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1、第八章 残留农药的检测方法 -免疫分析法一、免疫学基础知识1.抗原抗原 （antigen, Ag）是一类能够引起机体特异性免疫应答，并能与相应抗体 或 T 细胞受体发生特异反应的物质。抗原具有以下两种特性： 免疫原性，即诱导刺激免疫系统产生抗体或者激活淋巴细胞产生免疫应答的能力，具有这种特性的物质称为免疫原； l 抗原性（ antigenicity ) ，指与抗体反应的性质，这种结合反应具有特异性。抗原的这两种特性是不同的，具有免疫原性的物质必然有抗原性，反之则不一定成立。l具有上述两种特性的物质称为完全抗原，只具有抗原性的物质称为半抗原，它能与抗体结合但不能诱导机体产生免疫应答.l2.抗体（
2、antibody,Ab)l机体受抗原刺激后，在体液中出现一种能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性，习惯上称为免疫球蛋白.l l4.抗原抗体反应l抗原与抗体相互作用是免疫学的基础，二者通过大量非共价键连接，包括静电力、氢键、疏水作用和范德华力等。l抗原和抗体在体内进行的反应称为免疫反应，在体外进行的反应称为血清学反应。 l5.免疫分析l免疫分析方法是研究免疫学的工具。免疫分析是基于抗原抗体之间的特异性相互作用从而实现对抗原、抗体或相关物质进行分析检测的方法。l免疫反应的高选择性、高亲和性和高灵敏性为免疫分析的可靠和准确提供了保证。 l从本质上讲，几乎所有的免疫分析都是基于识别位点
3、的占据率的测定，根据这种反应性质可分为竞争免疫分析和非竞争免疫分析。二、酶联免疫吸附分析法1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbentassay , ELISA) 。 ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。l酶联免疫吸附分析法（ ELISA ）
4、集抗原抗体反应的高灵敏性和强特异性于一体，表现出简单、快速、灵敏和选择性高等优势，在 20 世纪 80 年代得到了快速发展，尤其在农药残留测定方面表现最为活跃。采用 EIJSA 法不仅可以定性，而且可以定量，使用多孔滴定板，一次可进行大批量样品的测定。l已商品化的筛选农药残留的 EIASA 试剂盒种类很多，不仅能用于各种食品和多种环境样品中的杀虫剂、杀菌剂、除草剂分析，而且也能检测多种环境污染物，如多氯联苯、多环芳烃，以及黄曲霉素等多种天然毒素。lELISA 一次只能检测单一农药或结构近似的少数几种农药，不能解决农药多残留分析问题。而且抗体制备难度较大。l目前抗体数量还较少；分析会受到特异性或
5、非特异性的干扰；如果在不能肯定试样中农药品种的情况下，检测具有一定的盲目性；此外有可能出现假阳性或假阴性现象等等。随着技术的日趋成熟， ELISA 在农药残留速测中的应用会得到新的发展。l1.基本原理基本原理l将抗原或抗体固定于合适的载体上，并保持其生物活性使抗原或抗体与某种酶连接这种酶标抗原或抗体同时其有免疫活性和酶的活性；待测样品和酶标抗原或抗体与包被的抗原或抗体经过一系列反应；用洗涤的方法将固相载体上的复合物与其他物质分离；加入酶反应的底物，复合物上的酶催化底物使其水解，氧化或还原成有色产物，一定条件下，产物的色泽与待测物的含量直接相关，根据颜色反应的深浅对待测物进行定性或定量分析。l测
6、定的对象可以是抗体也可以是抗原。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234l在这种测定方法中有3种必要的试剂：l固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）l酶标记的抗原或抗体（标记物）l酶作用的底物（显色剂） 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的
7、偶联物（标记物）体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。化水解或氧化还原反应而呈颜色。l其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。含量成正比。l l 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。（
8、酶标仪）加以测定。l l 其方法简单，方便讯速，特异性强。其方法简单，方便讯速，特异性强。 酶结合物是酶与抗体或抗原、半抗原在交酶结合物是酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产物。是联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应将得到不同的颜色反应.酶酶 底底 物物显色反显色反应应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四
9、甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并噻唑并噻唑啉磺酸啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+ +重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色
10、 405405420 420 -半乳糖苷半乳糖苷酶酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420420 l3. ELISA 方法的建立l ELISA 方法的建立包括待测农药、滴定板和酶的选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗体制备和样品前处理方法及质量控制等。三、三、ELISA应用实例应用实例l 饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检
11、饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏（如沙门氏菌菌 ）ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用 甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析 ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测l 主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（例如杀暝松（ FN FN ）、）、 甲氟磷酸异已酶（甲氟磷酸异已酶（ SOMAN SOMAN ）、）、 草不绿（草不绿（ Alachor Alachor ）、）、 西维因（西维因（ Carbaryl Carbaryl ）、）、 多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（ Captan
12、 Captan ）等。）等。农药的检测农药的检测：快速快速ELISA试剂盒试剂盒ELISA 试剂盒目前在食品检测、水产品检测、动试剂盒目前在食品检测、水产品检测、动物检疫检测和农药残留检测等方面已得到了广物检疫检测和农药残留检测等方面已得到了广泛的应用。它具有快速、灵敏度高、测定步骤泛的应用。它具有快速、灵敏度高、测定步骤简便、成本低、操作安全等特点，完整的简便、成本低、操作安全等特点，完整的 ELISA 试剂盒包含以下各组分：试剂盒包含以下各组分： 包被抗原或包被抗原或抗体的固相载体；抗体的固相载体； 酶标抗原或抗体；酶标抗原或抗体； 酶酶的底物；的底物； 阴性和阳性对照品（定性测定），阴性和阳性对照品（定性测定），参考标准品和控制血清（定量测定）；参考标准品和控制血清（定量测定）； 结合结合物及标本的稀释液；物及标本的稀释液； 洗涤液；洗涤液； 酶反应终酶反应终止液。止液。商品化产品：商品化产品：非典型肺炎冠状病毒抗体酶联免疫试剂盒克非典型肺炎冠状病毒抗体酶联免疫试剂盒克伦特罗检测试剂盒；伦特罗检测试剂盒； 磺胺二甲嘧啶及磺胺二甲氧嘧啶检测试剂磺胺二甲嘧啶及磺胺二甲氧嘧啶检测试剂盒；盒；氯霉素检测试剂盒；氯霉素检测试剂盒；酶免疫分析仪器
