第七章微生物遗传变异与育种

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1、第七章第七章 微生物的遗传变异和育种微生物的遗传变异和育种（1）遗传型（基因型）遗传型（基因型）某一生物个体所含有的某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因的总和全部遗传因子即基因的总和 。（亲代与子代相似亲代与子代相似）（3）表型（表现型）表型（表现型）某一生物体所具有的一切外某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，具有一定遗传型的个体，在特表特征及内在特性的总和，具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。（

2、2）变异）变异生物体在某种外因或内因的作用下所引生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变起的遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。（亲代与子代、子代间不同个体不完全相同）亲代与子代、子代间不同个体不完全相同） 变异了的微生物与原来的微生物有所不同，称为变异了的微生物与原来的微生物有所不同，称为变种变种。遗传变异的几个基本概念遗传变异的几个基本概念（4）表型饰变）表型饰变即外表的修饰性发生改变。是即外表的修饰性发生改变。是一种不涉及遗传物质结构发生改变而只发生在转录、一种不涉及遗传物质结构发生改变而只发生在转录、转译水平上的表形变化。转译水平上的表形

3、变化。特点：表型的差异只与环境有关特点：表型的差异只与环境有关,暂时性、不可遗传暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。性、表现为全部个体的行为。如：如：粘质沙雷氏菌粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，遗传物质改变，导致表型改变。导致表型改变。特点：特点：遗传性、群体中极少数个体的行为。遗传性、群体中极少数个体的行为。 （自发突变频率通常为（自发突变频率通常为1010-6-61010-9-9）遗传学的模式生物遗传学的模式生物微生物的独特生物学特性：微生物的独特生物学特性：（1） 个体的体制极

4、其简单；个体的体制极其简单；（2） 营养体一般都是单倍体；营养体一般都是单倍体；（3） 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4） 繁殖速度快；繁殖速度快；（5） 易于积累不同的中间代谢产物或终产物；易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6） 菌落形态特征的可见性和多样性；菌落形态特征的可见性和多样性；（7） 环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；（8） 易于形成营养缺陷型；易于形成营养缺陷型；（9） 各种微生物一般都有相应的病毒；各种微生物一般都有相应的病毒；（10) 存在多种处

5、于进化过程中的原始有性生殖方式。存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式。第七章第七章 微生物的遗传变异和育种微生物的遗传变异和育种第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种第四节第四节 基因工程基因工程第五节第五节 菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础一、遗传变异的物质基础一、遗传变异的物质基础二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式三个经典实验证明核三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质酸是微生物

6、遗传物质转化实验转化实验噬菌体感染实验噬菌体感染实验植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础是核酸。这个结论的得出就是以微生物为研是核酸。这个结论的得出就是以微生物为研究对象而得来的。究对象而得来的。一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验（一）核酸存在的七个水平（一）核酸存在的七个水平细胞水平细胞水平细胞核水平细胞核水平染色体水平染色体水平 核酸水平核酸水平基因水平基因水平密码子水平密码子水平核苷酸水平核苷酸水平二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式 1. 1. 细胞水平细胞水平大部分大

7、部分DNADNA集中在细胞核或集中在细胞核或核区。不同微生物或同种微生物的不核区。不同微生物或同种微生物的不同细胞中细胞核数目常不同。同细胞中细胞核数目常不同。2. 2. 细胞核水平细胞核水平真核与原核，被称为核基因组、核染色体或基因组。多数存在真核与原核，被称为核基因组、核染色体或基因组。多数存在核外核外DNADNA含量少、能自主复制的核外染色体含量少、能自主复制的核外染色体质粒。质粒。3. 3. 染色体水平染色体水平（1 1）染色体数：不同生物染色体数目差别很大。）染色体数：不同生物染色体数目差别很大。（2 2）染色体倍数）染色体倍数自然界中微生物染色体多为（自然界中微生物染色体多为（n

8、n），只有少数营养细胞及合子），只有少数营养细胞及合子为（为（2n2n）原核生物通过转化、转导或接合可形成不稳定的部分）原核生物通过转化、转导或接合可形成不稳定的部分（2n2n）。）。4. 4. 核酸水平核酸水平（1 1）核酸种类）核酸种类（2 2）核酸结构）核酸结构（3 3）DNADNA长度长度即基因组的大小，可用即基因组的大小，可用bpbp、kbkb、mbmb表示。不同微生物基因组大表示。不同微生物基因组大小差别很大。小差别很大。5. 5. 基因水平基因水平原核生物的基因组成以下调控系统而发挥作用：原核生物的基因组成以下调控系统而发挥作用：启动基因（启动子）启动基因（启动子）操纵子操纵子

