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1、第二章第二章 细胞生物学实验技术细胞生物学实验技术细胞生物学第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜一、光学显微镜二、电子显微镜二、电子显微镜三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性五、应用放射自显影技
2、术研究生物大分子在细胞内的合成动态五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态六、定量细胞化学分析技术六、定量细胞化学分析技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养一、细胞培养二、细胞工程二、细胞工程第四节用于细胞生物学研究的模式生物第四节用于细胞生物学研究的模式生物细胞生物学第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。细胞生物学一、光学显微镜一、光学显微镜（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜1、构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置2、原理：经物
3、镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。细胞生物学细胞生物学细胞生物学3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61/NA其中其中为入射光线波长；为入射光线波长；NA：为镜口率为镜口率 sin/2，n=介质折射率；=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。思考：如何提高显微镜的分辨能力？细胞生物学表一、几种介质的折射率表一、几种介质的折射率细胞生物学显微镜的几个光学特点：显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.781.651.78，所用介质的折，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。射率越接近玻璃的越好。sin /2sin /2的最大值必然小于的
4、最大值必然小于1 1；介质为空气，镜口率一般为；介质为空气，镜口率一般为0.050.950.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.51.5。普通光线的波长为普通光线的波长为400700nm400700nm，分辨力数值不会小于分辨力数值不会小于.2m.2m，人人眼的分辨力为眼的分辨力为0.2mm,0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为因此显微镜的最大设计倍数为1000X1000X。细胞生物学（二）相差和微分干涉显微技术（二）相差和微分干涉显微技术干涉干涉: :两列频率相同的光波在两列频率相同的光波在空中相遇时发生叠加，在某些空中相遇时发生叠加，在
5、某些区域总加强，在另外一些区域区域总加强，在另外一些区域总减弱，出现明暗相间的条纹总减弱，出现明暗相间的条纹或者是彩色条纹的现象叫做光或者是彩色条纹的现象叫做光的干涉。的干涉。细胞生物学相差显微镜相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。同于普通光学显微镜两个特殊之处。1 1、环形光阑（、环形光阑（annular diaphragmannular diaphragm
6、）：位于光源）：位于光源与聚光器之间。与聚光器之间。2 2、相位板（、相位板（annular annular phaseplatephaseplate）：物镜中加）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟光的相位推迟1/41/4。细胞生物学细胞生物学用途：观察未经染色的玻片标本用途：观察未经染色的玻片标本细胞生物学微分干涉显微镜微分干涉显微镜 19521952年，年，NomarskiNomarski发明，发明，微分干涉微分干涉显微镜是以平面偏振光为光源，光显微镜是以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同线经棱镜折射后分成两束
7、，在不同时间经过样品的相邻部位，然后经时间经过样品的相邻部位，然后经过另一棱镜将这两束光汇合，从而过另一棱镜将这两束光汇合，从而样品中厚度上的微小差别就会转化样品中厚度上的微小差别就会转化成明暗区别，增加了样品反差，造成明暗区别，增加了样品反差，造成了标本的人为三维立体感，类似成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。大理石上的浮雕。 微分干涉显微微分干涉显微镜适于研究活细胞中较大的细胞器，镜适于研究活细胞中较大的细胞器，如果接上录像装置可以记录活细胞如果接上录像装置可以记录活细胞中的颗粒以及细胞器的运动。中的颗粒以及细胞器的运动。 细胞生物学（三）荧光显微镜（三）荧光显微镜 特点：光源为
8、紫外线，波特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通长较短，分辨力高于普通显微镜；显微镜；有两个特殊的滤光片；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式照明方式通常为落射式。细胞生物学细胞生物学用于观察能激发出荧光的结构。用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green细胞生物学（四）激光共聚焦扫描显微境（四）激光共聚焦扫描显微境 Laser Laser confocalconfoca
