第九章第九章 配子与胚胎生物工程配子与胚胎生物工程技术技术刘刘 宏宏 n配子与胚胎生物工程概述配子与胚胎生物工程概述n胚胎移植技术胚胎移植技术n其他胚胎工程技术概述其他胚胎工程技术概述 n配子与胚胎生物工程配子与胚胎生物工程也称也称胚胎生物技术或胚胚胎生物技术或胚胎工程技术胎工程技术，主要是对动物的，主要是对动物的卵子、精子和卵子、精子和胚胎胚胎在体外条件下进行各种操作，以在体外条件下进行各种操作，以加速繁加速繁育经济动物育经济动物，，培育优良品种培育优良品种，或，或挽救濒危动挽救濒危动物物使用的一系列工程技术方法使用的一系列工程技术方法第一节第一节 配子与胚胎生物工程概述配子与胚胎生物工程概述 研究内容n胚胎移植胚胎移植n胚胎冷冻胚胎冷冻保存保存n体外受精体外受精n动物克隆动物克隆n转基因技术转基因技术n性别控制性别控制n胚胎干细胞技术胚胎干细胞技术n胚胎胚胎嵌合嵌合技术技术 胚胎移植一、胚胎移植技术概述一、胚胎移植技术概述二、胚胎移植的意义二、胚胎移植的意义三、国内外发展概况三、国内外发展概况四、胚胎移植的基本原则四、胚胎移植的基本原则五、牛胚胎移植操作步骤五、牛胚胎移植操作步骤 一、胚胎移植技术概述1.1.定义定义n胚胎移植是指将一头胚胎移植是指将一头良种母畜配种后的早期胚胎良种母畜配种后的早期胚胎取出（或通过体外受精及其他方式得到体外生取出（或通过体外受精及其他方式得到体外生产的胚胎），产的胚胎），移植到另一头移植到另一头同种且生理状态相同种且生理状态相同同的母畜体内，使之继续发育成为新个体的过的母畜体内，使之继续发育成为新个体的过程。
程n实际上是由实际上是由产生良种胚胎的供体产生良种胚胎的供体和和养育胚胎的受养育胚胎的受体体分工合作共同繁殖后代的技术分工合作共同繁殖后代的技术 牛牛牛牛胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植技技技技术术术术路路路路线线线线示示示示意意意意图图图图 n着床前早期胚胎的游离状态；着床前早期胚胎的游离状态；n不同个体（物种）早期胚胎发不同个体（物种）早期胚胎发育内环境相似；育内环境相似；n不会发生免疫排斥不会发生免疫排斥2.2.理论基础理论基础 二、 胚胎移植的意义n充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大良种畜群良种畜群n加速育种进程加速育种进程n简化良种引进方法简化良种引进方法n保存品种资源保存品种资源n诱发单胎动物产双胎诱发单胎动物产双胎n研究手段研究手段 三、国内外发展概况 胚胎移植技术是胚胎移植技术是2020世纪畜牧业中继人工世纪畜牧业中继人工授精技术之后又一次巨大变革，业已成为一授精技术之后又一次巨大变革，业已成为一项充分发挥优良母畜繁殖潜力的实用繁殖新项充分发挥优良母畜繁殖潜力的实用繁殖新技术•19511951年，美国诞生第一头胚胎移植犊牛年，美国诞生第一头胚胎移植犊牛。
•19761976年，牛非手术法胚胎移植获得成功年，牛非手术法胚胎移植获得成功1.1.胚胎移植历史胚胎移植历史 18901890年年 英国第一次兔获得胚胎移植成功英国第一次兔获得胚胎移植成功19341934年年 绵羊绵羊19491949年年 山羊山羊19511951年年 猪猪19511951年年 牛牛19701970年年 马马19751975年年1 1月月 美国丹佛召开第一届国际胚胎移植学会美国丹佛召开第一届国际胚胎移植学会19801980年代年代 欧洲使用欧洲使用MOET MOET 奶牛育种奶牛育种 n国国际际间间胚胚胎胎贸贸易易非非常常活活跃跃，，早早在在19941994年年，，全全世世界界仅仅胚胚胎胎移移植植牛牛就就已已超超过过350,000350,000头头，，其中进出口的胚胎约占总数的其中进出口的胚胎约占总数的10%10%n近近年年来来，，国国际际上上胚胚胎胎的的产产量量和和贸贸易易量量则则成成倍增长 2.2.发展前景发展前景• •我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成。