9、操纵基因操纵基因基因调控系统基因调控系统结构基因结构基因调节基因调节基因6. 6. 密码子水平密码子水平遗传密码就是指遗传密码就是指DNADNA链上各个核苷酸的特定排列顺序。链上各个核苷酸的特定排列顺序。7. 7. 核苷酸水平核苷酸水平AMPAMP、TMPTMP、GMPGMP、CMPCMP，E.coliE.coli的的T T偶数噬菌体的偶数噬菌体的DNADNA中有中有55羟羟甲基胞嘧啶。甲基胞嘧啶。（二）原核生物的质粒（二）原核生物的质粒质粒电镜照片质粒电镜照片 凡游离于原核生物凡游离于原核生物 基因组外，具有独基因组外，具有独 立复制能力的小型立复制能力的小型 共价闭合环状的共价闭合环状的

10、dsDNAdsDNA分子，称为分子，称为 质粒。质粒。1 1、质粒的分子结构、质粒的分子结构通常以共价闭合环状通常以共价闭合环状( (covalently closed circlecovalently closed circle，简称简称CCC)CCC)的超螺旋双链的超螺旋双链DNADNA分子存在于细胞中；分子存在于细胞中；也发现有线型双链也发现有线型双链DNADNA质粒和质粒和RNARNA质粒质粒；质粒分子的大小范围从质粒分子的大小范围从1 1kbkb左右到左右到10001000kbkb（细菌质粒多在（细菌质粒多在1010kbkb以内）。以内）。2 2、质粒的特征、质粒的特征（1）形状大小

11、：超螺旋结构、）形状大小：超螺旋结构、106108Da、1%核基因组大小。核基因组大小。（2）数量：每个菌体内有一个或几个、或很多。）数量：每个菌体内有一个或几个、或很多。（3）质粒上携带有某些核基因组上所没有的基因，使原核生物质粒上携带有某些核基因组上所没有的基因，使原核生物的生长繁殖过程中增添了一些特殊功能，如：接合、产毒、抗的生长繁殖过程中增添了一些特殊功能，如：接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶、降解毒物等。药、固氮、产特殊酶、降解毒物等。（4）是一种独立存在于细胞内的复制子。是一种独立存在于细胞内的复制子。严紧型复制控制：复制行为与核染色体的复制同步。严紧型复制控制：复制行为与核染色体

12、的复制同步。松弛型复制控制：复制行为与核染色体的复制不同步。松弛型复制控制：复制行为与核染色体的复制不同步。2、质粒的特征、质粒的特征（5）少数质粒可在不同菌株间转移，如：少数质粒可在不同菌株间转移，如：F因子、因子、R因子。因子。（6）质粒消除：因某些理化因素的影响致使质粒复制受抑而核质粒消除：因某些理化因素的影响致使质粒复制受抑而核染色体的复制仍继续进行，从而引起子代细胞中不带质粒的染色体的复制仍继续进行，从而引起子代细胞中不带质粒的现象。现象。（7）有些质粒具有与核染色体整合和脱离的功能有些质粒具有与核染色体整合和脱离的功能附加体。附加体。（8）质粒还有重组的功能：可在质粒与质粒间、质粒

13、与核染色质粒还有重组的功能：可在质粒与质粒间、质粒与核染色体间发生基因重组。体间发生基因重组。可用作基因工程的载体。可用作基因工程的载体。3 3、质粒的种类、质粒的种类（质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应）质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应）（1 1）F F因子（因子（fertility factorfertility factor 致育因子、性因子）致育因子、性因子）是是E.coliE.coli等细菌决定性别并有转移能力的质粒。等细菌决定性别并有转移能力的质粒。 （2 2）R R因子（因子（resistance factorresistance factor） 又称又称R R质粒质粒 存

14、在于某存在于某些肠道细菌中的抗药性质粒，这些细菌不仅能抗多种抗生素等药物，些肠道细菌中的抗药性质粒，这些细菌不仅能抗多种抗生素等药物，抗重金属等离子（汞、镉、镍、钴、锌、砷），还能把抗药基因传抗重金属等离子（汞、镉、镍、钴、锌、砷），还能把抗药基因传递到其他肠道细菌中。递到其他肠道细菌中。（3 3）ColCol因子（因子（ colicinogeniccolicinogenic factor factor大肠杆菌素质粒、大肠杆菌素质粒、大肠杆菌素因子）大肠杆菌素因子）使使E.coliE.coli等细菌产生大肠杆菌素等细菌素，等细菌产生大肠杆菌素等细菌素，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等方

