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1、食品中沙门菌的检验食品中沙门菌的检验 Inspection of Salmonella in food 6 6学时，学时，3 3次课次课n n食品中含有微生物生存和繁殖的各种营养成分和矿物质，可在食品中生存的微生物种类多、分布广、繁殖快，微生物所产生的各种有害物质可引起食品的腐败、变质，危害食用者身体健康，甚至发生食物中毒。n n沙门菌是引起食物中毒的常见病原菌，本实验以沙门菌为例讲解食品中微生物检验的主要步骤和方法。一、相关理论知识回顾一、相关理论知识回顾n n沙门菌的概况n n沙门菌分布n n沙门菌的生物学特性n n沙门菌为革兰氏阴性肠道杆菌。沙门菌为革兰氏阴性肠道杆菌。需氧兼性厌氧菌，需
2、氧兼性厌氧菌，在在10104343内均能生长，但以内均能生长，但以353543 43 为最为最适生长温度。一般沙门菌在适生长温度。一般沙门菌在40404343培养能提高培养能提高阳性检出率，而阳性检出率，而伤寒伤寒沙门菌在沙门菌在3737培养阳性检出率培养阳性检出率最高最高。n n沙门菌沙门菌广泛广泛存在于存在于自然界自然界中，常可在家畜、家禽、中，常可在家畜、家禽、飞鸟及鼠类等动物体中发现。鸡是沙门菌最大的储飞鸟及鼠类等动物体中发现。鸡是沙门菌最大的储存宿主。存宿主。n n沙门菌沙门菌不分解乳糖不分解乳糖（亚利桑那菌除外），（亚利桑那菌除外），分解葡萄分解葡萄糖可产酸产气糖可产酸产气（但伤寒
3、沙门菌产酸不产气）。（但伤寒沙门菌产酸不产气）。多数多数沙门菌产生沙门菌产生H H2 2S S（但甲型副伤寒沙门菌（但甲型副伤寒沙门菌H H2 2S S为阴性），为阴性），不产生靛基质不产生靛基质、乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇，不液化明胶，不液化明胶，不分不分解尿素解尿素，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。二、实验目的和要求二、实验目的和要求 n n1、熟悉食品标本的采集原则。n n2、掌握沙门菌检验的主要步骤与方法。n n3、掌握沙门菌落的观察和生化反应结果的判断。三、实验原理三、实验原理n检
4、验原理：主要依据细菌特殊的生物学特征生物学特征。n n沙门菌不分解乳糖（亚利桑那菌除外），分解葡萄糖可产酸产气（但伤寒沙门菌产酸不产气）。多数沙门菌产生H2S（但甲型副伤寒沙门菌H2S为阴性），不产生靛基质、乙酰甲基甲醇，不液化明胶，不分解尿素，多数能利用枸橼酸盐，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，在氰化钾培养基上不生长。沙沙门门菌的菌的检验检验程序程序GB 4789.42010n n前增菌n n增菌n n分离n n生化实验n n血清学鉴定四、材料和仪器四、材料和仪器n n1 1、材料：、材料：、材料：、材料： 可疑食物（奶粉）可疑食物（奶粉）; ; 生理盐水，氯化镁孔雀绿增菌液（生理盐水，氯化镁孔雀绿
5、增菌液（MMMM），亚硒酸），亚硒酸盐胱氨酸增菌液（盐胱氨酸增菌液（SCSC），），SSSS琼脂培养基琼脂培养基（志沙琼（志沙琼（志沙琼（志沙琼脂培养基）脂培养基）脂培养基）脂培养基） ，亚硫酸铋琼脂培养基（，亚硫酸铋琼脂培养基（BSBS），三糖），三糖铁琼脂培养基（铁琼脂培养基（TSITSI），缓冲蛋白胨水（），缓冲蛋白胨水（BPWBPW），），靛基质试剂，尿素琼脂（靛基质试剂，尿素琼脂（pH7.2pH7.2）培养基，赖氨酸）培养基，赖氨酸脱羧酶试验微量生化鉴定管等。脱羧酶试验微量生化鉴定管等。n n2 2、仪器：、仪器：、仪器：、仪器： 灭菌平皿、锥形瓶、烧杯、玻棒、量筒、吸管、灭菌平皿、
