v第十章第十章 微生物的分微生物的分类和和鉴定定 分类学（分类学（TaxonomyTaxonomy））•源自希腊语的源自希腊语的 taxis (“arrangement”排列排列) and nomos (“law”法规法规)Classification (分类）分类）: 由具体到抽象由具体到抽象---收集大量描述有关个体的收集大量描述有关个体的 文献资料，整理成科学的分类系统文献资料，整理成科学的分类系统Identification（鉴定）（鉴定） :从抽象到具体从抽象到具体---将未识别的生物归类为将未识别的生物归类为 某一确定分类单元的行为和结果某一确定分类单元的行为和结果 Nomenclature（（命名）命名）: 对对每个新的类型微生物进行每个新的类型微生物进行命名的过程命名的过程•Taxonomy （分类学）（分类学） is an agreement among people 分类相关数据库分类相关数据库1））NCBI数据库：数据库：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy 优点：对自己的序列进行比较分析优点：对自己的序列进行比较分析 缺点：有很多错误的分类信息缺点：有很多错误的分类信息2））RDP数据库：数据库： http://rdp.cme.msu.edu（适用于群落结构分析）（适用于群落结构分析） 优点优点1：从：从NCBI取出取出16S rRNA基因序列后，通过分析确认其分类信息基因序列后，通过分析确认其分类信息 优点优点2：对很多（几百条）序列确定分类信息：对很多（几百条）序列确定分类信息 3））LPSN数据库：数据库： http://www.bacterio.cict.fr/ 优点：严格按照分类规则建立，能了解不同层次分类（包括典型菌株信息）优点：严格按照分类规则建立，能了解不同层次分类（包括典型菌株信息） 缺点：不能比较测序结果，不能进行分类鉴定缺点：不能比较测序结果，不能进行分类鉴定4）） EzTaxon：： http://eztaxon- 优点：包括优点：包括典型菌株信息，典型菌株信息，也也能比较测序结果，可以进行分类鉴定能比较测序结果，可以进行分类鉴定5））Bergey氏原核生物分类系统：不仅是序列信息，形态学、生化信息全氏原核生物分类系统：不仅是序列信息，形态学、生化信息全 第一节第一节 通用分类单元通用分类单元•Category （（taxon, 分类单位）分类单位）–Domain （域）（域） - Phylum，，Division（门）（门） - Class （纲）（纲） - Order （目）（目） - Family (科）科） - Genus (属）属） - species (种）种） （（ 各级分类单元各级分类单元FungiEukaryaAscomycotaHemiascomycetesSaccharomycetalesSaccharomycetaceaeSaccharomycesS. cerevisiaeBaker’s yeastSpeciesGenusFamilyOrderClassPhylumKingdomDomainAll organismsM. okinawensisMethanothermococcusMethanococcaceaeMethanococcalesMethanococciEuryarcheotaNone assigned for archaeaArchaeaMethanococcusE. coliE. coliEscherichiaEnterobacteriaceaeEnterobacterialesGammaproteobacteriaProteobacteriaNone assigned for bacteriaBacteria门门域域纲纲目目科科属属种种界界 种（种（species）的概念）的概念 微生物的微生物的种种（（species，，简写简写sp.，又译，又译物种物种）是一个基本分类单元，它是一大群）是一个基本分类单元，它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他物种有明显差异的菌株的总称。
同属内其他物种有明显差异的菌株的总称 菌株又称品系（在非细胞型的病毒中则称毒株或株），表示任何由菌株又称品系（在非细胞型的病毒中则称毒株或株），表示任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯遗传型群体及一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯遗传型群体及其一切后代其一切后代菌株菌株（（strain））菌株 (strain) = 纯培养物 (pure culture) = 克隆 (clone)典型菌株（（type strain）） 一个种内的一个典型菌株作为这个种的具体代表一个种内的一个典型菌株作为这个种的具体代表注意：典型菌株一般由两个以上国家的菌种保藏典型菌株一般由两个以上国家的菌种保藏 机构机构保藏，以便备保藏，以便备查考、索取和购买查考、索取和购买 •sp. vs spp.