15、式专一地抑制或具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等方式专一地抑制或杀死其他肠道细菌生长。杀死其他肠道细菌生长。4 4、几种典型质粒、几种典型质粒 （5 5） RiRi质粒质粒 发根土壤杆菌或发根农杆菌中，可侵染双发根土壤杆菌或发根农杆菌中，可侵染双子叶植物的根部，并诱生大量毛状的不定根。子叶植物的根部，并诱生大量毛状的不定根。（7 7）降解性质粒（代谢质粒）降解性质粒（代谢质粒 ）假单胞菌中发现，可为假单胞菌中发现，可为降解一系列复杂有机物的酶编码。在污水处理、环境保护等方降解一系列复杂有机物的酶编码。在污水处理、环境保护等方面有特有作用。面有特有作用。（6 6）巨大质粒（）巨大质粒（ m

16、egamega质粒）质粒）根瘤菌中，其上有一系列与固氮根瘤菌中，其上有一系列与固氮相关的基因。相关的基因。（4 4）TiTi质粒质粒 即诱癌质粒即诱癌质粒 存在于根癌杆菌中，可引起许存在于根癌杆菌中，可引起许多双子叶植物根癌。多双子叶植物根癌。 第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、一、 基因突变基因突变二、突变与育种二、突变与育种一、一、 基因突变（突变）基因突变（突变）是变异的一类。凡指细胞内或病毒粒内遗传物质的分子是变异的一类。凡指细胞内或病毒粒内遗传物质的分子结构突然发生的可遗传的变化。可自发或诱导产生。结构突然发生的可遗传的变化。可自发或诱导产生。狭义的突变：狭义的突

17、变：专指基因突变（点突变）。专指基因突变（点突变）。广义的突变：广义的突变：包括基因突变和染色体突变。包括基因突变和染色体突变。突变的几率：很低突变的几率：很低1010-6-6 -10 -10-9-9。野生型菌株（野生型菌株（wild type strainwild type strain，野生型）：，野生型）：从自然从自然界分离到的、没有发生过突变的菌株。界分离到的、没有发生过突变的菌株。突变株（突变株（mutantmutant，突变体、突变型）：，突变体、突变型）：野生型经突变后野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。形成的带有新性状的菌株。 条件致死突变型（株）条件致死突变型（株）（一）突

18、变类型（一）突变类型 突变株的表型突变株的表型选择性选择性突变株突变株非非选择性选择性突变株突变株营养缺陷型（株）营养缺陷型（株）抗性突变型（株）抗性突变型（株）形态突变型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）产量突变型（株）突变的类型很多，按突变后极少数突变株的表型能否在选择突变的类型很多，按突变后极少数突变株的表型能否在选择培养基上迅速选出和鉴别，可分为：培养基上迅速选出和鉴别，可分为：1. 1. 营养缺陷型（营养缺陷型（auxotrophauxotroph） 某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生

19、长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基（minimum mediumminimum medium，MMMM）上正常生长繁殖的变异类型。）上正常生长繁殖的变异类型。2. 2. 抗性突变型（抗性突变型（resistant mutantresistant mutant） 野生菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死野生菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。物理因子的抗性变异类型。3. 3. 条件致死突变型（条件致死突变型（conditional lethal conditional lethal mutan

20、tmutant） 某菌株经基因突变后，在某种条件下可正常地生长繁殖，某菌株经基因突变后，在某种条件下可正常地生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变类型。如：温度敏感而在另一条件下却无法生长繁殖的突变类型。如：温度敏感突变株（突变株（TsTs突变株）。突变株）。4. 4. 形态突变型（形态突变型（morphological mutantmorphological mutant） 由基因突变引起的个体或菌落形态的变异类型。由基因突变引起的个体或菌落形态的变异类型。5. 5. 抗原突变型（抗原突变型（antigenic mutantantigenic mutant） 由基因突变引起的细胞抗原结

21、构发生变化的变异类型。由基因突变引起的细胞抗原结构发生变化的变异类型。6. 6. 产量突变型（产量突变型（metabolite quantitative metabolite quantitative mutantmutant） 因基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌因基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。若产量明显高于原始菌株者，称为正突变；反株的突变株。若产量明显高于原始菌株者，称为正突变；反之称负突变。之称负突变。（二）（二） 基因突变的特点基因突变的特点1. 1. 自发性：自发性：可自发地发生突变。可自发地发生突变。2. 2. 不对应性：不对应性：突变

