢式巢式PCR - Nested PCR PCR - Nested PCR Target SequenceDNATemplateTarget SequenceDNATemplateFirst set
59、primerDNATemplateTarget SequenceTarget SequenceSecond set primerTarget SequenceTarget SequenceFirst PCR RunMajority of PCRProductSecond PCR RunPCR Product96*基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用这孩子一点也这孩子一点也不像我，是不不像我，是不是要去做做亲是要去做做亲子鉴定？子鉴定？ 是指应用医学和人类学的方法是指应用医学和人类学的方法检测遗传标记检测遗传标记，并依据，并依据遗传学理论进行分析遗传学理论进行分析，从而对被检者之间是
60、否存在，从而对被检者之间是否存在生物学生物学亲子关系亲子关系所作的科学所作的科学判定判定。98 亲子鉴定亲子鉴定 (identification in disputed paternity) *亲子鉴定悄然升温亲子鉴定悄然升温现代亲子鉴定法现代亲子鉴定法uABOABO血型检查血型检查uDNADNA指纹分析指纹分析uSTRSTR技术应用技术应用99*DNA指纹技术指纹技术多位点性多位点性高变异性高变异性简单而稳定的遗传性简单而稳定的遗传性“小卫星小卫星DNADNA”具有高度的可变性，不同个体彼此不同具有高度的可变性，不同个体彼此不同DNA指纹图的遗传规律指纹图的遗传规律 遗传方式：遗传方式：子代
61、图谱中所有的片段都可以子代图谱中所有的片段都可以在双亲的图谱中找到在双亲的图谱中找到，片段的传递符合孟德，片段的传递符合孟德尔遗传规律。尔遗传规律。 个体的组织同一性：个体的组织同一性：即来源于身体即来源于身体不同部不同部位与类型的组织位与类型的组织，其，其DNADNA指纹图谱是一致指纹图谱是一致的。的。利用利用DNA指纹图进行亲子鉴定指纹图进行亲子鉴定母亲母亲母亲母亲 儿子儿子儿子儿子 男性男性男性男性1 1 1 1 男性男性男性男性2 2 2 2 男性男性男性男性3 3 3 3DNA DNA 指纹图谱中的谱带能够指纹图谱中的谱带能够稳定地从上一代遗传给下一稳定地从上一代遗传给下一代。代。子
62、代子代DNA DNA 指纹图谱中的每一指纹图谱中的每一条带都能在其双亲之一的图条带都能在其双亲之一的图带中找到带中找到IVF Creator Wins Nobel PrizeDoctor Robert Edwards 世界上第一个世界上第一个“试管婴儿试管婴儿”路易丝路易丝与她的儿子卡梅伦与她的儿子卡梅伦 103*1978年，年，罗伯特伯特爱德德华教授和同事一起成功教授和同事一起成功地使第一例地使第一例试管管婴儿儿诞生生 uPGDPGD是在体外受精的胚胎中活检单个细胞，进行遗是在体外受精的胚胎中活检单个细胞，进行遗传学分析后，再选择正常胚胎移植回母体子宫，以传学分析后，再选择正常胚胎移植回母体
63、子宫，以避免异常妊娠的发生。避免异常妊娠的发生。u一般在卵裂期，当胚胎发育到一般在卵裂期，当胚胎发育到6-86-8个细胞阶段，抽个细胞阶段，抽取取1-21-2个细胞，进行遗传疾病诊断。根据遗传诊断个细胞，进行遗传疾病诊断。根据遗传诊断结果，仅将正常胚胎移植至子宫结果，仅将正常胚胎移植至子宫. .preimplantation genetic diagnosis, PGD胚胎移植前遗传病诊断胚胎移植前遗传病诊断目前主要用于已知患有遗传性疾患夫妇或高风险遗传疾患携带者（如高龄妇女）。目前主要用于已知患有遗传性疾患夫妇或高风险遗传疾患携带者（如高龄妇女）。 104*Principles of pre
64、implantation genetic diagnosis Currently, PGD can be used to detect many disorders, including cystic fibrosis, Down syndrome, Tay-Sachs disease and hemophilia A 105*遗传疾病的基因诊断方法遗传疾病的基因诊断方法基因异常基因异常方法方法探针、引物或限制酶探针、引物或限制酶基因组基因组DNA印迹杂交印迹杂交缺失基因的探针缺失基因的探针基因缺失基因缺失PCR扩增扩增引物包括缺失或在缺失部位内引物包括缺失或在缺失部位内RFLP分析分析突变导
65、致其切点消失的限制酶突变导致其切点消失的限制酶点突变点突变ASO杂交杂交正常和异常的正常和异常的ASO探针探针PCR-SSCP引物包括突变部位引物包括突变部位基因未知基因未知与疾病连锁的多态性分析与疾病连锁的多态性分析与疾病连锁的多态位点与疾病连锁的多态位点探针或引物探针或引物GWAS基因芯片基因芯片106*107名名词解解释：基因诊断； RFLP；单链构象多态性分析 (SSCP)；单核苷酸多态性（SNPs）；基因芯片；in situ PCR ;全基因组关联研究；荧光共振能量转移；多重PCR；核酸分子杂交； *108简答题简答题1. 用等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）方法检测四个样本，结果显示如下，请根据杂交结果判断谁是正常人？谁是携带者？谁是患者？2. 简述基因诊断的应用领域？3. 试采用RFLP对镰刀红细胞贫血做出诊断，说明原理。基因转录调节重点基因转录调节重点衰减子，操纵子，顺式作用元件，反式作用因子，转录因子简述乳糖操纵子的作用机理简述真核生物基因表达调控的步骤简述原核生物和真核生物转录的调控区别*109