–Bacillus sp. （一种芽孢杆菌）（一种芽孢杆菌）–Bacillus spp. (若干种芽孢杆菌）若干种芽孢杆菌）•Strain (菌株菌株)–Escherichia coli K12•Type strain (典型菌株）典型菌株） Rhizobium daejeanense L61T 双名法双名法（（binominal nomenclature））双名法属名属名（（generic name））种名加词种名加词（（specific epithet）） 微生物微生物命名命名 （拉丁文）（拉丁文）例: Escherichia coli, E. coli, Escherichia sp. K12， Escherichia sp.，Escherichia spp., and “the genus Escherichia”属名可用缩写，但种名不能缩写属名可用缩写，但种名不能缩写属名可以单独用，但种名必须与属名一起用属名可以单独用，但种名必须与属名一起用属名和种名必须要用斜体，当手写时需用下划线属名和种名必须要用斜体，当手写时需用下划线文章中第一次用学名时需要用全称，第二次开始属名可以用缩文章中第一次用学名时需要用全称，第二次开始属名可以用缩写（但必须与种名一起用）。
写（但必须与种名一起用）如果用缩写后可能与其它属引起混淆，就不能用缩写如果用缩写后可能与其它属引起混淆，就不能用缩写Escherichia coli K12属名属名种名种名 菌株名菌株名 俗名俗名（（common name）） 指普通的、通俗的、地区性的名字，具有指普通的、通俗的、地区性的名字，具有大众化和简明的优点，但往往涵义不够确切，大众化和简明的优点，但往往涵义不够确切，易于重复，使用范围局限易于重复，使用范围局限例如，例如，“结核杆菌结核杆菌” 是是Mycobacterium tuberculosis （结核分枝杆菌）的俗名（结核分枝杆菌）的俗名; “红色面包霉红色面包霉”是是Neurospora crassa（粗糙脉孢菌）（粗糙脉孢菌） 的俗名 学名和俗名比较 命名法（命名法（NomenclatureNomenclature））•Approved List of Bacterial Name (International Journal of Systematic Bacteriology 1980, 30:255-429)–在在 Approved List之前，没有固定的规律来描述新的种之前，没有固定的规律来描述新的种e.g., 链霉菌（链霉菌（Streptomyces ）属曾同时包含超过）属曾同时包含超过3,000 种种• 统一的系统统一的系统• 理事会：理事会：International committee on systematic bacteriology (ICSB) （系统细菌学国际委员会）（系统细菌学国际委员会）•规则：细菌命名法的国际法规规则：细菌命名法的国际法规•官方杂志官方杂志–International Journal of Systematic Bacteriology （（IJSB））–International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology （（IJSEM）） (From 2000) 微生物命名（微生物命名（NomenclatureNomenclature）流程）流程 分分类学学的提的提议(新的分新的分类单位，新的位，新的组合合)IJSEM中中发表表其其它它杂志志发表表Notification Listin IJSEMValidation List in IJSEM作者委托作者委托 IJSEM CandidatusCandidatus（候选的）（候选的）•没有纯培养没有纯培养•通过有限的信息描述通过有限的信息描述–16S rDNA–Morphology（形态学）（形态学） (荧光原位杂交后荧光原位杂交后 TEM, SEM)–Ecology（生态学（生态学-生存环境、生长条件）生存环境、生长条件）–其它信息（全基因组分析等）其它信息（全基因组分析等） 第二节第二节 微生物在生物界的地位微生物在生物界的地位一、生物的界级分类学说一、生物的界级分类学说三域三域 二、三域学说及其发展 三域学说三域学说是是70年代末由年代末由C.R. Woese对大量微对大量微生物和其他生物进行生物和其他生物进行16S和和18S rRNA的寡核苷的寡核苷酸检测，并比较其同源性水平后提出的。