22、性状与引起的原因间无直接对应关系。突变性状与引起的原因间无直接对应关系。3. 3. 稀有性：稀有性：通常自发突变的频率在通常自发突变的频率在1010-6-6 -10 -10-9-9间。间。4.4.独立性：独立性：某基因的突变率不受他种基因突变率的影响。某基因的突变率不受他种基因突变率的影响。5.5.可诱变性：可诱变性：自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提高（高（10 -1010 -105 5倍）。倍）。6.6.稳定性：稳定性：基因突变后的新遗传性状是稳定的。基因突变后的新遗传性状是稳定的。7.7.可逆性：可逆性：野生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发野

23、生型菌株某一性状可发生正向突变，也可发生相反的回复突变。生相反的回复突变。（三）（三）基因突变自发性和不对应性的证明基因突变自发性和不对应性的证明变变 量量 试试 验验 涂涂 布布 试试 验验 影印培养试验影印培养试验 大肠杆菌稀释培养物大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成培养前先分成50小管小管)(在同一个大管中作整体培养在同一个大管中作整体培养)2 3 7 1 4 4 3 5 抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数变量试验变量试验 甲管甲管乙管乙管噬菌体起淘汰原始未突变株和鉴别抗噬菌体突变株的作用。噬菌体起淘汰原始未突变株和鉴别抗噬菌体突变株的作用。（10mL

24、）（10mL）涂布试验涂布试验 涂布敏感菌涂布敏感菌5104个个共共12个平板个平板5104个菌落个菌落5000个细菌个细菌/菌落菌落喷入喷入T1保温保温重新涂布后重新涂布后喷入喷入T1保温保温6个平板共个平板共353个菌落个菌落 6个平板共个平板共28个菌落个菌落噬菌体的加入只起鉴别抗噬菌体的自发突变是否发生。噬菌体的加入只起鉴别抗噬菌体的自发突变是否发生。E.coli影影印印培培养养无药无药培养基培养基含药含药培养基培养基影印培养试验影印培养试验 原始敏原始敏感菌种感菌种证明微生物的抗药性突变是在接触药物前自发产生的，证明微生物的抗药性突变是在接触药物前自发产生的，且这一突变与相应的药物毫

25、不相干。且这一突变与相应的药物毫不相干。E.coli基因突变：基因突变：一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNADNA序列的任何改变。序列的任何改变。基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。突变突变自发突变自发突变诱诱 变变环境因素的影响，环境因素的影响，DNADNA复制过程的偶然错误复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通常为等而导致，一般频率较低，通常为1010-6-6-10-10- -9 9 。某些物理、

26、化学因素对生物体的某些物理、化学因素对生物体的DNADNA进行直进行直接作用，突变以较高的频率产生。接作用，突变以较高的频率产生。（四）基因突变及其机制（四）基因突变及其机制v基因突变的机制是多样性的，可以是自发的或诱发的。基因突变的机制是多样性的，可以是自发的或诱发的。1 1、诱发突变（诱变）、诱发突变（诱变）v指通过人为的方法，利用物理、化学或生物指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。因素显著提高基因自发突变频率的手段。v诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。v诱变剂的种类很多，有物理因素（诱变剂的种类很多，有物理因素（UV

27、UV、激光、激光、离子束、离子束、X X射线、射线、射线、快中子）和化学因射线、快中子）和化学因素（亚硝酸、氮芥、烷化剂、碱基类似物、素（亚硝酸、氮芥、烷化剂、碱基类似物、吖啶类化合物）。吖啶类化合物）。 诱变机制诱变机制 （五）（五）紫外线对紫外线对DNA的损伤及其修复的损伤及其修复已知的已知的DNA损伤类型很多，机体对其修复方法各异。损伤类型很多，机体对其修复方法各异。1.紫外线对紫外线对DNA的损伤的损伤DNA中中嘧嘧啶啶对对UV的的敏敏感感性性较较强强，经经UV照照射射后后相相邻邻嘧嘧啶啶会会形形成成嘧嘧啶啶二二聚聚体体（TT，TC，CC）和和水水合合物物。形形成成二二聚聚体体后后，造

28、成局部造成局部DNA分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变分子无法配对，从而引起微生物的死亡或突变。2.微生物修复受损微生物修复受损DNA的作用的作用（1）光复活作用光复活作用把把经经UV照照射射后后的的微微生生物物立立即即暴暴露露于于可可见见光光下下，就就可出现明显降低其死亡率的现象。可出现明显降低其死亡率的现象。v对照：对照：8106个个/mlE.coli100个个/mlE.coliv实验：实验：8106个个/mlE.coli 2106个个/mlE.coli UVUV360490nm可见光，可见光，30min光复活作用机制：光复活作用机制： 经经UV照照射射后后带带有有嘧嘧啶啶二二聚聚体