我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成• •农业产业结构的调整，畜牧业发展形势一片大好；农业产业结构的调整，畜牧业发展形势一片大好；农业产业结构的调整，畜牧业发展形势一片大好；农业产业结构的调整，畜牧业发展形势一片大好；• •胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植技技技技术术术术作作作作为为为为扩扩扩扩大大大大良良良良种种种种牲牲牲牲畜畜畜畜数数数数量量量量的的的的一一一一种种种种最最最最好好好好手手手手段段段段，，，，将将将将在在在在畜畜畜畜牧牧牧牧业业业业生生生生产产产产中中中中起起起起到到到到越越越越来来来来越越越越大大大大的的的的作作作作用用用用，，，，胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植技技技技术术术术产业化前景十分广阔产业化前景十分广阔产业化前景十分广阔产业化前景十分广阔 四、胚胎移植的基本原则四、胚胎移植的基本原则u移植前后所处的环境应是相同移植前后所处的环境应是相同或或相似的相似的u移植的时间要适宜移植的时间要适宜u胚胎的发育应当正常胚胎的发育应当正常 n供体和受体在供体和受体在种属种属上必须一致；上必须一致； n供供体体和和受受体体在在生生理理上上必必须须一一致致：：供供、、受受体体在在发发情情时时间间上上应应同同期期化化，，一一般般相相差差不不超超过过24h24h，，否否则则移移植植成功率显著下降；成功率显著下降；n从从供供体体中中收收集集胚胚胎胎的的部部位位与与给给受受体体移移植植胚胚胎胎的的部部位位必必须须一一致致：：即即从从供供体体子子宫宫角角内内收收集集到到的的胚胚胎胎应应该移植到受体的子宫角内。
该移植到受体的子宫角内1.1.移植前后所处的环境应是相同或相似的移植前后所处的环境应是相同或相似的 n胚胚胎胎收收集集与与移移植植的的时时间间不不能能超超过过周周期期黄黄体体的的寿寿命命，，因因此此，，胚胚胎胎的的收收集集时时间间不不能能超超过过发发情情配配种种后后第第7 7天天，，最最好好是是在在发发情情配配种种后后的的第第5-75-7天天内进行2.2.移植的时间要适宜移植的时间要适宜 n胚胎的收集及移植过程应当严格按照要求进行，胚胎的收集及移植过程应当严格按照要求进行，尽量不使其受到物理、化学或生物方面的影响尽量不使其受到物理、化学或生物方面的影响n同时，胚胎移植前需进行鉴定，确定其发育正常同时，胚胎移植前需进行鉴定，确定其发育正常者才能进行移植者才能进行移植3.3.胚胎的发育应当正常胚胎的发育应当正常 五、胚胎移植操作步骤五、胚胎移植操作步骤Ø供、受体牛的选择供、受体牛的选择Ø供体的超数排卵与人工授精供体的超数排卵与人工授精Ø受体的同期发情受体的同期发情Ø胚胎的收集胚胎的收集Ø胚胎的检查和评定胚胎的检查和评定Ø胚胎的移植胚胎的移植 1.1.供、受体的选择供、受体的选择 n供供体体应应是是良良种种，，而而且且为为性性状状表表现现优优秀秀、、具具有有较较高高育种价值与遗传优势的个体；育种价值与遗传优势的个体；n供供体体应应健健康康无无病病，，膘膘情情中中等等偏偏上上，，年年龄龄以以青青壮壮年年为佳；为佳；n供供体体生生殖殖机机能能应应处处在在较较高高水水平平。
既既无无难难产产、、流流产产等等繁繁殖殖病病史史，，也也无无子子宫宫卵卵巢巢疾疾病病，，超超排排处处理理前前应应有两个或两个以上的正常情期有两个或两个以上的正常情期 1.1 1.1 供体母畜的选择供体母畜的选择 ü一般选用一般选用价格低廉、生产性能比较低的同种母畜，达到配价格低廉、生产性能比较低的同种母畜，达到配种年龄和体型；种年龄和体型；ü要具有良好的健康状态，体型与膘情中上等，初产或经产要具有良好的健康状态，体型与膘情中上等，初产或经产青壮年母畜检疫和疫苗接种与供体相同；青壮年母畜检疫和疫苗接种与供体相同；ü应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，无子宫卵巢疾病，移植胚胎前应有两个或两个以上的正常移植胚胎前应有两个或两个以上的正常情期，也不能与公畜同群情期，也不能与公畜同群 1.1.2 2 受体母畜的选择受体母畜的选择 2.1 2.1 超排定义超排定义n在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，筒称排卵，筒称“超排超排”。