酸检测，并比较其同源性水平后提出的域：一个比界更高的界级分类单元域：一个比界更高的界级分类单元细菌域细菌域古生菌域古生菌域真核生物域真核生物域 BacteriaEukaryaArchaeaProkaryotesEukaryotesMacroorganisms三域学说三域学说 三域学说及其生物进化谱系树三域学说及其生物进化谱系树三域学说及其生物进化谱系树三域学说及其生物进化谱系树 Nature, 2013,Dec. 12 产液菌产液菌/产氢产氢菌菌绿色非硫化细菌绿色非硫化细菌异常球菌异常球菌螺旋体螺旋体绿色硫细菌绿色硫细菌类杆菌－黄杆菌类杆菌－黄杆菌浮霉状菌浮霉状菌衣原体衣原体格兰氏阳性菌格兰氏阳性菌蓝细菌蓝细菌栖热孢菌栖热孢菌硝化螺旋菌硝化螺旋菌变形菌变形菌 古生菌的主要类群古生菌的主要类群甲烷球菌甲烷栖热菌甲烷杆菌古生球菌古生球菌嗜盐甲烷菌甲烷八叠球菌热原体甲烷螺菌盐杆菌盐球菌甲烷嗜热菌热网菌热变型菌热球菌硫化叶菌硫还原球菌KorarchaeotaCrenarchaeotaEuryarchaeota广古生菌广古生菌泉古生菌泉古生菌古古生菌古古生菌 古古生菌门古古生菌门泉古生菌门泉古生菌门广古生菌门广古生菌门嗜盐嗜盐嗜酸嗜酸厌氧厌氧产甲烷产甲烷 奇古菌门奇古菌门 Bergey氏原核生物分类系统纲要1. 《《伯杰氏伯杰氏鉴定鉴定细菌学手册》细菌学手册》1923年年2. 《《伯杰氏伯杰氏系统系统细菌学手册细菌学手册》》1984年年细菌分类鉴定的两本权威手册第三节第三节 各大类微生物的分类系统刚要各大类微生物的分类系统刚要 1923年第年第1版版1925年第年第2版版1930年第年第3版版1934年第年第4版版1939年第年第5版版1948年第年第6版版1957年第年第7版版1974年第年第8版版1994年第年第9版版《伯杰氏鉴定细菌学手册》 第第9版的伯杰氏细菌鉴定手册设立版的伯杰氏细菌鉴定手册设立35个群，个群，将古生菌部改编为将古生菌部改编为5个群，全书描写约个群，全书描写约500个属。
个属划分为四大类：划分为四大类：第一类第一类 具细胞壁的革兰氏阴性细菌具细胞壁的革兰氏阴性细菌 第二类第二类 具细胞壁的革兰氏阳性细菌具细胞壁的革兰氏阳性细菌 第三类第三类 无细胞壁的细菌无细胞壁的细菌 第四类第四类 古生菌古生菌 BergeyBergeyBergeyBergey’’’’s s s s Manual of Determinative Bacteriology Manual of Determinative Bacteriology Manual of Determinative Bacteriology Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition9th Edition9th Edition9th Edition 《《伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册》》1994年第年第9版，撰稿人多达版，撰稿人多达300多位，涉及多位，涉及20个国家鉴定手册包括鉴定手册包括3535个群细菌个群细菌 《《伯杰氏伯杰氏系统系统细菌学手册细菌学手册》》第第1版（版（1984年）是在年）是在《《伯杰氏伯杰氏鉴定鉴定细菌学手册细菌学手册》》第第8版（版（1974年）的基础上，根据年）的基础上，根据10多年来细菌分多年来细菌分类所取得的进展编写的。
类所取得的进展编写的《系统手册》的新内容：G+C mol%、、核酸杂交、核酸杂交、16 S rRNA寡核苷酸序列等系统发育方寡核苷酸序列等系统发育方面的资料，特别是许多新的分类单元的划分，都是经过核苷酸序面的资料，特别是许多新的分类单元的划分，都是经过核苷酸序列比较后提出的列比较后提出的《伯杰氏系统细菌学手册》1984－－1989年第年第1 版版2000－－2012年第年第2 版版 第一卷：第一卷：一般医学和工业方面重要的一般医学和工业方面重要的革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌第二卷：第二卷：放线菌以外的放线菌以外的革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌第三卷：第三卷：古细菌、蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌古细菌、蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌第四卷：第四卷：放线菌《伯杰氏系统细菌学手册》《伯杰氏系统细菌学手册》( (第第1 1版版) ) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd Edition ) Springer, New York Volume 1 (2001) The Archaea and the deeply branching and phototrophic BacteriaVolume 2 (2005)The Proteobacteria （变形菌门）（变形菌门）Volume 3 (2009)The Firmicutes （厚壁菌门）（厚壁菌门）Volime 4 (2011) The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes (Mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres,Fusobacteria, Dictyoglomi, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Verrucomicrobia,Chlamydiae, and Planctomycetes Volume 5 (2012)The Actinobacteria （放线细菌门）（放线细菌门） 真菌界真菌界子囊菌门子囊菌门担子菌门担子菌门接合菌门接合菌门壶菌门壶菌门无性型真菌类无性型真菌类子囊菌纲子囊菌纲酵母菌纲酵母菌纲裂殖酵母纲裂殖酵母纲外囊菌纲外囊菌纲新乳霉纲新乳霉纲肺囊霉纲肺囊霉纲担子菌纲担子菌纲锈菌纲锈菌纲黑粉菌纲黑粉菌纲接合菌纲接合菌纲毛菌纲毛菌纲目前得到学术界较广泛采用的是目前得到学术界较广泛采用的是Ainsworth的分类系统。