29、体的的DNA分分子子，在在黑黑暗暗下下会被一种光激活酶（光解酶、光裂合酶）结合。会被一种光激活酶（光解酶、光裂合酶）结合。这这种种复复合合物物在在300500nm可可见见光光下下时时，此此酶酶会会因因获获得光能而激活，并使二聚体分解成单体。得光能而激活，并使二聚体分解成单体。同同时时光光解解酶酶也也会会从从复复合合物物中中释释放放出出来来，以以便便从从新新执执行行功能。功能。（2）切除修复（暗修复）切除修复（暗修复） v是是活活细细胞胞内内一一种种不不依依赖赖可可见见光光就就可可对对被被紫紫外外线线等等诱诱变剂损伤后的变剂损伤后的DNA进行修复的方式。进行修复的方式。v作用机制：作用机制：通过

30、酶切作用去除通过酶切作用去除嘧啶二聚体嘧啶二聚体，随后重，随后重新合成一段正常新合成一段正常DNA链的核酸。在整个修链的核酸。在整个修复过程中，共有四种复过程中，共有四种酶参与。酶参与。二、突变与育种二、突变与育种自发突变与育种自发突变与育种从生产中选育从生产中选育定向培育优良品种定向培育优良品种诱变育种诱变育种 诱变育种的原则诱变育种的原则诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节（一）（一） 自发突变与育种自发突变与育种1.从生产中育种从生产中育种生生产产中中，自自发发突突变变的的微微生生物物中中有有可可能能出出现现一一定定几几率率的的正突变。正突变。2.定向培育优良菌株定向培育优良菌株是是一一

31、种种利利用用微微生生物物的的自自发发突突变变，并并采采用用特特定定的的选选择择条条件，不断地移植以选育出较优良菌株的古老方法。件，不断地移植以选育出较优良菌株的古老方法。如：炭疽芽孢杆菌活菌苗、卡介苗的选育。如：炭疽芽孢杆菌活菌苗、卡介苗的选育。缺点：费时费力、工作被动、效果很难预测。缺点：费时费力、工作被动、效果很难预测。（二）（二） 诱变育种诱变育种v利利用用物物理理、化化学学等等诱诱变变剂剂处处理理均均匀匀而而分分散散的的微微生生物物细细胞胞群群，在在促促进进其其突突变变率率显显著著提提高高的的基基础础上上，采采用用简简便便、快快速速高高效效的的筛筛选选方方法法从从中中挑挑选选出出少少数

32、数符符合合目目的的突变株，以供科学实验和生产实践用。的的突变株，以供科学实验和生产实践用。v方法简便易行、条件和设备要求简单。方法简便易行、条件和设备要求简单。诱变育种诱变育种具有极其重要的实践意义。在当前发酵工业或具有极其重要的实践意义。在当前发酵工业或其他大规模的生产实践中，大部分菌种为诱变而产生的其他大规模的生产实践中，大部分菌种为诱变而产生的变异菌株。变异菌株。 效价：指有效成分的浓度。效价：指有效成分的浓度。1ug/ml称为称为1单位单位1945时间时间1943194319431947195519711977目目前前发酵单位发酵单位(Uml1)10025050085085080002

33、万万5万万5万万10万万 从青霉素产量看诱变育种从青霉素产量看诱变育种1、诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节大多死亡大多死亡少数存活少数存活存活率存活率多数未变多数未变少数突变少数突变突变率突变率多数负变多数负变少数正变少数正变正变率正变率多数幅度小多数幅度小少数幅度大少数幅度大高产率高产率投产率投产率多数不宜投产多数不宜投产少数适宜投产少数适宜投产出发菌株出发菌株计算出计算出诱变诱变2 2、诱变育种工作中应考虑的几个原则、诱变育种工作中应考虑的几个原则挑挑选优良的出发菌株选优良的出发菌株选择简便有效的诱变剂选择简便有效的诱变剂处理处理单细胞单细胞或或单孢子悬液单孢子悬液选用最适剂量选用最适