9、l scanning microscope, LCSM scanning microscope, LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍。倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。成立体图像。细胞生物学laser confocal scanning microscope, LCSM细胞生物学细胞生物学LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtu
10、bule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)细胞生物学(五五)荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术 CFP CFP的的发射发射光谱与光谱与YFPYFP的的吸收吸收光谱有相当的重光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用叠，当它们足够接近时，用CFPCFP的吸收波长激的吸收波长激发，发，CFPCFP的发色基团将会把能量高效率地共振转的发色基团将会把能量高效率地共振转移至移至YFPYFP的发色基团上，所以的发色基团上，所以CFPCFP的发射荧光将的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是减弱或消失，主要发射将是YFPYFP的荧光。的荧光。 细胞生物学细
11、胞生物学应用应用: :1 1、检测酶活性变化、检测酶活性变化 2 2、关于膜蛋白的研究、关于膜蛋白的研究 3 3、细胞膜受体之间相互作用、细胞膜受体之间相互作用4 4、细胞内分子之间相互作用、细胞内分子之间相互作用 细胞生物学( (六六) )荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术FRAP (FRAP (光漂白后荧光恢复光漂白后荧光恢复) )就是在光漂白后对样本确定就是在光漂白后对样本确定区中的荧光恢复。区中的荧光恢复。FRAPFRAP是由没有漂白的荧光团由周围进是由没有漂白的荧光团由周围进入漂白区入漂白区FRAPFRAP的运动引起的。的运动引起的。FRAPFRAP用于测量用于测量2-2-维或维或3-
12、3-维维分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标分子运动的力度。分子运动包括膜或活细胞内用荧光标明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。明的分子的扩散、转移或其他类型的运动。 细胞生物学二、电子二、电子显微镜显微镜（一）电（一）电子显微镜子显微镜的基本知的基本知识识1 1、电子、电子显微镜与显微镜与光学显微光学显微镜的基本镜的基本区别区别细胞生物学不同光线的波长不同光线的波长细胞生物学、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数、电子显微镜的分辨本领和有效放大倍数分辨本领分辨本领分辨本领分辨本领：是指电镜处于最佳状态下的分辨率：是指电镜处于最佳状态下的分辨率电镜分辨率受电镜分辨率受制样技术制样技
13、术的影响。的影响。细胞生物学、电子显微镜的基本构造、电子显微镜的基本构造）电子束照明系统）电子束照明系统）成像系统）成像系统）真空系统）真空系统）记录系统）记录系统细胞生物学（二）、主要电镜制样技术介绍（二）、主要电镜制样技术介绍1 1、超薄切片技术、超薄切片技术电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅仅40-50nm40-50nm的超薄切片，的超薄切片，(1)(1)固定：固定：通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水(2)(2)包埋：包埋：环氧树脂包埋环氧树脂包埋(3)切片：切片：以热膨胀或螺旋推进
14、的方式切片以热膨胀或螺旋推进的方式切片(4)染色：染色：重金属（铀、铅）盐染色形成明暗的黑白图象重金属（铀、铅）盐染色形成明暗的黑白图象细胞生物学细胞生物学细胞生物学2 2、负染技术、负染技术用重金属盐用重金属盐( (如磷如磷钨酸钨酸) )对铺展在载对铺展在载网上的样品染色；网上的样品染色；吸去染料，干燥吸去染料，干燥后，样品凹陷处后，样品凹陷处铺了一层重金属铺了一层重金属盐，而凸的出地盐，而凸的出地方没有染料沉积，方没有染料沉积，从而出现负染效从而出现负染效果，分辨力可达果，分辨力可达1.5nm1.5nm左右。左右。Negative Stained Actin细胞生物学3 3、冰冻蚀刻、冰冻
15、蚀刻 freeze-freeze-etchingetching亦称冰冻断裂。亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为膜剥下来，此膜即为复膜（复膜（replicareplica）。）。细胞生物学、电镜三维重构技术、电镜三维重构技术对样品在不同的倾角拍照，得到图片经处理对样品在不同的倾角拍照，得到图片经处理后而展现的电子密度图。后而展现的电子密度图。电镜三维
