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1、毛细管电泳法毛细管电泳法CapillaryElectrophoresis,CEn毛细管电泳是带电粒子在毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。高效毛细管电泳。n20世纪世纪3040年代年代蒂蒂塞利乌斯塞利乌斯(A.W.K.Tiselius建立建立了移动界面电泳，将电泳发展成了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术分离技术获得获得1948年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖n 1981年 J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs
2、实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。n 上一世纪后二十多年分析化学领域中发展最迅速的分离分析方法。 主要内容主要内容n毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理n分离模式分离模式n进样与检测进样与检测n毛细管电泳的应用毛细管电泳的应用一一毛细管电泳的原理毛细管电泳的原理1安装安装毛细管毛细管数据处理数据处理电极电极检测器检测器电极电极试样试样缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液高压电源高压电源（可高至（可高至30KV）2电泳和电渗电泳和电渗n电泳电泳n是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。移动的现象。n电渗电渗n是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内是
3、指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。液体沿固体表面移动的现象。2 电泳和电渗 n电泳电泳n行为与特性使用淌度描述行为与特性使用淌度描述即单位场强即单位场强(E)下离子的平均电泳速度下离子的平均电泳速度nep=/En实验中，只发生电泳时有效淌度实验中，只发生电泳时有效淌度nef=ef(L/V)=(l/tm)(L/V)n毛细管有效长度毛细管有效长度迁移时间迁移时间n毛细管总长度毛细管总长度电压电压n电渗电渗n与固液界面的双电层有着密切的关系与固液界面的双电层有着密切的关系n在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面
4、，形成一相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流移，便形成了电渗流electroosmoticflow,EOF）。）。2 电泳和电渗 固液两相间的固液两相间的总电势总电势-热力学热力学电势电势-0 Zeta电势- n电渗流的流型特点电渗流的流型特点n电渗流电渗流HPLCn塞流塞流层流层流2 电泳和电渗 n电渗流的表示电渗流的表示n电渗流的大小可用淌度电渗流的大小可用淌度(eo)或电
5、渗流或电渗流系数表示系数表示neo=eo/E=l/(teoE)n电渗流速度电渗流速度毛细管有效长度毛细管有效长度n电渗流流出时间电渗流流出时间电场强度电场强度2 电泳和电渗 n电渗流的意义电渗流的意义n电泳过程中，伴随着电渗现象电泳过程中，伴随着电渗现象n电渗流的速度比电泳速度快电渗流的速度比电泳速度快57倍倍n利用电渗流可将正、负离子或中性分利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析子的分离分析n电渗流是毛细管电泳分离的重要参数电渗流是毛细管电泳分离的重要参数n控