34、剂量的诱变剂的诱变剂设计或采用高效筛选方案或方法设计或采用高效筛选方案或方法充分充分利用复合处理的协同效应利用复合处理的协同效应利用和创造形态，生理与产量间的相关指标利用和创造形态，生理与产量间的相关指标v诱变剂的种类很多，有物理因素和化学因素两类。诱变剂的种类很多，有物理因素和化学因素两类。v拟辐射物质：除了能诱发点突变，还能诱发一般只拟辐射物质：除了能诱发点突变，还能诱发一般只有辐射才能引起的染色体畸变这类有辐射才能引起的染色体畸变这类DNA的大损伤的的大损伤的物质。如：氮芥、硫芥和环氧乙烷等。物质。如：氮芥、硫芥和环氧乙烷等。v在选用理化因素作诱变剂时在选用理化因素作诱变剂时 ，在同样效

35、果下，应选，在同样效果下，应选用最简便的因素；而在同样简便的条件下，应选用用最简便的因素；而在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。最高效的因素。（1）选择简便有效的诱变剂）选择简便有效的诱变剂出发菌株出发菌株菌体的稀释液菌体的稀释液接种接种培养培养接种分离接种分离紫外线紫外线使用使用UV照射最为方便。取照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中，的培养皿中，开盖照射；开盖照射；时间不短于时间不短于1020s，也不长于也不长于1020min。挑选优良菌株挑选优良菌株15W、30cm5mL使用化学诱变剂的十分简便的方法：使用化学诱变剂的十分简便的方法： 平板上涂布

36、出发菌株平板上涂布出发菌株 在其上分区并放置诱变剂颗粒或沾有诱变剂溶液的在其上分区并放置诱变剂颗粒或沾有诱变剂溶液的小滤纸片小滤纸片 保温培养保温培养 诱变剂周围有一透明的制菌圈，在制菌圈的边缘存诱变剂周围有一透明的制菌圈，在制菌圈的边缘存在有若干突变株的菌落在有若干突变株的菌落 一一制成菌悬液一一制成菌悬液 分别涂布在琼脂平板表面并保温培养分别涂布在琼脂平板表面并保温培养 长成大量单菌落长成大量单菌落 选出所需突变菌株。选出所需突变菌株。化学诱变剂的使用：化学诱变剂的使用：化学诱变剂的种类、浓度和处理化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是终止反应的方法很多。方法尤其是终止反应的方法很多。出发

37、菌株出发菌株含诱变剂的含诱变剂的液体培养基液体培养基接种接种培养培养培养培养接种分离接种分离选择优良突变株选择优良突变株艾姆斯试验艾姆斯试验 原理：原理：致癌物与诱变剂具有很高的相关性，能提高致癌物与诱变剂具有很高的相关性，能提高营养缺陷型的回复突变率的可疑物是诱变剂，所以营养缺陷型的回复突变率的可疑物是诱变剂，所以很可能是很可能是致癌物。致癌物。 作用：作用：测定潜在的化学致癌物。测定潜在的化学致癌物。 主要材料：主要材料：沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株（还应是沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株（还应是DNADNA修复酶的缺陷型）或大肠杆菌色氨酸缺陷型菌株修复酶的缺陷型）或大肠杆菌色氨酸缺陷型菌株S.t.h

38、is回回变变S.t.his 吸入吸入滤纸片滤纸片保温保温可疑可疑“三致三致”试样试样 鼠肝匀浆鼠肝匀浆（含羟化酶）（含羟化酶）阳性阳性阴性阴性利用回变检测致癌剂利用回变检测致癌剂艾姆斯试验法艾姆斯试验法艾姆斯试验法广泛用于检测食品、饮料、药品、饮水和环境等试样中的致癌物艾姆斯试验法广泛用于检测食品、饮料、药品、饮水和环境等试样中的致癌物（2 2）挑选优良的出发菌株挑选优良的出发菌株生产中用过的自发变异菌株生产中用过的自发变异菌株采用具有有利性状的菌株采用具有有利性状的菌株采用已发生其他变异的菌株采用已发生其他变异的菌株采用对诱变剂敏感性较高的增变菌株采用对诱变剂敏感性较高的增变菌株出发菌株即用

39、于育种的原始菌株。选用合适的出发菌出发菌株即用于育种的原始菌株。选用合适的出发菌株有利于提高诱变效率。株有利于提高诱变效率。 （3 3）处理单处理单细胞细胞或单或单孢子悬液孢子悬液用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细孢用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细孢放线菌，霉菌应处理孢子放线菌，霉菌应处理孢子细菌指数期，芽孢菌应处理芽细菌指数期，芽孢菌应处理芽胞胞出发菌株应制成均匀悬液出发菌株应制成均匀悬液使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯菌落。使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯菌落。（4 4）选用最适的诱变剂量选用最适的诱变剂量剂量：以诱变剂浓度和处理时间来表示。剂量：以诱变剂浓度和处理时间来表示