16、重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核射线晶体衍射技术及核磁共振磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural BiologyStructural Biology）（主要研究生物大分）（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。细胞生物学、扫描电镜技术、扫描电镜技术2020世纪世纪6060年代问世，用来观察标本表面结构。年代问世，用来观察标本表面结构。分分辨辨力力为为610nm610nm，由由于于人人眼眼的的分分辨辨力力（区区别别荧荧光光屏屏上上距距离离最最近近两两个个光光点
17、点的的能能力力）为为0.2mm0.2mm，扫扫描描电电镜的有效放大倍率为镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X0.2mm/10nm=20000X。细胞生物学Scanning electron microscope（ SEM）细胞生物学工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫制荧光屏上电子束的强度，显示出
18、与电子束同步的扫描图像。描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。下发出次级电子信号。细胞生物学扫描电子显微镜原理扫描电子显微镜原理细胞生物学细胞生物学人类精子人类精子细胞生物学三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜scanning tunneling microscopescanning tunneling microscope，原理：原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不
19、到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V2mV2V），），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。分辨率：横向为分辨率：横向为0.10.2nm0.10.2nm，纵向可达纵向可达0.001nm0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察
20、。细胞生物学扫扫描描隧隧道道显显微微镜镜原原理理细胞生物学第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物转速为转速为1025kr/min1025kr/min的离心机称为高速离心机。的离心机称为高速离心机。转速转速25kr/min25kr/min，离心力离心力89K89K者称为超速离心机。者称为超速离心机。目目前前超超速速离离心心机机的的最最高高转转速速可可达达100000r/min100000r/min，离离心心力力超过超过500Kg500Kg。 细胞生物学超速离心技术：超速离心技术：用途：
21、分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉沉降降顺顺序序：核核线线粒粒体体溶溶酶酶体体与与过过氧氧化化物物酶体酶体内质网与高基体内质网与高基体核蛋白体。核蛋白体。可可将将细细胞胞器器初初步步分分离离，常常需需进进一一步步通通过过密密度度梯梯离离心再行分离纯化。心再行分离纯化。 细胞生物学细胞生物学密度梯度离心密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、
22、等密度沉降。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：分离活细胞的介质要求：1 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2 2）PHPH中性或易调为中性；中性或易调为中性；3 3）浓度大时渗透压不大；）浓度大时渗透压不大；4 4）对细胞无毒。）对细胞无毒。细胞生物学Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation细胞生物学二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法、DNADNA经经
23、1N1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与基与SchiffSchiff试剂反应。试剂反应。SchiffSchiff试剂是由碱性品红和偏重亚试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡有合形成紫红色的化合物。因此凡有DNADNA的地方，都能显示的地方，都能显示紫红色。紫红色。、四氧化锇与不饱和的脂肪酸反应呈黑色，证明脂肪滴的、四氧化锇与不
24、饱和的脂肪酸反应呈黑色，证明脂肪滴的存在，苏丹存在，苏丹使脂滴呈深红使脂滴呈深红、蛋白质定性：米伦反应，重氮反应、蛋白质定性：米伦反应，重氮反应 细胞生物学三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性( (一一) )免疫荧光技术免疫荧光技术将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。技术，称为免疫荧光素技术。常用的标记物有荧光素和酶。常用的标记物有荧光素和酶。免免疫疫荧荧光光法法（immunof