6、制电渗流的大小和方向，可提高毛控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离细管电泳分离的效率、重现性、分离度。度。分情况而论2 电泳和电渗 n改变电渗流的方法改变电渗流的方法n改变外加径向电场改变外加径向电场n改变缓冲液成分和浓度改变缓冲液成分和浓度Zeta电势电势n改变缓冲液改变缓冲液pHn加入添加剂加入添加剂n改变温度改变温度粘度粘度盐盐-离子强度离子强度表面活性剂表面活性剂eo正比于正比于Zeta电势和介质的电势和介质的介电常数介电常数 反比于介质的黏度反比于介质的黏度Zeta电势正比于双电层厚度和电势正比于双电层厚度和界面有效电荷密度界面有效电荷密度 反比于介质的介
7、电常数反比于介质的介电常数2 电泳和电渗 表观电泳淌度表观电泳淌度 apap=ap/E ap为离子的表观迁移速度为离子的表观迁移速度 ap=ef +eo ap= ef + eo2 电泳和电渗 3 分离效率和分离度 n分离效率分离效率n柱效可以用理论塔板数柱效可以用理论塔板数n表示表示nn=(ep+eo)Vl/(2DL)n毛细管电泳分离的柱效方程毛细管电泳分离的柱效方程n理论塔板高理论塔板高nH=L/nnn=5.54(/W)2实验上可按上式求出理论塔实验上可按上式求出理论塔板数板数n为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离nW为电泳峰的半高峰宽为电泳峰的半
8、高峰宽n分离度分离度n电泳中两峰的分离度电泳中两峰的分离度Rs），也称），也称为分辨率，它表示了淌度相近的组分为分辨率，它表示了淌度相近的组分分开的能力，可表达为分开的能力，可表达为nRs=（n1/2/4）（/平平）n相邻两区带的迁移速度差相邻两区带的迁移速度差n平为两者的平均速度平为两者的平均速度n/平表示分离选择性平表示分离选择性nn为柱效为柱效3 分离效率和分离度 n分离度计算式分离度计算式nRs=2(tm2-tm1)/(W1+W2)ntm1、tm2分别为两个组份的迁移分别为两个组份的迁移时间时间nW为峰底的宽度为峰底的宽度3 分离效率和分离度 4区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素
9、n区带宽度区带宽度n Ws = Ws =（Wtl/tmWtl/tm）-Wd -Wd 时间宽度时间宽度检测器的窗口宽度检测器的窗口宽度空间宽度空间宽度n区带宽度展宽因素区带宽度展宽因素 n焦耳热焦耳热 n进样进样n电泳扩散电泳扩散n毛细管壁对组分的吸附毛细管壁对组分的吸附 n 4区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素n焦耳热焦耳热nn细内径（细内径（100m），粗外径的毛细管），粗外径的毛细管柱柱温度轮廓温度轮廓 - 黏度轮廓黏度轮廓 -速度轮廓速度轮廓4区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素n进样进样n试样导入毛细管柱时，总有一定的试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。试样区带长度。
10、n细内径的毛细管柱时，进样操作的要细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。求更为严格。n一般进样区带控制在一般进样区带控制在柱长的柱长的1%n电泳扩散电泳扩散n试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。起区带电分散。ns-bn峰前展或拖尾？峰前展或拖尾？4区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素n毛细管壁对组分的吸附毛细管壁对组分的吸附n电泳峰拖尾或变形，甚至消失。电泳峰拖尾或变形，甚至消失。n抑制吸附作用常用的方法