的分类系统AinsworthAinsworth等人的菌物分类系统纲要等人的菌物分类系统纲要第九版（第九版（2001）） 1、基于、基于生理学特征的经典鉴定方法：生理学特征的经典鉴定方法：•基于少数的形态学和生理学的性质基于少数的形态学和生理学的性质•基于主观的选择性（指标）的试验基于主观的选择性（指标）的试验•缺少均一性缺少均一性 (标准化标准化)第四节第四节 微生物分类鉴定方法微生物分类鉴定方法 •2、数值分类鉴定、数值分类鉴定•基于借助于计算机分析大量的表型的性质基于借助于计算机分析大量的表型的性质–(e.g. 300 strains x 200 tests)•更多的分析项目更多的分析项目•同样缺乏均一性同样缺乏均一性•费力的费力的•API 细菌数值鉴定系统细菌数值鉴定系统 (API system)•Biolog细菌数值鉴定系统细菌数值鉴定系统 3 3、现代、现代分类鉴定方法分类鉴定方法•ad hoc Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics of International Committee on Systematic Bacteriology (ICSB，， 细菌系统学国际委员会细菌系统学国际委员会) - Wayne et al. (1987) IJSB 37:463-464–细菌的物种应该反应基因组的关系细菌的物种应该反应基因组的关系–基于直接或间接的测量基因组核苷酸序列的比较基于直接或间接的测量基因组核苷酸序列的比较–基因组测序基因组测序 (直接的直接的) – 理想的，但理想的，但以前以前是不切实际是不切实际–DNA-DNA 杂交杂交 (间接的间接的)种的定义种的定义–在最优化的杂交温度下，全基因组杂交，70％结合（同源性） The phylogenetic definition of species generally would include strains with approximately 70% or greater DNA-DNA relatedness and with 5°C or less Tm. Both values must be considered. DNA-DNADNA-DNA杂交杂交: : 方法方法间接的接的评价价两个两个菌株的基因菌株的基因组的的亲缘关关系系缺点缺点:- 无法鉴别属以上的水平（定种可以）无法鉴别属以上的水平（定种可以） - 费力（分别提取ＤＮＡ），昂贵费力（分别提取ＤＮＡ），昂贵- 无法产生数据库无法产生数据库 Small subunit rRNA (rDNA)（（小亚基小亚基核糖体核糖体RNA））基因基因测序测序 ：： 用目标基因代表整个用目标基因代表整个基因组基因组 (rDNA, rpo, gyr)SSU rRNA优点：优点：•存在于大多数物种存在于大多数物种 (真核生物真核生物, 古细菌古细菌, 真细菌真细菌)•便于测序便于测序–基于保守区域的基于保守区域的PCR (ca. 1,500 nt)–基于保守区域的测序基于保守区域的测序•大型数据库大型数据库–> 2,000,000 small subunit rDNA sequences DNADNA杂交和杂交和杂交和杂交和16S 16S rRNArRNA基因相似度关系基因相似度关系基因相似度关系基因相似度关系16S rDNA 序列相似度序列相似度<97％时其％时其DNA-DNA杂交值杂交值<70%。
但但16S rDNA 序列相似度序列相似度>97％时不好估计％时不好估计DNA-DNA杂交值100 分分类类的的方方案案16S rDNA 测序序不同的分支不同的分支属属属属水平的水平的水平的水平的鉴鉴定定定定（小于（小于（小于（小于95%)95%)新的新的属属Genomic speciesYesNo新的新的种种70%>70%<物物物物种种种种水平的水平的水平的水平的鉴鉴定定定定化化学学的，表型的，表型的的数数据的支持据的支持Yes现有的物有的物种种单元元物物种种：： 小于小于97% 16S rDNA 相似度相似度DNA-DNA hybridization with species showing 16S rDNA 相似度相似度>97% 分类学研究的概述分类学研究的概述mRNAmRNAPROTEINPROTEIN• 