25、luorescentimmunofluorescent techniquetechnique）：常常用用的的萤萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶酶标标免免疫疫法法（enzyme-labeled enzyme-labeled antibody antibody methodmethod）：常常用用的的酶酶有有辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶，酶酶与与底底物物发发生生反反应应后后形形成成不不透透明明的的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。沉积物，从而显示出抗原存在的部位。细胞生物学间接法原理示意图细胞生物学补体结合法原理示意图细胞生物学( (二二) )免疫电镜技术免疫电
26、镜技术又称为又称为免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术是在是在免疫组织化学技术免疫组织化学技术的基的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、技术方法。该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了的变化提供了有效的手段。免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技
27、术三铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。个主要发展阶段。 细胞生物学铁蛋白标记技术铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异内抗原较为困难。铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。用受到一定限制。 细胞生物学酶标记免疫电镜技术酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物
28、显示酶的活性抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经部位，酶反应产物经OsO4OsO4处理变为具有一定电子密处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子度的锇黑，可在电镜下观察。过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产物比较弥可用于细胞内抗原的定位。但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。 细胞生物学胶体金标记免疫电镜技术胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，是目前应用最广的免
29、疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。胶体金主要具有以下几个优点：内多种抗原的精确定位。胶体金主要具有以下几个优点：（1 1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体性不发生明显改变，可制备抗体- -胶体金、蛋白胶体金、蛋白A-A-胶体金、胶体金、卵白素卵白素- -胶体金、植物凝集素胶体金、植物凝集素- -胶体金等用于免疫电镜；胶体金等用于免疫电镜；（2 2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于）在电镜
30、下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（辨认，定位比酶反应物更精确；（3 3）胶体金标记物易于制）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（备，并可以根据需要制备大小不同（1 1150nm150nm）的胶体金，）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4 4）金颗粒能发）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5 5）胶体）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于
31、光学显微镜观察。此外，胶体金色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。 细胞生物学四、细胞内特异核酸序列的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNADNA-DNA，DNA-RNADNA-RNA或或RNA-RNARNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。链分子核苷酸序列间是否具有
32、互补关系。（一）原位杂交（一）原位杂交（in situin situ hybridization hybridization）用用于于检检测测染染色色体体上上的的特特殊殊DNADNA序序列列。最最初初是是使使用用带带放放射性的射性的DNADNA探针，后来又发明了免疫探针法。探针，后来又发明了免疫探针法。细胞生物学（二）（二）SouthernSouthern杂交杂交是体外分析特异是体外分析特异DNADNA序列的方法，操作时先用限制性序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核内切酶将核DNADNA或线粒体或线粒体DNADNA切成切成DNADNA片段，经凝胶电片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上