6、锥形瓶、烧杯、玻棒、量筒、吸管、滴管、接种环、接种针、高压灭菌器、滴管、接种环、接种针、高压灭菌器、3737和和4242恒温培养箱等。恒温培养箱等。25g（或（或25ml）+225ml 生理生理盐盐水稀水稀释释液；制液；制备检样备检样匀液匀液可疑食品可疑食品标标本本均质均质各取各取1ml，分，分别别接种到接种到9mlMM、SC增菌液中增菌液中报报告告检验结检验结果果分离平板上菌分离平板上菌落形落形态观态观察察从以上增菌液中挑取适量培养物，划线涂布到从以上增菌液中挑取适量培养物，划线涂布到SS、BS平板上平板上4项项主要主要生化反生化反应应MM增菌增菌42，1824h第第一一次次课课第第二二次次
7、课课分离培养分离培养37 1824h第第三三次次课课37 ，1824hSC增菌增菌37 ，1824h本次课的安排1、增菌培养：2、配制分离培养基：亚硫酸铋琼脂培养基（BS）SS琼脂培养基（志沙琼脂培养基（志沙琼脂培养基 ) 3、倾注无菌平板第一次一、本次课的任务一、本次课的任务 9ml 无菌MM培养液 9ml 无菌SC增菌液 BS琼脂培养基 SS琼脂培养基 灭菌平皿 蒸馏水 记号笔 天平、称量纸、称量勺本次课的安排二、所需试剂、材料n n1、样品制备、样品制备 以无菌操作称取25g可疑食物，加入225ml 无菌生理盐水中，混匀，制成检样匀液。（10倍稀释）食品标本的采集原则GB 4789.12
8、010一般不应超过3小时。n n样品可分为大、中和小样三类。n n大样：一整批食品。n n中样：从食品各部分随机抽得的混合样本，以200g为准。n n小样：做分析用的检样，以25g为准。食品微生物检验一般取小样。n n根据食品的种类不同用不同的采样方法。如固体粉末和液体应混合后取样；袋、罐、瓶装的食品应取未开封的完整体；冷冻食品在冷冻状态下取样，非冷冻食品需在0 5 保存。2、增菌（选择性增菌）、增菌（选择性增菌） 用无菌吸管移取用无菌吸管移取1ml的以上检样匀液，的以上检样匀液，接种于接种于9ml的氯化镁孔雀绿（的氯化镁孔雀绿（MM）增菌液）增菌液试管中，于试管中，于42培养培养1824h。
9、 同时，用无菌吸管移取同时，用无菌吸管移取1ml的以上检样的以上检样匀液，接种于匀液，接种于9ml的亚硒酸盐胱氨酸（的亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液试管中，于增菌液试管中，于37培养培养1824h。n nSC更适合伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌增菌，最适增菌温度为37度。MM更适合其他沙门菌增菌，最适增菌温度为42度，因为沙门菌有2000多个菌型，一种增菌液不可能适合所有的沙门菌生长，因此沙门菌增菌要同时用两种增菌液增菌。n n亚硒酸氢钠抑制革兰氏阳性菌和非沙门菌的大多数革兰氏阴性肠道菌。n n孔雀绿抑制非沙门菌的细菌。制备选择性培养基SS、BSn n称取适量培养基制剂，加相应蒸馏水混合，加热溶解
10、，煮沸灭菌，倾倒在灭菌平皿上。n n放入冰箱保存，下次课使用。按培养基配方称量配制、加水加热熔化调节pH值过滤分装包装灭菌检查灭菌彻底与否培养基的制备过程n n培养基所用化学药品均应是化学纯培养基所用化学药品均应是化学纯培养基所用化学药品均应是化学纯培养基所用化学药品均应是化学纯的。的。的。的。n n培养基各成分完全溶解后，应进行培养基各成分完全溶解后，应进行培养基各成分完全溶解后，应进行培养基各成分完全溶解后，应进行pHpH的初步调正。的初步调正。的初步调正。的初步调正。n n培养基的分装应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶培养基的分装应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶培养基的分装应按