总的的细胞胞内内蛋白和包膜蛋白的蛋白和包膜蛋白的电泳泳图谱Chemotaxonomic markersChemotaxonomic markers• 胞胞内内脂肪酸脂肪酸• 极极性脂性脂质• 醌类• 聚聚胺胺类• 细胞壁胞壁组分分Expressed featuresExpressed features• 形形态学学• 生理生理学学• 酶酶学学• 血血清学清学 表型信息表型信息总的的DNADNA：：• GCGC含量含量• RFLPRFLP •DNADNA－－DNADNA杂交交DNADNADNADNA基因型信息基因型信息DNA DNA 片段片段: :• 基于基于PCRPCR的的DNADNA指指纹印迹印迹• DNA DNA探探针• DNA DNA 测序序rRNArRNA• 测序序• GenBank, EMBL GenBank, EMBL16S16S23S23S5S5S 微生物分类鉴定的4个水平① ① 细胞的形态和习性水平细胞的形态和习性水平② ② 细胞组分水平细胞组分水平③ ③ 蛋白质水平蛋白质水平④ ④ 核酸水平核酸水平 （一）经典的鉴定指标1.形态学指标形态学指标2.生理、生化指标生理、生化指标3.生态特性指标生态特性指标4.生活史生活史5.血清学反应血清学反应6.对噬菌体的敏感性对噬菌体的敏感性7.其他其他 1. 1. 形态学特征形态学特征（（1）群体形态学特征）群体形态学特征（（2）个体形态学特征）个体形态学特征细胞大小、形态、排列及其染色特性细胞大小、形态、排列及其染色特性特殊的细胞结构特殊的细胞结构培养特征培养特征运动性等运动性等 （（1 1）群体形态特征（培养性状））群体形态特征（培养性状）①① 斜面菌苔特征斜面菌苔特征 （（1 1）群体形态特征（培养性状））群体形态特征（培养性状）②② 平板菌落特征平板菌落特征细菌在琼脂平板上的菌落表面形态细菌在琼脂平板上的菌落表面形态 ②② 平板菌落特征平板菌落特征细菌在琼脂平板上的细菌在琼脂平板上的菌落隆起菌落隆起形状形状 细菌在琼脂平板上的细菌在琼脂平板上的菌落边缘菌落边缘形状形状 ③③ 培养液中的生长特征培养液中的生长特征 （（2 2）个体形态特征）个体形态特征①① 革兰氏染色革兰氏染色②② 芽孢染色芽孢染色③③ 荚膜染色荚膜染色④④ 鞭毛染色鞭毛染色⑤⑤ 运动性观察（半固体琼脂穿刺法）运动性观察（半固体琼脂穿刺法）SEMSEM，，TEM TEM 观察观察 2. 2. 生理、生化指标生理、生化指标 （（API KitAPI Kit））（（1）接触酶反应）接触酶反应（（2）糖醇类发酵试验）糖醇类发酵试验（（3）甲基红（）甲基红（M.R）试验）试验（（4）甲基乙酰甲醇（）甲基乙酰甲醇（V.P）试验）试验（（5）吲哚试验）吲哚试验（（6）硝酸盐还原）硝酸盐还原（（7）亚硝酸盐还原）亚硝酸盐还原（（8）大分子物质水解反应）大分子物质水解反应（（9）碳源利用试验）碳源利用试验（（10）氮源利用试验）氮源利用试验 化学分类：化学分类： 细胞化学成分用作鉴定指标1.细胞壁的化学成份细胞壁的化学成份2.全细胞水解液的糖型全细胞水解液的糖型3.磷酸类脂成分的分析磷酸类脂成分的分析4.枝菌酸的分析枝菌酸的分析5.醌类的分析醌类的分析 6.脂肪酸分析脂肪酸分析 对于不同属的鉴定是有用的对于不同属的鉴定是有用的 弱点弱点 - - 微生物的化学组成取决于环境微生物的化学组成取决于环境 - - 必须同一条件下培养必须同一条件下培养 一些常用分一些常用分类技技术在分在分类学学上的精确度上的精确度细胞壁结构细胞壁结构脂肪酸脂肪酸聚氨，醌聚氨，醌 脂肪酸脂肪酸 FAMEs (脂肪酸甲酯脂肪酸甲酯) 通过通过 GC分析分析 (气相色谱法气相色谱法) 脂肪酸的气相色谱（脂肪酸的气相色谱（GCGC）） 相似性指数相似性指数 v16S rDNA 测序vGC含量含量vDNA-DNA 杂交核酸水平分析中常用方法核酸水平分析中常用方法 16S rRNA在在结构构和功能上的作用和功能上的作用 16S rRNA gene 在分子分类学应用在分子分类学应用16S rRNA 16S rRNA ……• 所有的所有的细菌都具菌都具备的古老的分子的古老的分子• 功能恒定功能恒定• 普遍普遍分布分布• 系系统发生距离上中度保守生距离上中度保守More than 2,0More than 2,00000,000 of 16S rRNA ,000 of 16S rRNA gene sequences are currently gene sequences are currently available on available on RDP.RDP. ProcaryoteEukaryoteOveral size70S80SSmall subunit30S40S Number of proteins~21~30 RNA size (number of base)16S(~1500bp)18S(~2300bp)Large subunit50S60S Number of proteins~34~50 RNA size (number of base)23S (~2900bp)5S (~120bp)28S (~4200bp)5.8S (~160bp)5S (~120bp)核糖体（核糖体（Ribozome) structure线粒体线粒体和和叶绿体叶绿体的核糖体跟的核糖体跟原核生物原核生物的核糖体更相似的核糖体更相似 16S rDNA 16S rDNA 测序的概述测序的概述基因基因组 DNA DNA 或或细胞裂解胞裂解PCRPCR16S rDNA16S rDNA电泳泳载体体+ 16S rDNA+ 16S rDNA克隆克隆测序序放射自放射自显影影图分析分析系系统进化化树 16S 16S r rR RNANA基因的基因的PCRPCR扩增扩增16S rRNA gene16S rRNA gene9F9F341F341F518F518F536R536R907F907F1100R1100R1512R1512R16S rRNA gene16S rRNA genePrimer Primer 1512R1512R5 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’Primer Primer 9F9F5 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’a ammp pl li if fi ic ca at ti io on nElectrophoresisElectrophoresis1.6 Kb1.6 Kb 测序测序: PCR : PCR 产物或克隆的基因产物或克隆的基因纯化化基于基于PCRPCR的循的循环测序序341F341Fpartial sequencepartial sequence9F9F520F520F536R536R907F907F1100R1100R1512R1512Rfull sequencefull sequence纯化的化的PCRPCR产物物16S rRNA16S rRNA基因序列完全一致基因序列完全一致 不同不同16S rRNA16S rRNA基因之基因之间 存在序列差存在序列差异异 载体体+ 16S rDNAs+ 16S rDNAs克隆克隆测序序 序列分析序列分析用用ez-taxon数数据据库搜索相近序列搜索相近序列选择参参考株考株Alignment构构建系建系统发生生树16S rDNA 相似度相似度≤ 97%: 不同的不同的种种 (Stackebrandt & Goebel, 1994) DNA DNA 碱基组成碱基组成DNA…• 双双螺旋螺旋• [A] = [T], [G] = [C]• A-double bond-T/ G-triple bond-C基因基因组的的进化适化适应性一部性一部分取分取决决于于GC含量含量 GCGC含量作为分类学的标记含量作为分类学的标记A + T + G + CA + T + G + CG + CG + Cⅹ100%ⅹ100%• 原核生物之原核生物之间GC 含量含量变化范化范围 20% - 80%• 相同的相同的 GC 含量不意味着相同的含量不意味着相同的碱碱基基组成成• Minimal value in the overall taxonomic characterization of genus and speciesDifference in mol% G+C = 0% ≠ same speciesDifference in mol% G+C ≥ 5% ≈ different speciesDifference in mol% G+C ≥ 10% ≈≈ different genus CellCellGCGC含量分析含量分析 ( ( HPLCHPLC高效液相色谱高效液相色谱) )细胞裂解胞裂解 (化化学学的的 & 物理的物理的)蛋白酶蛋白酶处理理RNA酶酶处理理DNADNARNARNAproteinproteinDNA 变性性核酸酶核酸酶处理理碱碱性磷酸酶性磷酸酶处理理P PP PP PP PP PP PP PHPLC 分析：分析： 270 nm GCGC含量的计算含量的计算C CG GT TA A 基因组基因组DNADNA杂交杂交• DNADNA序列间的部分相似进行杂交序列间的部分相似进行杂交 •对于区分相近的生物的非常敏感的方法对于区分相近的生物的非常敏感的方法 ( (““>99% 16S rDNA>99% 16S rDNA”” 或或““相同的相同的 GC GC 含量含量”” 都有可能对应都有可能对应 ““<70% <70% 杂交值杂交值””) )Hybridization value ≥ 70% : same species DNA-DNA DNA-DNA 杂交概述杂交概述基因基因组 DNA纯化化靶靶 DNAs的固定的固定预杂交交生物素生物素标记的探的探针 DNA杂交和酶反交和酶反应检测 靶靶 DNAsDNAs的固定的固定 Brevibacterium casei DSM 20657T AJ251418 Brevibacterium linens DSM 20425T X77451 Target Brevibacterium iodinum NCDO 613T X76567Probe: strain of interestBrevibacterium aureum Enb15 AY299092Brevibacterium aureum Enb17 AY29909395998391970.01 感感兴趣的菌株趣的菌株相相关关微生物微生物完全无完全无关关的的 e.g. e.g. E. coliE. coli变性性(+) control(+) control靶靶(-) control(-) control单链 DNAs固定到膜上固定到膜上washingwashing洗出未结合的 DNAs 与鲑鱼精与鲑鱼精DNADNA预杂交预杂交• 鲑鱼精 DNA 是与细菌 DNA完全无关的DNA.