33、，再用探针杂交，泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。苷序列。将将 RNARNA转转 移移 到到 薄薄 膜膜 上上 ， 用用 探探 针针 杂杂 交交 ， 则则 称称 为为NorthernNorthern杂交杂交。细胞生物学五、应用放射自显影技术五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态研究生物大分子在细胞内的合成动态用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。位、排出以及合成、更新
34、、作用机理、作用部位等等。原原理理：将将放放射射性性同同位位素素标标记记的的化化合合物物导导入入生生物物体体内内，经经过过一一段段时时间间后后，制制取取切切片片，涂涂上上卤卤化化银银乳乳胶胶，经经放放射射性性曝光，使乳胶感光。曝光，使乳胶感光。一一般般用用1414C C和和3 3H H标标记记。常常用用3 3H-TDRH-TDR来来显显示示DNADNA，用用3 3H-UDRH-UDR显显示示RNARNA；用用3 3H H氨氨基基酸酸研研究究蛋蛋白白质质，用用3 3H H甘甘露露糖糖、3 3H H岩岩藻藻糖糖研究多糖。研究多糖。1414C C半衰期为半衰期为57305730年，年，3 3H H为
35、为12.512.5年。年。细胞生物学六、定量细胞化学分析技术六、定量细胞化学分析技术（一）流式细胞术（一）流式细胞术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原原理理：包包在在鞘鞘液液中中的的细细胞胞通通过过高高频频振振荡荡控控制制的的喷喷嘴嘴，形形成成包包含含单单个个细细胞胞的的液液滴滴，在在激激光光束束的的照照射射下下，这这些些细细胞胞发发出出散散射射光光和和荧荧光光，经经探探测测器器检检测测，转转换换为为电电信信号号，送送入入计计算算机机处处理理，输输出出统统计计结结果果，并并可可根根据据这这些些性性质质分分选选出出高高纯纯度度的
36、的细细胞胞亚亚群群，分分离离纯纯度度可可达达99%99%。包包被被细细胞胞的的液液流流 称称 为为 鞘鞘 液液 ， 所所 用用 仪仪 器器 称称 为为 流流 式式 细细 胞胞 计计 （ flow flow cytometercytometer）。）。细胞生物学细胞生物学（二）显微分光光度测定技术（二）显微分光光度测定技术细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。曲线。可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和
37、定量测定。和定量测定。细胞生物学七、七、PCR PCR 技术技术PCRPCR即：即：polymerase chain reactionpolymerase chain reaction。反应体系：反应体系：样品样品DNADNA；引物（引物（primerprimer），），约约15-2015-20个核苷酸；个核苷酸；4 4种种dNTPdNTP；Tag DNATag DNA聚合酶，来自于嗜聚合酶，来自于嗜热水生菌热水生菌ThermusThermus aquaticusaquaticus，最适作用温度最适作用温度75807580，短时间在，短时间在9595下不失活。下不失活。缓冲体系和缓冲体系和Mg
38、Mg2+2+。反应过程：反应过程：变性：约变性：约90-9590-95；复性：约复性：约6060左左右；右；延伸：延伸：70-7570-75；重复重复 “ “变性变性复性复性延伸延伸” ” 过程过程20-3020-30次循环。次循环。细胞生物学PCR原理细胞生物学第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养一、细胞培养（一）动物细胞培养（一）动物细胞培养群群体体培培养养（mass mass cultureculture）：将将含含有有一一定定数数量量细细胞胞的的悬悬液液 置置 于于 培培 养养 瓶瓶 中中 ， 让让 细细 胞胞 贴贴 壁壁 生生 长长
39、 ， 汇汇 合合（confluenceconfluence）后形成均匀的单细胞层；后形成均匀的单细胞层；克克隆隆培培养养（clonalclonal cultureculture）：培培养养高高度度稀稀释释的的细细胞胞悬悬液液，细细胞胞贴贴壁壁生生长长，每每一一个个细细胞胞形形成成一一个个细细胞胞集集落落，称称为克隆。为克隆。转转鼓鼓培培养养法法：为为制制取取细细胞胞产产品品而而设设计计，大大容容量量旋旋转转培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。培养，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中。 细胞生物学原原代代培培养养 （primary primary cultureculture）：即即：培培养养
40、直直接接来来自自动动物物机机体体的的细细胞胞群群，将将细细胞胞从从一一个个培培养养瓶瓶转转移移到到另另外一个培养瓶称为传代或传代培养（外一个培养瓶称为传代或传代培养（PassagePassage）。）。细细胞胞株株（cell cell strainstrain）：从从原原代代培培养养细细胞胞群群中中筛筛选选出的具有特定性质或标志的细胞群。出的具有特定性质或标志的细胞群。细细胞胞系系（cell cell lineline）：从从肿肿瘤瘤组组织织培培养养建建立立的的细细胞胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。 克克隆隆（cloneclon