11、使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶培养基的分装应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内，且分装的容量要适宜。等适当容器内，且分装的容量要适宜。等适当容器内，且分装的容量要适宜。等适当容器内，且分装的容量要适宜。n n一般培养基可采用一般培养基可采用一般培养基可采用一般培养基可采用121 121 ，15min15min高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法灭菌。灭菌。灭菌。灭菌。分装量大（分装量大（分装量大（分装量大（500g500g）的培养基）的培养基）的培养基）的培养基121 121 ，3030min.min.含糖培养基含糖培养基含糖培养基含糖培养基113113
12、，15min15min以免破坏糖类。必须将容器内的以免破坏糖类。必须将容器内的以免破坏糖类。必须将容器内的以免破坏糖类。必须将容器内的冷空气排冷空气排冷空气排冷空气排尽尽尽尽，否则压力表指示旳压力与所需温度之间有差异，造成，否则压力表指示旳压力与所需温度之间有差异，造成，否则压力表指示旳压力与所需温度之间有差异，造成，否则压力表指示旳压力与所需温度之间有差异，造成灭菌不彻底。灭菌不彻底。灭菌不彻底。灭菌不彻底。n n含有不耐热的物质时，可用过滤除菌。含有不耐热的物质时，可用过滤除菌。含有不耐热的物质时，可用过滤除菌。含有不耐热的物质时，可用过滤除菌。备注备注1 1n n操作过程中要尽量操作过程
13、中要尽量操作过程中要尽量操作过程中要尽量保持无菌操作保持无菌操作保持无菌操作保持无菌操作。n n进行增菌时，必须要注意，进行增菌时，必须要注意，进行增菌时，必须要注意，进行增菌时，必须要注意，MMMM和和和和SCSC两种增菌液增菌的两种增菌液增菌的两种增菌液增菌的两种增菌液增菌的培养温度不同培养温度不同培养温度不同培养温度不同。n n配置培养基时，加有琼脂的培养基易沸，应注意看守，配置培养基时，加有琼脂的培养基易沸，应注意看守，配置培养基时，加有琼脂的培养基易沸，应注意看守，配置培养基时，加有琼脂的培养基易沸，应注意看守，避免受热不均引起器皿爆裂避免受热不均引起器皿爆裂避免受热不均引起器皿爆裂
14、避免受热不均引起器皿爆裂。n做好个人防护工作，实验完毕后废弃物不能乱扔，防止做好个人防护工作，实验完毕后废弃物不能乱扔，防止细菌污染。细菌污染。注意注意事项事项本次课的安排本次课的安排1、观察上次实验课增菌培养结果：、观察上次实验课增菌培养结果： 增菌培养液中的性状（增菌培养液中的性状（ MM或或SC增菌液）增菌液）SC本身是淡黄色的液体，若有沙门菌则会还原亚硒酸氢钠，使培养基变成红色2、进行分离培养：、进行分离培养： 从培养液中挑取培养物接种于从培养液中挑取培养物接种于SS和和BS平板平板上，于上，于37倒置培养倒置培养24h。第二次课第二次课一、本次课的任务一、本次课的任务二、所需试剂、材
15、料二、所需试剂、材料 SS平板平板 接种环接种环 BS平板平板 酒精灯酒精灯 记号笔记号笔n nSS琼脂 沙门菌无色无色半透明，产硫半透明，产硫化氢菌株，有化氢菌株，有的菌落中心带的菌落中心带黑色黑色n n BS BS琼脂上琼脂上 沙门菌沙门菌n n硫酸亚铁产生硫硫酸亚铁产生硫化氢，与铁产生化氢，与铁产生沉淀，使阳性培沉淀，使阳性培养物呈褐色，灰养物呈褐色，灰色或黑色，有时色或黑色，有时带有金属光泽。带有金属光泽。菌落周围的培养菌落周围的培养基通常开始呈褐基通常开始呈褐色，但伴随培养色，但伴随培养时间的延长而变时间的延长而变为黑色，并有所为黑色，并有所谓的晕环效应谓的晕环效应 。n n操作过程
16、中要尽量操作过程中要尽量保持无菌操作保持无菌操作。n做好个人防护工作，实验完毕后废弃物不做好个人防护工作，实验完毕后废弃物不能乱扔，防止细菌污染。能乱扔，防止细菌污染。n n用用接种环划线涂布接种环划线涂布时，应时，应从平皿边缘向中从平皿边缘向中央划线央划线，并，并分区划线分区划线，避免划线交叉避免划线交叉。从。从MM、SC增菌液中蘸取增菌液划线涂布增菌液中蘸取增菌液划线涂布到到SS或或BS平板上时，所取的菌液平板上时，所取的菌液量要适量要适中中。n n将平皿放入温箱培养时，应将平皿放入温箱培养时，应倒置放置。倒置放置。注意事项注意事项一、本次课的任务一、本次课的任务一、本次课的任务一、本次课