11、有：抑制吸附作用常用的方法有：n使用极端使用极端pH条件条件n加入中性盐或两性离子化合物加入中性盐或两性离子化合物n对毛细管内壁进行涂层处理对毛细管内壁进行涂层处理n需要注意：方法也会抑制或改变电渗需要注意：方法也会抑制或改变电渗流流4区带宽度及其展宽因素区带宽度及其展宽因素二二分离模式分离模式 1 1 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 2 2 胶束电动色谱胶束电动色谱 3 3 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 4 4 毛细管等速电泳毛细管等速电泳 5 5 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 6 6 毛细管电色谱毛细管电色谱1 毛细管区带电泳 CZE CZE 也称为毛细管自由溶液区带电泳也称为毛细管自由溶液
12、区带电泳 毛毛细细管管电电泳泳中中最最基基本本的的操操作作模模式式，应应用用最最广广泛泛，是是其其它各种操作模式的母体它各种操作模式的母体 2 胶束电动色谱 电动色谱电动色谱: :是以电渗流驱动的一种色谱技术是以电渗流驱动的一种色谱技术胶胶束束电电动动色色谱谱 MEKC:MEKC:是是以以胶胶束束为为假假固固定定相相的的一一种种电电动动色色谱，是电泳技术和色谱技术的结合谱，是电泳技术和色谱技术的结合加入高于胶束临界浓度的加入高于胶束临界浓度的表面活性剂表面活性剂胶束电动色谱的应用特点胶束电动色谱的应用特点: :使使毛毛细细管管电电泳泳不不仅仅能能分分离离离离子子化化合合物物，而而且且还还能能分
13、离中性化合物分离中性化合物. .比高效液相色谱更为高效比高效液相色谱更为高效. . HPLC HPLC 分离柱效为分离柱效为500050002500025000理论板数理论板数/m/m MEKC MEKC 可达到可达到5000050000500000500000理论板数理论板数/m /m 比比高高效效液液相相色色谱谱更更为为高高速速.MEKC.MEKC分分离离时时间间通通常常小小于于30min30min，但但达达到到相相仿仿效效率率的的毛毛细细管管LCLC，需需要要更更长的时间。长的时间。 2 胶束电动色谱3 毛细管凝胶电泳CGE CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式是毛细管自
14、由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式 用用多多孔孔性性的的凝凝胶胶或或其其它它筛筛分分剂剂作作介介质质，网网状状结结构构，按分子的大小分离按分子的大小分离 毛毛细细管管凝凝胶胶电电泳泳综综合合了了电电泳泳技技术术和和平平板板凝凝胶胶电电泳泳的的优点优点 : :电泳峰尖锐，柱效极高电泳峰尖锐，柱效极高短柱上实现极好的分离短柱上实现极好的分离试样容量为试样容量为101012g12g主要缺点主要缺点: :制备柱较困难，寿命较短制备柱较困难，寿命较短已已成成为为分分离离分分析析生生物物大大分分子子如如蛋蛋白白质质、多多肽肽、核核 酸酸、DNADNA等等强强有有力力的的工工具具。例例应应用用CGECGE分
15、分离离与与激激光诱导荧光检测相结合，用于光诱导荧光检测相结合，用于DNADNA序列快速分析。序列快速分析。3 毛细管凝胶电泳4毛细管等速电泳毛细管等速电泳分分离离是是建建立立在在试试样样中中各各组组分分的的电电泳泳淌淌度度不不同同，等等速速电电泳泳中中被被分分析析试试样样进进样样前前后后分分别别使使用用前前导导电电解解质质溶溶液液和和终终结结电电解解质质溶溶液液，分分离离后后的的各各组组分分区区带带以以相相同同的的电泳迁移速度通过检测窗口。电泳迁移速度通过检测窗口。 4毛细管等速电泳毛细管等速电泳留意留意:前前导导电电解解质质的的电电泳泳淌淌度度应应高高于于试试样样中中各各组组分分的的电电泳泳
16、淌淌度度，而而终终结结电电解解质质的电泳淌度则反之。的电泳淌度则反之。电电泳泳过过程程中中被被分分离离各各组组分分的的浓浓度度都都将将接接近近前前导导电电解解质质浓浓度度，对对痕痕量量组组分分在在柱柱上上浓浓缩缩可可达达几几个个数数量量级级，成成为为重要的柱上浓缩技术之一。重要的柱上浓缩技术之一。4毛细管等速电泳毛细管等速电泳5 毛细管等电聚焦CIEF:CIEF: 建建立立在在不不同同蛋蛋白白质质或或多多肽肽之之间间等等电电点点pIpI值值差差异异基基础础上上的的分分离离方方法。法。蛋白质的等电点蛋白质的等电点(pI):(pI): 指指蛋蛋白白质质分分子子的的表表观观电电荷荷数数为为零零时的时