41、e）：亦亦称称无无性性系系。指指由由同同一一个个祖祖先先细细胞胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。细胞生物学细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞Henrietta Lacks BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP20骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠实验室中常用的几种细胞系实验室中常用的几种细胞系细胞生物学（二）植物细胞培养（二）植物细胞培养1.1.外植体培养外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化
42、和变异；进行无性繁殖；制取的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。代谢产物。2.2.悬浮细胞培养悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。养，制取植物代谢产物。3.3.原生质体培养原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：培养脱壁后的细胞，特点：比较容易摄取外来的遗传物质，如比较容易摄取外来的遗传物质，如DNADNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。整植株。4.4.单倍体培养单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体：通
43、过花药或花粉培养可获得单倍体植株。植株。细胞生物学Animal Cell Culture细胞生物学二、细胞工程二、细胞工程（一）细胞融合（一）细胞融合通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（细胞的过程称为细胞融合（cell fusioncell fusion）或细胞杂交。或细胞杂交。同核体同核体：相同基因型的细胞融合而成。：相同基因型的细胞融合而成。异核体：异核体：不同基因型的细胞融合而成。不同基因型的细胞融合而成。自发融合：自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发
44、融合：诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱诱导导细细胞胞融融合合的的方方法法：生生物物方方法法（仙仙台台病病毒毒、副副流流感感病病毒毒和和新新城城鸡鸡瘟瘟病病毒毒 ）、化化学学方方法法（聚聚乙乙二二醇醇PEGPEG）、物物理理方方法（电击和激光）。法（电击和激光）。细胞生物学单克隆抗体技术单克隆抗体技术正正常常淋淋巴巴细细胞胞（如如小小鼠鼠脾脾细细胞胞）具具有有分分泌泌抗抗体体的的能能力力，但但不不能能长长期期培培养养，瘤瘤细细胞胞（如如骨骨髓髓瘤瘤）可可以以在在体体外外长长期期培培养养，但但不不分分泌泌抗抗体体。于于是是英英国国人人Kohl
45、erKohler和和Milstein Milstein 19751975将将两两种种细细胞胞杂杂交交而而创创立立了了单克隆抗体技术，获单克隆抗体技术，获19841984年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。细胞生物学（三）细胞拆合与显微操作技术（三）细胞拆合与显微操作技术、物理法：、物理法：用机械方法或短光波把细胞核去掉或使用机械方法或短光波把细胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。、化学法、化学法：用细胞松弛素：用细胞松弛素B B处理细胞，细胞出现排处理细胞，细胞出现排核现象，再结
46、合离心技术，将细胞拆分为核体和核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核体和胞质体两部分，由于核体外表包有一层细胞质膜胞质体两部分，由于核体外表包有一层细胞质膜和少量的胞浆，因而在和少量的胞浆，因而在PEGPEG或仙台病毒的介导下，或仙台病毒的介导下，核体可与另一胞质体融合，形成重组细胞。核体可与另一胞质体融合，形成重组细胞。细胞生物学第四节用于细胞生物学研究的模式生物第四节用于细胞生物学研究的模式生物生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有用于揭示某种具有普遍规律普遍规律的生命现象，此时，这的生命现象，此时，这种被选定的生物物种就是模式
47、生物。比如，孟德尔种被选定的生物物种就是模式生物。比如，孟德尔在揭示生物界遗传规律时选用豌豆作为实验材料，在揭示生物界遗传规律时选用豌豆作为实验材料，而摩根选用果蝇作为实验材料，在他们的研究中，而摩根选用果蝇作为实验材料，在他们的研究中，豌豆和果蝇就是研究生物体遗传规律的模式生物。豌豆和果蝇就是研究生物体遗传规律的模式生物。 细胞生物学模式生物的特点有模式生物的特点有: :1)1)生理特征能够代表生物界的某一大类群。生理特征能够代表生物界的某一大类群。2)2)容易获得并易于在实验室内饲养繁殖。容易获得并易于在实验室内饲养繁殖。3)3)容易进行实验操作容易进行实验操作, ,特别是遗传学分析。特别
48、是遗传学分析。4)4)个体较小个体较小, ,生长繁殖快生长繁殖快。生命科学研究中常用的模式生物有：生命科学研究中常用的模式生物有：病毒，细菌，酵母，原生动物，黏菌，蛙，海胆，病毒，细菌，酵母，原生动物，黏菌，蛙，海胆，线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠细胞生物学、病毒：、病毒：）特点：）特点：结构简单（壳体和核酸）结构简单（壳体和核酸）进入细胞才能进行复制进入细胞才能进行复制）应用：）应用：适合遗传操作，进行有关生物大分子之间的相互作适合遗传操作，进行有关生物大分子之间的相互作用，基因表达调空肿瘤的发生和防治等研究。用，基因表达调空肿瘤的发生和防治等研究。作为外源基因的载体，用于