17、的任务1 1、观察上次实验课分离培养的结果：、观察上次实验课分离培养的结果：、观察上次实验课分离培养的结果：、观察上次实验课分离培养的结果：BSBS或或或或SSSS平板平板平板平板2 2、进行生化试验：、进行生化试验：、进行生化试验：、进行生化试验：三糖铁琼脂（三糖铁琼脂（三糖铁琼脂（三糖铁琼脂（TSITSI）试验）试验）试验）试验靛基质试验（吲哚试验）靛基质试验（吲哚试验）靛基质试验（吲哚试验）靛基质试验（吲哚试验）尿素酶试验尿素酶试验尿素酶试验尿素酶试验赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验二、所需试剂、材料二、所需试剂、材料二、所需试剂、材料二、所需试剂、材料
18、TSITSI琼脂培养基（斜面）琼脂培养基（斜面）琼脂培养基（斜面）琼脂培养基（斜面） 蛋白胨水、靛基质试剂蛋白胨水、靛基质试剂蛋白胨水、靛基质试剂蛋白胨水、靛基质试剂 尿素琼脂（尿素琼脂（尿素琼脂（尿素琼脂（pH7.2pH7.2）培养基（斜面）培养基（斜面）培养基（斜面）培养基（斜面） 赖氨酸脱羧酶试验培养基、阴性对照微量生化鉴定赖氨酸脱羧酶试验培养基、阴性对照微量生化鉴定赖氨酸脱羧酶试验培养基、阴性对照微量生化鉴定赖氨酸脱羧酶试验培养基、阴性对照微量生化鉴定管管管管 接种环、接种针、酒精灯、记号笔接种环、接种针、酒精灯、记号笔接种环、接种针、酒精灯、记号笔接种环、接种针、酒精灯、记号笔 观察
19、观察观察观察、记录生化试验结果，分析整个实验结果，书写实验报告、记录生化试验结果，分析整个实验结果，书写实验报告、记录生化试验结果，分析整个实验结果，书写实验报告、记录生化试验结果，分析整个实验结果，书写实验报告实验安排实验安排第三次课生化试验生化试验 用接种环或接种针从用接种环或接种针从用接种环或接种针从用接种环或接种针从SSSS平板或平板或平板或平板或BSBS平板上平板上平板上平板上挑取挑取挑取挑取单个单个单个单个可疑菌落，接种到相应的培养基或微可疑菌落，接种到相应的培养基或微可疑菌落，接种到相应的培养基或微可疑菌落，接种到相应的培养基或微量生化鉴定管，进行以下量生化鉴定管，进行以下量生化
20、鉴定管，进行以下量生化鉴定管，进行以下4 4项主要的生化试验：项主要的生化试验：项主要的生化试验：项主要的生化试验： 1 1）三糖铁琼脂（）三糖铁琼脂（）三糖铁琼脂（）三糖铁琼脂（TSITSI）试验）试验）试验）试验 2 2）靛基质试验（吲哚试验）靛基质试验（吲哚试验）靛基质试验（吲哚试验）靛基质试验（吲哚试验） 3 3）尿素酶试验）尿素酶试验）尿素酶试验）尿素酶试验 4 4）赖氨酸脱羧酶试验）赖氨酸脱羧酶试验）赖氨酸脱羧酶试验）赖氨酸脱羧酶试验 沙门菌菌落形态观察沙门菌菌落形态观察 经分离培养以后，观察经分离培养以后，观察经分离培养以后，观察经分离培养以后，观察SSSS平板或平板或平板或平板
21、或BSBS平板上平板上平板上平板上的菌落形态。的菌落形态。的菌落形态。的菌落形态。1、三糖铁（三糖铁（TSI）琼脂试验）琼脂试验n n在在TSI琼脂中，典型的沙门菌仅能利用葡萄琼脂中，典型的沙门菌仅能利用葡萄糖，使斜面呈碱性（变红），而底层仍呈黄糖，使斜面呈碱性（变红），而底层仍呈黄色，产生或不产生色，产生或不产生H2S（变黑色）。（变黑色）。 2、靛基质试验（吲哚试验）靛基质试验（吲哚试验） n n有些细菌能分解培养基中蛋白胨内的色氨酸形成有些细菌能分解培养基中蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（又称吲哚），加入靛基质试剂时，试剂靛基质（又称吲哚），加入靛基质试剂时，试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与靛基