• 充当非特异性的配体 使靶 DNA中未结合的受体饱和• 去除非特异性的 DNA-DNA 结合(不完全互补的结合)鲑鱼精精 DNADNA使非特使非特异异位点位点饱和和标记的探的探针 DNADNA可能的非特可能的非特异异性性结合合特特异异位点位点非特非特异异位点位点靶靶 DNADNA杂交膜交膜固定的固定的靶靶 DNA鲑鱼精精 DNADNA杂交膜交膜预杂交交Washing 标记的探针标记的探针 DNADNA探针 DNA变性性加入光生物素加入光生物素光照光照生物素标记的探针 DNAwashingwashing交交联 杂交杂交杂交膜交膜标准化的准化的靶靶 DNA杂交膜交膜杂交交Washing生物素生物素标记的探的探针 DNADNA(+) control(+) controltargettarget(-) control(-) control 底物与酶的反应底物与酶的反应链霉霉亲和素和素β-D-galactosidaseβ-D-galactosidaseF FF F杂交膜交膜添加酶添加酶Washing酶酶杂交膜交膜添加底物添加底物底物底物4-methylumbelliferyl-β-4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosideD-galactopyranoside37℃酶反酶反应 检测检测检测(+) control(+) controltargettarget(-) control(-) controlF FF FF FF FF FF FF FF F8 RFUF FF FF FF FF FF F6 RFUF FF F2 RFU DNA电子杂交电子杂交•随着高通量测序技术的发展，微生物全基因组分析将成为微生物研究中的常用方法 多相分类（多相分类（PolyphasicPolyphasic taxonomy) taxonomy)基因型信息基因型信息16S rRNA 16S rRNA 基因测序基因测序GCGC含量含量DNA-DNA DNA-DNA 杂交杂交化学分类信息化学分类信息脂肪酸脂肪酸 醌醌细胞表型信息细胞表型信息形态学形态学( (显微镜，菌落显微镜，菌落) )生长条件生长条件 ( (温度温度, pH, , pH, 盐度盐度) )碳源的利用碳源的利用 (API kit) (API kit) 酶活性酶活性 (API kit)(API kit) •总结：•三域学说（什么，谁，基于什么，意义）•微生物分类体系及其发展•微生物分类鉴定方法（核酸、形态、生化指标）•微生物学名及其在生物学中的意义（什么应用？什么疾病？） Figure Transmission electron micrograph. of strain L61TExample:Rhizobium daejeonense sp. nov. Fig. Phylogenetic tree constructed from a comparative analysis of 16S rDNA gene sequences showing the relationships of strain L61 with other related species. Physiological characteristics of strain L61 and related species G+C contentsDNA-DNA hybridizationv61.3%, in the range of Rhizobium (57%-63%)•Lower than 10% with R. gianidii, R. galegae, R. huautlense, A. tumefaciens. Description of novel speciesDescription of novel speciesRhizobium daejeonense sp. nov. (dae.jeon.en'se N.L. neut. adj. daejeon, pertaining to Daejeon a city in Korea, where the type strain of this species was isolated).