49、蛋白质功能的研究以及作为外源基因的载体，用于蛋白质功能的研究以及肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗细胞生物学、细菌、细菌）特点：）特点：细菌培养方便，生长快，细菌培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变和分离、鉴定容易基因结构简单，突变株的诱变和分离、鉴定容易转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。）应用：）应用：转基因技术。转基因技术。基因的表达调控基因的表达调控细胞生物学、酵母、酵母）特点）特点是单细胞生物是单细胞生物, ,可在基本培养基上生长可在基本培养基上生长, ,可通过改可通过改变物理或化学环境完全控制其生长变物理或化学环境完全控制其生长在单倍体和二
50、倍体的状态下均可生长在单倍体和二倍体的状态下均可生长, ,并可在实验并可在实验条件下控制单倍体和二倍体之间的相互转换条件下控制单倍体和二倍体之间的相互转换, ,这对这对其基因功能的研究十分有利其基因功能的研究十分有利有将近有将近31%31%编码蛋白质的基因或编码蛋白质的基因或ORFORF与哺乳动物编与哺乳动物编码蛋白质的基因有高度的同源性码蛋白质的基因有高度的同源性细胞生物学）应用：）应用：细胞周期调控，细胞周期调控，P34P34cdc28 cdc28 突变，细胞停留在突变，细胞停留在G G1 1/S/S P34P34cdc2cdc2突变，细胞停留在突变，细胞停留在G G/S /S 利用酵母基
51、因突变为基因表达调控，膜泡运输，细利用酵母基因突变为基因表达调控，膜泡运输，细胞分化，衰老等研究领域提供研究材料胞分化，衰老等研究领域提供研究材料细胞生物学、线虫、线虫）特点）特点: :通身透明通身透明, ,长不过长不过1mm1mm身体中所有细胞能被逐个盘点并各归其类身体中所有细胞能被逐个盘点并各归其类幼虫幼虫:556:556个体细胞个体细胞,2,2个原始生殖细胞个原始生殖细胞成虫成虫: :雌雄同体成虫雌雄同体成虫:959:959个体细胞个体细胞,2000,2000个生殖细胞个生殖细胞雄性成虫雄性成虫( (偶见偶见):1031):1031个体细胞个体细胞,1000,1000个生殖细胞个生殖细胞
52、生命周期短生命周期短, ,从生到死仅为三天半从生到死仅为三天半, ,使得不间断地观察并追使得不间断地观察并追踪每个细胞的演变成为可能踪每个细胞的演变成为可能把线虫浸泡到含有核酸的溶液中可实现基因导入把线虫浸泡到含有核酸的溶液中可实现基因导入细胞生物学）应用：）应用：发育生物学，遗传学、衰老和基因组学研究发育生物学，遗传学、衰老和基因组学研究细胞生物学、果蝇、果蝇）特点特点繁殖迅速繁殖迅速, ,染色体巨大染色体巨大, ,易于进行基因定位易于进行基因定位. .由由1414个体节构成的躯干完全对称个体节构成的躯干完全对称, ,一套基因控制了一套基因控制了这些体节从上到下的发生过程这些体节从上到下的发
53、生过程, ,这套基因普遍存在这套基因普遍存在于从昆虫到人的基因组中于从昆虫到人的基因组中, ,是决定机体左右对称布是决定机体左右对称布局形成的最基本因素局形成的最基本因素. .）应用：）应用：主要用于遗传和发育研究主要用于遗传和发育研究 细胞生物学、斑马鱼、斑马鱼）特点）特点: :产卵多产卵多, ,繁殖迅速繁殖迅速胚胎通体透明胚胎通体透明, ,）应用：）应用：是进行胚胎发育机理和基因组研究的好材料是进行胚胎发育机理和基因组研究的好材料细胞生物学、小鼠、小鼠 ）特点：）特点：小型哺乳动物，进化上与人类接近，小型哺乳动物，进化上与人类接近，）应用：）应用：遗传学，组织学，胚胎学，细胞生物学研究遗传
54、学，组织学，胚胎学，细胞生物学研究细胞生物学、拟南芥、拟南芥拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于这种植物具有以下特点：物，其原因主要基于这种植物具有以下特点：（1 1）形态个体小，高度只有）形态个体小，高度只有3Ocm3Ocm左右；左右；（2 2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6 6周左右；周左右；（3 3）种子多，每株每代可产生数千粒种子；）种子多，每株每代可产生数千粒种子
55、；（4 4）形态特征简单；）形态特征简单；（5 5）基因组小，只有）基因组小，只有5 5对染色体。对染色体。细胞生物学细胞生物学研究方法结束语细胞生物学研究方法结束语过上面的介绍我们看到，模式生物已经在现代生命科学基础过上面的介绍我们看到，模式生物已经在现代生命科学基础研究中具有举足轻重的地位。但是，模式生物在我国的研究研究中具有举足轻重的地位。但是，模式生物在我国的研究才刚刚起步，与国际领先研究水平差距很大。作为亡羊补牢才刚刚起步，与国际领先研究水平差距很大。作为亡羊补牢之举，我国启动了之举，我国启动了家蚕模式生物家蚕模式生物的研究计划，试图建立另具的研究计划，试图建立另具特色的新模式生物（
56、家蚕是鳞翅目昆虫的代表物种，果蝇属特色的新模式生物（家蚕是鳞翅目昆虫的代表物种，果蝇属双翅目昆虫）。双翅目昆虫）。不论将来生命科学如何发展，果蝇、线虫、酵母、小鼠这些经不论将来生命科学如何发展，果蝇、线虫、酵母、小鼠这些经典模式生物在科学史上的地位已永远不可撼动，与此相关的典模式生物在科学史上的地位已永远不可撼动，与此相关的一串名字，将和他们闪光的思想一道，永载史册。一串名字，将和他们闪光的思想一道，永载史册。除了一段段引人入胜的生命故事，模式生物还具有更深远的意除了一段段引人入胜的生命故事，模式生物还具有更深远的意义。它昭示于人的，乃是最不可思议的事实：这世界竟是可义。它昭示于人的，乃是最不可思议的事实：这世界竟是可以理解的以理解的 细胞生物学