22、质结合而成红色中的对二甲基氨基苯甲醛与靛基质结合而成红色的玫瑰靛基质，为肉眼识别。的玫瑰靛基质，为肉眼识别。阳性对照管阳性对照管阳性对照管阳性对照管（液面玫瑰红）（液面玫瑰红）（液面玫瑰红）（液面玫瑰红）沙门菌沙门菌沙门菌沙门菌 （液面黄色）（液面黄色）（液面黄色）（液面黄色） 3、尿素酶试验n n某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱，从而呈红色，为阳性。使培养基变碱，从而呈红色，为阳性。未接种未接种尿素酶阳性尿素酶阳性尿素酶阴性尿素酶阴性-沙门菌沙门菌n n阳性反应为培养基不阳性反应为培养基不改变颜色，而培养基改变颜色，而培养基
23、变黄色者为阴性反应。变黄色者为阴性反应。n n阳性管因培养初期发阳性管因培养初期发酵葡萄糖产酸变黄，酵葡萄糖产酸变黄，继续培养由于氨基酸继续培养由于氨基酸脱羧产生胺类而使培脱羧产生胺类而使培养基由酸变碱，所以养基由酸变碱，所以黄色变为紫色。阴性黄色变为紫色。阴性试验管则始终呈黄色试验管则始终呈黄色 4、赖氨酸脱羧酶试验n n对接种环或对接种环或对接种环或对接种环或接种针灭菌接种针灭菌接种针灭菌接种针灭菌时，应在酒精灯火焰上由下时，应在酒精灯火焰上由下时，应在酒精灯火焰上由下时，应在酒精灯火焰上由下端往上烧起。端往上烧起。端往上烧起。端往上烧起。n n用接种针穿刺接种时，应垂直生化鉴定管中的培养
24、用接种针穿刺接种时，应垂直生化鉴定管中的培养用接种针穿刺接种时，应垂直生化鉴定管中的培养用接种针穿刺接种时，应垂直生化鉴定管中的培养基平面，并从中央插入。基平面，并从中央插入。基平面，并从中央插入。基平面，并从中央插入。n n所有生化试验挑取的菌落都应来自所有生化试验挑取的菌落都应来自所有生化试验挑取的菌落都应来自所有生化试验挑取的菌落都应来自同一单个菌落同一单个菌落同一单个菌落同一单个菌落。n nTSITSI试验时是联合采用试验时是联合采用试验时是联合采用试验时是联合采用穿刺接种与划线接种穿刺接种与划线接种穿刺接种与划线接种穿刺接种与划线接种的方法进的方法进的方法进的方法进行操作。行操作。行
25、操作。行操作。n n靛基质试验时，加入靛基质试剂的量要适宜。靛基质试验时，加入靛基质试剂的量要适宜。靛基质试验时，加入靛基质试剂的量要适宜。靛基质试验时，加入靛基质试剂的量要适宜。n n准确的生化反应可作出初步鉴定，必要时应配合形准确的生化反应可作出初步鉴定，必要时应配合形准确的生化反应可作出初步鉴定，必要时应配合形准确的生化反应可作出初步鉴定，必要时应配合形态及染色检查，态及染色检查，态及染色检查，态及染色检查， 以排除肠球菌和其他肠道菌。以排除肠球菌和其他肠道菌。以排除肠球菌和其他肠道菌。以排除肠球菌和其他肠道菌。n做好个人防护工作，实验完毕后废弃物不能乱扔，做好个人防护工作，实验完毕后废
26、弃物不能乱扔，防止细菌污染。防止细菌污染。注意事项注意事项七、结果报告及分析七、结果报告及分析1 1、菌落形态观察、菌落形态观察3 3、综合检验结果、综合检验结果 2 2、生化反应结果、生化反应结果选择性选择性分离平板分离平板来源于来源于MM增菌液增菌液来源于来源于SC增菌液增菌液BS平板平板SS平板平板1、菌落形态观察结果记录格式 观察BS和SS平板上菌落的生长状况，并如实记录在下表1中。结果的报告表1 菌落形态观察结果 2、生化试验的结果记录格式 观察4项主要生化试验的结果，并如实记录在下表2中。试管试管编号编号TSI试验试验靛基质靛基质试验试验尿素酶尿素酶试验试验赖氨酸脱赖氨酸脱羧酶试验羧酶试验123对照管对照管结结果果报报告告表2 生化试验结果 3、综合结果 实验报告书写格式一、实验目的和要求二、实验原理三、检验程序四、材料和器材五、实验方法和步骤六、结果报告及分析
