荧光显微术荧光显微术 1.了解荧光显微镜的基本构成和基本原理了解荧光显微镜的基本构成和基本原理2. 初步掌握荧光显微镜的调节步骤和使用初步掌握荧光显微镜的调节步骤和使用实验目的实验目的 实验用品实验用品Olympus荧光显微镜，载玻片，盖玻片，擦镜纸，吖啶橙染料等实验用材料 实验内容实验内容一、荧光显微镜的成像原理一、荧光显微镜的成像原理二、荧光显微镜的基本结构二、荧光显微镜的基本结构三、荧光显微镜的使用方法三、荧光显微镜的使用方法四、观察动植物细胞的自发荧光四、观察动植物细胞的自发荧光和继发性荧光和继发性荧光 一、显微镜的成像原理一、显微镜的成像原理 荧光显微镜是利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜自发荧光自发荧光: 组织、细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所呈现的荧光，称为自发荧光 继发性荧光继发性荧光: 组织、细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的某种成分结合后而呈现的荧光为继发性荧光 二、荧光显微镜的基本结构和光路图二、荧光显微镜的基本结构和光路图1. 基本结构基本结构: 光源：光源：超高压汞灯,用以产生强光照(含大量紫外光 ,蓝紫光) 滤片系统滤片系统: 激发滤色镜，提供一定波长范围的激发光 . 阻断滤色镜 ,透过相应波长范围的荧光 ,阻断 或吸收剩余激发光 . 二向分色镜，透射长波光线和反射短波光线的功能 . 荧光物镜荧光物镜普通显微镜普通显微镜 荧光显微镜结构图荧光显微镜结构图 荧光显微镜的光路图荧光显微镜的光路图 三三 荧光显微镜的使用方法荧光显微镜的使用方法1.汞灯的安装汞灯的安装: 切断电源切断电源 ,从插座上拔下电源线从插座上拔下电源线 . 开启灯室开启灯室 ,将汞灯安装到灯架上将汞灯安装到灯架上 . 严防手指触摸灯管严防手指触摸灯管 ,特别是中心球状部分特别是中心球状部分,以以免污染免污染 汞灯装入灯室汞灯装入灯室 ,封上灯室盖后封上灯室盖后 ,方可按通电方可按通电源源 .（一）荧光显微镜的调整方法（一）荧光显微镜的调整方法 2. 汞灯的点亮汞灯的点亮: 确信各连接部分皆处于正常状态 接通启动器电源开关 ,按下起动钮 ,汞灯点亮 ,经2-3min ,电弧趋于稳定 . 点亮后 15min内 ,勿切断电源 ,一旦汞灯熄灭 ,在5min或稍长时间内 ,不许重新点亮 ,待汞灯冷却后 ,始能再次点亮 . 3. 汞灯的调中汞灯的调中: 开启光阀开启光阀 . 开放孔径光阑和视场光阑至最大开度开放孔径光阑和视场光阑至最大开度 ,即即“Min” - “Max” . 旋转物镜转换器旋转物镜转换器 ,无物镜的空洞进入光路无物镜的空洞进入光路, 旋下防尘盖光线射向镜台旋下防尘盖光线射向镜台 . 载物台上放一白纸载物台上放一白纸 ,让汞灯电弧像投在其上让汞灯电弧像投在其上 . 用灯室外的聚焦杆用灯室外的聚焦杆 ,使电弧像在白纸上聚焦，使电弧像在白纸上聚焦，并用调中螺钉并用调中螺钉 ,调中汞灯。
调中汞灯 4.4.滤色镜系统的配合使用滤色镜系统的配合使用: : 该荧光显微镜具激发滤色镜 ,阻断滤色镜和二向色镜等 5. 5. 样品聚焦样品聚焦: : 经经荧荧光光染染料料染染色色的的样样品品放放在在载载物物台台上上 , ,先先用用溴溴钨钨灯灯透透射射照照明明 , ,用用低低倍倍物物镜镜聚聚焦焦 , ,待待寻寻找找到到最最佳佳影影像像后后 , ,熄熄灭灭溴溴钨灯改用汞灯钨灯改用汞灯 . . 点亮汞灯点亮汞灯 , ,嵌入系统滤色镜嵌入系统滤色镜 使使用用 UVFL UVFL 40X(Oil)40X(Oil)和和 UVFL UVFL 100X(Oil) 100X(Oil) 油油浸浸物物镜镜 , ,应应用用无无荧荧光光浸浸油油 , ,物物镜镜的的内内装装可可变变光光阑阑应应适适当当缩缩小小 , ,以以增增大影像反差和清晰度大影像反差和清晰度 . . 在在UVFL UVFL 40X(dry)40X(dry)物物镜镜内内装装有有校校正正环环 , ,对对较较薄薄或或较较厚厚的的盖片进行球面校正盖片进行球面校正 . 6.缩小光阑开度缩小光阑开度 视场光阑视场光阑(F)和孔径光阑和孔径光阑(A)的开度的开度 ,在观察样品在观察样品时应朝时应朝“Min”向转动向转动 ,使其适当缩小使其适当缩小 .7.光阀的使用光阀的使用 在荧光观察暂短中止时在荧光观察暂短中止时 ,可用光阀阻断光路可用光阀阻断光路 ,勿勿 熄灭汞灯熄灭汞灯 ,以免减短其使用寿命以免减短其使用寿命 . （二）荧光镜检样品的制作（二）荧光镜检样品的制作1. 不能使用本身能产生荧光的药剂不能使用本身能产生荧光的药剂2. 切片标本不能太厚切片标本不能太厚3. 因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡必须彻底。
切片进入水后，应充分水洗，再经荧光必须彻底切片进入水后，应充分水洗，再经荧光染料处理染料处理4. 最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片5. 封片时可采用甘油等无荧光的封固剂封片时可采用甘油等无荧光的封固剂 材料材料: 藻类藻类, 鸭趾草下表皮鸭趾草下表皮, 动物结缔组动物结缔组 织织, 血血细胞细胞, 花粉花粉. 染液染液: 0.01%丫啶橙染液丫啶橙染液.观察藻类，鸭趾草下表面叶绿体的自发荧光观察藻类，鸭趾草下表面叶绿体的自发荧光丫啶橙染花粉丫啶橙染花粉, 血细胞血细胞, 疏松结缔组织疏松结缔组织四、观察动植物细胞的自发荧光和四、观察动植物细胞的自发荧光和继发性荧光继发性荧光 1.影响荧光显微镜成像质量的因素影响荧光显微镜成像质量的因素2.激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及区别？两者有激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及区别？两者有何关系？怎样选用？何关系？怎样选用？思考题思考题 。