•Cells are a gram-negative, aerobic, motile, non-spore forming rod (0.6-0.7 1.1-1.3 m) with peritrichous flagella. •The colonies appearing on YMA within 3 days of incubation at 28 C are circular, cream colored, semi-translucent, and sized 1.5-3.0 mm in diameter.• Catalase, oxidase, urease, -galactosidase, and -glucosidase are positive. Gelatin liquefaction, indole production, and arginine dihydrogenase are negative. No nitrate reduction to nitrite. (Enzyme activity)•Cells grew at 41C, in 0-2% NaCl, or in a pH range of 5-10; however it could not grow at 4 C or 45C, in 2.5% NaCl, or in a pH range higher than 10 or lower than 4.5. •Nodules were formed in Medicago sativa by this strain. A nifH encoding a nitrogenase complex was detected. •DNA G+C content is 60.1-60.9%, as determined by means of HPLC. The cellular fatty acids are C16:0 (2.2-3.3%), C18:0 (2.1-3.2%), C19:0 cyclo ω8c (9.9-16.8%), C20:3 ω6,9,12c (2.7-3.3%), summed feature 3 (7.2-7.7%) and summed feature 7 (67.8-73.7%). •The available carbon source is propionate, caprate, valerate, histidine, acetate, L-alanine, 3-hydroxy-benzoate, maltose, D-glucose, fucose, D-sorbitol, L-proline, rhamnose, D-ribose, inositol, D,L-lactate, arabinose, mannose, mannitol, maltose, and malate; the no available carbon source is citrate, itaconate, suberate, glycogen, phenyl-acetate, adipate, D-melibiose, 2-ketogluconate, N-acetyl-Glucosamine, malonate, 5-ketogluconate, and gluconate. •L-Glutamic acid, L-methionate, L-phenylalanine, L-cysteine, and free- and nickel-complexed cyanides were used as nitrogen source, but D,L-tryptophan and glycine were not. • Cells are resistant against ampicillin (20 and 100 g ml-1) and erythromycin (20 μg ml-1); however they are not resistant against tetracycline (50 μg ml-1), erythromycin (100 g ml-1), chloramphenicol (100 μg ml-1) or kanamycine (100 μg ml-1). •The strains were isolated from a cyanide-degrading bioreactor originally inoculated by an activated sludge from a municipal sewage treatment plant (Daejeon, Korea). •The type strain is L61T (= KCTC 12121T = IAM 15042T = CCBAU 10050T) and the reference strain is L22 (= KCTC 12120 = IAM 15041). 真菌的分类鉴定真菌的分类鉴定www.fungalbarcoding.org群落结构分析：群落结构分析： https://unite.ut.ee/（包括（包括纯培养和未培养微生物信息）纯培养和未培养微生物信息） 。