2.2.供体的超数排卵与人工授精供体的超数排卵与人工授精 n牛有牛有PG+FSHPG+FSH法和法和CIDA+FSHCIDA+FSH法两种；法两种；n发情后发情后9 9－－1313天开始；天开始；n常用的激素为常用的激素为FSHFSH；注射方法一般是连续；注射方法一般是连续4d4d递减注递减注射射, ,每天每天2 2次次, ,间隔间隔1212小时（半衰期短）小时（半衰期短）；；n发情后发情后8 8－－1212小时配种，间隔小时配种，间隔1212小时再配种一次小时再配种一次 2.2 2.2 超数排卵方法超数排卵方法 n在在发发情情周周期期第第1010、、1111、、1212、、1313天天每每头头牛牛分分别别肌肌注注FSH FSH 160160、、140140、、110110、、90 90 单单位位（（共共500IU)500IU)，，每每天天分分两两次次注注射射，，在在第第1212天天注注射射FSHFSH的的同同时时肌肌注注PGPG，，上上午午2 2支支/ /头，下午头，下午1 1支支/ /头n发情后供体发情后供体AIAI或配种或配种2 2-3 3次供体牛的超排方案供体牛的超排方案 3.3.受体的同期发情3.1 3.1 定义定义n利用某些外源激素利用某些外源激素人为控制人为控制并调整一群母畜发情并调整一群母畜发情周期的过程周期的过程, ,使之在预定的时间内集中发情使之在预定的时间内集中发情, ,以便以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法方法, ,也称也称同步发情同步发情。
n缩短黄体期的前列腺素法缩短黄体期的前列腺素法(PG(PG法法) )n延长黄体期的孕酮法延长黄体期的孕酮法 3.2 3.2 同期发情方法同期发情方法 PGF PGF2α2α有溶解黄体的作用，从而引起发情，所有溶解黄体的作用，从而引起发情，所以只对卵巢上存在黄体的受体有效以只对卵巢上存在黄体的受体有效n在情期第在情期第9 9天以后，注射天以后，注射PGFPGF2α2α，常可在注射后，常可在注射后2-32-3天内发情天内发情n对于不能确定发情周期的受体，可采用间隔对于不能确定发情周期的受体，可采用间隔10-1210-12天的两次注射法天的两次注射法n此方法方便可靠，但费用较高此方法方便可靠，但费用较高 3.2.1 3.2.1 前列腺素处理法前列腺素处理法 n孕孕酮酮能能够够抑抑制制腺腺垂垂体体释释放放FSHFSH，，每每日日肌肌注注或或口口服服孕孕酮酮，，或或经经阴阴道道海海绵绵栓栓给给予予孕孕酮酮或或其其类类似似物物，，一一般般处处理理12-1812-18天天后后，，可可以以抑抑制制卵卵泡泡发发育育停停止止处处理理或或撤撤除除海海绵绵栓栓后后，，孕孕酮酮的的抑抑制制作作用用消消失失，，卵卵巢巢上上即即有卵泡发育，通常在有卵泡发育，通常在2-32-3天内发情。
天内发情n为为了了提提高高排排卵卵的的效效率率，，在在孕孕激激素素处处理理结结束束的的前前一一天，可以给予小剂量的天，可以给予小剂量的FSHFSHn此法费用低，但处理时间长此法费用低，但处理时间长 3.2.2 3.2.2 孕激素处理法孕激素处理法 4.1 4.1 冲胚液和保存液的制作冲胚液和保存液的制作n冲胚液有很多种，目前最常用的为含冲胚液有很多种，目前最常用的为含5%5%犊牛血清犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBSD-PBS），也可用于体外），也可用于体外短期保存胚胎短期保存胚胎n保存时间长或体外培养多用保存时间长或体外培养多用M-199M-199液4.4.胚胎的收集胚胎的收集 4.2 4.2 回收过程回收过程n牛牛适宜于适宜于5-75-7日龄日龄胚胎胚胎; ;n现现均均采采用用二二通通管管非非手手术术采采卵卵法法：：用用直直肠肠把把握握子子宫宫颈颈法法插插入入带带有有探探针针的的二二通通管管直直至至一一侧侧子子宫宫角角的的基基部部，，通通过过打打气气孔孔注注入入8--10ml8--10ml空空气气, ,抽抽出出探探针针，，通通过过中中心心管管道道反反复复注注入入----回回收收冲冲卵卵液液, ,连连续续5--65--6次次。