40、。合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正 变范围的剂量。变范围的剂量。（5）充分利用复合处理的协同效应充分利用复合处理的协同效应两种或多种诱变剂先后使用两种或多种诱变剂先后使用同种诱变剂重复使用同种诱变剂重复使用两种或多种诱变剂同时使用两种或多种诱变剂同时使用诱变剂的复合使用常表现明显的协同效应，有利诱变剂的复合使用常表现明显的协同效应，有利于育种。于育种。（6）利用和创造形态，生理与产量间的相关指标利用和创造形态，生理与产量间的相关指标淀粉酶变色圈试验淀粉酶变色圈试验变色圈大的为淀粉酶高产菌落变色圈大的为淀粉酶高产菌落（7）设计或采用高效筛选方案

41、或方法）设计或采用高效筛选方案或方法一个出一个出发菌株发菌株诱变剂诱变剂处理处理选出选出200个单个单单孢子菌株单孢子菌株初筛初筛（每株（每株1瓶）瓶）选出选出50株株复筛复筛（每株（每株4瓶）瓶）选出选出5株株第一轮第一轮第二轮第二轮五个出发菌株五个出发菌株初筛初筛（每株（每株1瓶瓶）选选出出50株株复筛复筛（每株（每株4瓶）瓶）选出选出5株株40株株40株株40株株40株株40株株诱变剂诱变剂处理处理3 3、三类突变株的筛选方法、三类突变株的筛选方法 高产突变菌株的筛选方法高产突变菌株的筛选方法 抗药性突变株的筛选方法抗药性突变株的筛选方法 营养缺陷型的的筛选方法营养缺陷型的的筛选方法 诱

42、变诱变 春日霉素产生春日霉素产生菌的孢子悬液菌的孢子悬液春春日日霉霉素素高高产产菌菌种种琼琼脂脂块块培培养养法法筛筛选选 （ 1 1 ）产产量量突突变变株株的的筛筛选选含供试菌种含供试菌种（拮抗对象）（拮抗对象）的琼脂平板的琼脂平板 优点：在此条件下，各琼脂块优点：在此条件下，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散到琼脂块外，因产物不致扩散到琼脂块外，因此测得的结果与摇瓶实验结果此测得的结果与摇瓶实验结果十分相似，而工作效率却大为十分相似，而工作效率却大为提高。提高。红点为抑菌圈红点为抑菌圈含异烟肼含异烟肼接

43、敏感菌接敏感菌含突变株含突变株（2）抗药性突变株的筛选方法）抗药性突变株的筛选方法梯度培养皿法梯度培养皿法是定向筛选抗药性是定向筛选抗药性突变株的一种有效方突变株的一种有效方法。法。用此法筛选抗异用此法筛选抗异烟肼的吡哆醇高产菌烟肼的吡哆醇高产菌株。株。 利用梯度平板法筛选抗代谢类似物突变株，可达到定向培育的目的利用梯度平板法筛选抗代谢类似物突变株，可达到定向培育的目的1 1）与营养缺陷突变株的筛选相关的几个概念与营养缺陷突变株的筛选相关的几个概念相关培养基相关培养基基本培养基基本培养基 -完全培养基完全培养基 + 补充培养基补充培养基 A或或B等等 三类遗传型三类遗传型野生型野生型 A+B+

44、营养缺陷型营养缺陷型 A+B原养型原养型 A+B+（3）营养缺陷型突变株的筛选）营养缺陷型突变株的筛选与营养要求有关的三类遗传型与营养要求有关的三类遗传型2）营养缺陷型的筛选办法）营养缺陷型的筛选办法诱变剂处理诱变剂处理淘汰野生型淘汰野生型检出缺陷型检出缺陷型夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法逐个检出法逐个检出法影印接种法影印接种法鉴定缺陷型鉴定缺陷型菌丝过滤法菌丝过滤法抗生素法抗生素法诱变剂处理：诱变剂处理：与一般诱变处理相同。与一般诱变处理相同。 淘汰野生型：淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例较低（百分之几千分之几）。需选用适当