17、的pHpH值。值。 方法方法:进样等电聚焦检测进样等电聚焦检测先先将将脱脱盐盐的的试试样样蛋蛋白白质质以以1的的浓浓度度与与两两性性电电解解质质溶溶液液混混合合，用用压压力力进进样样充充入入毛毛细细管管柱柱(阳阳极极端端)，置置于于阳阳极极电电解解质质溶溶液液如如H3PO4中中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。中。施施加加电电压压，进进行行电电泳泳实实验验。两两性性电电解解质质离离子子形形成成pH的的位位置置梯梯度度，而而蛋蛋白白质质在在迁迁移移时时会会在在其其等等电电点点的的pH区区域域内内停停止止移移动动。这这样样pI不不同同的的蛋蛋白白质质各各
18、组组分分会会在在毛毛细细管管内内很很窄窄的的不不同同pH区区域域内内聚聚焦焦.在在阳阳、阴阴极极电电解解液液中中加加入入盐盐如如NaCI或或NaOH,破破坏坏pH梯梯度度，使使各各组组分分蛋蛋白白质质重重新新带带电电，在在电电场场力力作作用用下下发发生生迁迁移移、检检测测，使使不不同同组组分分的的蛋蛋白白质质得到分离。得到分离。5 毛细管等电聚焦n特点特点: :n等等电电聚聚焦焦实实际际上上也也是是一一个个试试样样浓浓缩缩过过程程，这这一一过过程程可可用用于于浓浓缩缩试试样样组组分。分。n具具有有极极高高的的分分辩辩率率，可可以以分分离离等等电电点相差点相差0.01pH0.01pH的两种蛋白质
19、的两种蛋白质. .n留留意意: :电电渗渗流流的的存存在在会会破破坏坏聚聚焦焦区区带带的稳定的稳定 5 毛细管等电聚焦6 毛细管电色谱nCEC:CEC:以电渗流驱动流动相，以电渗流驱动流动相，n 开管和填充两种开管和填充两种n比比高高效效液液相相色色谱谱具具有有更更高高的的柱柱效效 三三进样与检测进样与检测1 1 进样方法进样方法电动进样电动进样 也称电迁移进样也称电迁移进样. . 方方法法: :将将毛毛细细管管的的进进样样端端插插入入装装有有试试样样溶溶液液的的试试样样管管中中，试试样样管管中中插插入入电电极极，与与检检测测端端的的缓缓冲冲液液间间施施加加进进样样电电压压，并并维维持持一一定
20、定时时间间，试试样样溶溶液液在在电电泳泳和和电电渗渗流流作作用用下下进进入入毛毛细细管管，然然后后再再将将试试样样溶溶液液换换成成载载体体缓冲液，电泳即可进行。缓冲液，电泳即可进行。 1进样方法进样方法n流体动力学进样流体动力学进样 n 也也称称为为虹虹吸吸进进样样、重重力进样、压差进样力进样、压差进样n方方法法: :毛毛细细管管进进样样端端插插入入试试样样溶溶液液容容器器，通通过过进进样样端端加加压压，或或检检测测端端出出口口减减压压，或或调调节节进进样样端端试试样样溶溶液液液液面面大大于于出出口口端端缓缓冲冲液液液液面面高高度度，利利用用虹虹吸吸现现象象，使使进进样样口口端端与与出出口口端
21、端形形成成正正压压差差，并并维维持持一一定定时时间间，试试样样在在压压差差作作用用下下进进入入毛毛细细管管进进样样端端，再再把把进进样样端端放放回缓冲液液槽中，进行电泳回缓冲液液槽中，进行电泳 2检测方法检测方法 紫外吸收紫外吸收检测器检测器2检测方法检测方法检测器检测器检出限检出限mol/L）特特点点UV可见吸收可见吸收10-510-6近似通用，常规近似通用，常规应用应用荧光荧光非相干光诱导非相干光诱导10-710-8灵敏，但试样通常灵敏，但试样通常要衍生要衍生激光诱导激光诱导10-1010-12高灵敏度，价格高灵敏度，价格昂贵，要衍生化昂贵，要衍生化电化学电化学电导电导10-510-7通用性通用性安培安培10-810-9选择性，灵敏度选择性，灵敏度高，微量高，微量质谱质谱10-710-9仪器复杂，可获结仪器复杂，可获结构信息，构信息，质量灵敏度高质量灵敏度高放射放射10-910-11灵敏度高，操作灵敏度高，操作有特殊要求有特殊要求四四运用运用阵列毛细管凝胶电泳分析阵列毛细管凝胶电泳分析DNA序列序列硬件由十六条毛细管组成阵列硬件由十六条毛细管组成阵列用氩激光激发荧光检测用氩激光激发荧光检测CCD检测器接收荧光检测器接收荧光可以进行连续地大规模地基因测可以进行连续地大规模地基因测量量