同样方法冲另一侧子宫角同样方法冲另一侧子宫角 n子子宫宫角角回回收收的的液液体体较较多多，，可可以以通通过过专专用用胚胚胎胎漏漏斗斗除除去去多多余余的的冲冲卵卵液液，，在在连连续续变变倍倍解解剖剖显显微微镜镜（实体显微镜）下进行（实体显微镜）下进行检胚检胚；；n胚胚胎胎的的质质量量评评定定：：主主要要采采用用形形态态学学方方法法，，优优质质胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植 5. 5.胚胎的检查和评定胚胎的检查和评定 nA A级级; ;形态完整形态完整, ,轮廓清晰轮廓清晰, ,呈球形呈球形, ,分裂球大小均分裂球大小均匀匀, ,透明带适中；透明带适中；nB B级级; ;轮廓清晰轮廓清晰, ,色调和细胞密度良好；色调和细胞密度良好； nC C级级; ;轮廓不清楚轮廓不清楚, ,色调发暗色调发暗, ,结构较松散结构较松散, ,游离的游离的细胞和液胞较多；细胞和液胞较多； nD D级级; ;轮廓模糊轮廓模糊, ,色调暗色调暗, ,结构松散结构松散, ,碎片细胞和液碎片细胞和液泡很多 5.1 5.1 胚胎的分级标准胚胎的分级标准 5.2 5.2 不同发育阶段的正常胚胎不同发育阶段的正常胚胎 5.3 5.3 未受精卵或异常胚胎未受精卵或异常胚胎 2-cell4-cell8-cell16-cellMorulaBlastocyst5.4 5.4 正常胚胎的形态正常胚胎的形态 6.6.胚胎的移植胚胎的移植 n重点应检查重点应检查子宫和卵巢的异常情况以及子宫的紧张子宫和卵巢的异常情况以及子宫的紧张性，然后检查卵巢上黄体的发育情况（位置、大小）性，然后检查卵巢上黄体的发育情况（位置、大小），只有黄体发育良好者才能正式列为待移植母牛，只有黄体发育良好者才能正式列为待移植母牛，，并记录和在牛臀部标出黄体位于左右哪一侧。
并记录和在牛臀部标出黄体位于左右哪一侧 n牛站立保定于六柱栏保定架内，用牛站立保定于六柱栏保定架内，用2%2%盐酸利多卡因盐酸利多卡因或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉，用或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉，用1818号针头，号针头，每只牛约每只牛约5ml5ml6.16.1受体母牛的准备受体母牛的准备 1.1ml注射器注射器 2.装管接头装管接头 3.细管细管A.棉塞棉塞 B.气泡气泡 ⅠⅠ、、ⅢⅢ、保护液、保护液 Ⅱ.Ⅱ.含胚段含胚段装管器械和装管方法装管器械和装管方法 6.2 6.2 胚胎的移植方法胚胎的移植方法 直肠把握法直肠把握法 20032003年年9 9月月4 4日降生的良种胚胎移植牛日降生的良种胚胎移植牛 （江苏省农业三项工程项目）（江苏省农业三项工程项目） 受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛 （江苏省农业三项工程项目）（江苏省农业三项工程项目） 外国专家来访外国专家来访 外国专家来访外国专家来访 n胚胎冷冻胚胎冷冻n体外受精体外受精n动物克隆动物克隆n转基因技术转基因技术n性别控制性别控制n胚胎干细胞胚胎干细胞n嵌合体技术嵌合体技术第三节第三节 其他胚胎工程技术概述其他胚胎工程技术概述 胚胎冷冻胚胎冷冻n胚胚胎胎的的冷冷冻冻保保存存，，是是将将胚胚胎胎贮贮存存在在－－196℃196℃超低温下长期保存的方法。
超低温下长期保存的方法n2020世记世记7070年代试验成功年代试验成功–是是胚胚胎胎移移植植技技术术的的重重大大突突破破，，使使胚胚胎胎移移植植不不受受时时间间和和地地点点的的限限制制，，从从而而扩扩大大了了胚胚胎胎移移植植技技术术的效率–是长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施是长期保存优良母牛基因最可靠的技术措施 体外受精体外受精 试试管管动动物物技技术术即即胚胚胎胎体体外外生生产产技技术术，，是是相相对对于于体体内内胚胚胎胎而而言言的的, ,是是指指卵卵母母细细胞胞在在体体外外成成熟熟后后与与获获能能的的精精子子体体外外受受精精并并分分裂裂发发育育到到桑桑椹椹胚或囊胚期胚或囊胚期(5-7(5-7天天) )的技术 生殖细胞生殖细胞的收集的收集精子精子卵母细胞卵母细胞 卵母细胞卵母细胞体外成熟培养体外成熟培养受精受精 受精卵的体外培养受精卵的体外培养 精子精子体外获能体外获能 克隆定义克隆定义ncloneclone，愿意为树木的枝条，在生物学中指一个细胞或，愿意为树木的枝条，在生物学中指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖称无性繁殖( (细胞细胞) )系。
系n克隆克隆====无性繁殖无性繁殖克隆技术克隆技术 n细胞核移植技术（细胞核移植技术（NTNT），就是将供体细胞核移），就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖就可被激活、分裂并透等有性过程即无性繁殖就可被激活、分裂并发育成新的个体，使得核供体的基因得到完全发育成新的个体，使得核供体的基因得到完全复制n依供体核的来源可分为：胚细胞核移植、胚胎依供体核的来源可分为：胚细胞核移植、胚胎干细胞核移植与体细胞核移植干细胞核移植与体细胞核移植克隆技术克隆技术 转基因技术转基因技术n转转基基因因动动物物就就是是用用实实验验室室方方法法将将人人们们需需要要的的目目的的基基因因导导入入动动物物胚胚胎胎或或配配子子，，使使外外源源基基因因与与动动物物本本身身的的基基因因整整合合在在一一起起，，并并随随细细胞胞的的分分裂裂而而增增殖殖，，在在动动物物体体内内得得到到表表达达，，并能稳定地遗传给后代并能稳定地遗传给后代 性别控制技术性别控制技术定义定义 性别控制性别控制指通过人为干预并按人们的愿望使雌性指通过人为干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。
动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术n对高效优质的发展畜牧业具有重要意义：对高效优质的发展畜牧业具有重要意义：n可使可使受性别限制受性别限制的生产性状（如泌乳性状）和的生产性状（如泌乳性状）和受受性别影响性别影响的生产性状（如肉用、毛用性状等）能的生产性状（如肉用、毛用性状等）能获得更大的经济效益；获得更大的经济效益； 干细胞：干细胞：具有自我复制的能力，在一定条件下能分具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能细胞化成各种功能细胞胚胎干细胞胚胎干细胞 嵌合体嵌合体 n嵌合体嵌合体 (chimera)(chimera)一词源于古希腊神话，其意是一词源于古希腊神话，其意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起来的怪兽指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起来的怪兽n中国的中国的““龙龙””：九似：九似 图腾图腾n““龙角似鹿、头似驼、眼似鬼、项似蛇、腹似蜃、龙角似鹿、头似驼、眼似鬼、项似蛇、腹似蜃、鳞似鲤、爪似鹰、掌似虎、耳似牛鳞似鲤、爪似鹰、掌似虎、耳似牛””n嵌合在生物学上是指同一个体中，基因型相异的嵌合在生物学上是指同一个体中，基因型相异的细胞或组织混合存在的状态细胞或组织混合存在的状态。
骡子骡子——天然嵌合体？天然嵌合体？骡子：不是是杂种骡子：不是是杂种 。