45、的比例较低（百分之几千分之几）。需选用适当的方法淘汰为数众多的野生型菌株，达到的方法淘汰为数众多的野生型菌株，达到“浓缩浓缩”极少数营养缺陷型的目的。极少数营养缺陷型的目的。抗抗生生素素法法：青青霉霉素素法法（适适用用于于细细菌菌）、制制霉霉菌菌素素法法（适用于真菌）等方法。（适用于真菌）等方法。菌菌丝丝过过滤滤法法：用用滤滤孔孔较较大大的的擦擦镜镜纸纸过过滤滤。适适用用于于进进行行丝状生长的真菌和放线菌。丝状生长的真菌和放线菌。夹层培养法夹层培养法（同一培养皿）（同一培养皿）小菌落是第二次长起来小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）的（营养缺陷型）检出营养缺陷型：具体方法很多。检出营养缺陷型：

46、具体方法很多。用含有特定生长因子的基本培养基作用含有特定生长因子的基本培养基作第四层可直接分离到相应的营养缺陷型第四层可直接分离到相应的营养缺陷型限量补充培养法（同一培养皿）（同一培养皿） 微量蛋白胨的完全培养基上微量蛋白胨的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株小菌落是营养缺陷型突变株若想获得某一特定营若想获得某一特定营养缺陷型突变株，只养缺陷型突变株，只要在基本培养基上加要在基本培养基上加入微量的相应物质就入微量的相应物质就可以达到。野生型细可以达到。野生型细胞能迅速长成大的菌胞能迅速长成大的菌落，而营养缺陷型则落，而营养缺陷型则因营养受限制生长缓因营养受限制生长缓慢。慢。 逐个检出法逐个

47、检出法（两个培养皿）（两个培养皿）涂涂布布培养培养基本培养基上不长基本培养基上不长菌菌落落完全培养基上长出菌完全培养基上长出菌落落含诱变剂的液体培养基含诱变剂的液体培养基菌种菌种营养缺陷型营养缺陷型影印接种法影印接种法（两个培养皿）（两个培养皿）鉴定缺陷型：可生用长谱法进行鉴定。鉴定缺陷型：可生用长谱法进行鉴定。缺陷型菌株生长谱测定缺陷型菌株生长谱测定第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种v基基因因重重组组（遗遗传传重重组组，重重组组）：两两个个独独立立基基因因组组内内的的遗遗传传基基因因，通通过过一一定定的的途途径径转转移移到到一一起起，形形成成新新的稳定基因组的过程。的稳定基因

48、组的过程。v重重组组是是在在核核酸酸分分子子水水平平上上的的一一个个概概念念，而而杂杂交交是是在在细细胞胞水水平平上上进进行行的的，但但其其中中包包含含了了核核酸酸分分子子水水平平上上的重组。的重组。基因重组是杂交育种的理论基础。基因重组是杂交育种的理论基础。v微生物基因重组的形式较多。微生物基因重组的形式较多。 一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组v原原核核生生物物的的基基因因重重组组形形式式很很多多：转转化化、转转导导、接接合合、原生质体融合。原生质体融合。v其特点为：其特点为：1.片段性，

49、片段性，仅一小段仅一小段DNA序列参与重组；序列参与重组；2.单单向向性性，即即从从供供体体菌菌向向受受体体菌菌（或或从从供供体体基基因因向向受体基因）作单方向转移；受体基因）作单方向转移；3.转移机制独特而多样，转移机制独特而多样，如接合、转化和转导。如接合、转化和转导。 （一）（一） 转化转化(transformation) 1定义定义受体菌（受体菌（recipientcell,receptor）直接吸收供体菌直接吸收供体菌（donorcell）的的DNA片段并把它整合到自己的基因片段并把它整合到自己的基因组中，而获得供体菌部分遗传性状的现象，称为转化组中，而获得供体菌部分遗传性状的现象，

50、称为转化或转化作用。或转化作用。通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子。通过转化方式而形成的杂种后代，称转化子。（transformant）。）。2.转化微生物的种类转化微生物的种类种类十分普遍：原核生物，真核微生物。种类十分普遍：原核生物，真核微生物。不需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触的基因不需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触的基因重组方式重组方式 1）感受态（）感受态（competence）指指受受体体细细胞胞最最易易接接受受外外源源DNA片片段段并并能能实实现现转转化化的一种生理状态。的一种生理状态。在细菌的感受态出现时，具有从周围环境吸收在细菌的感受态出现时，具有从周围环境吸

51、收DNA分子而不被分子而不被DNA酶破坏的生理特性。处于感酶破坏的生理特性。处于感受态的细胞，吸收受态的细胞，吸收DNA的能力有时可比一般细胞的能力有时可比一般细胞大大1000倍。倍。 3.转化条件转化条件（1）亲缘关系：多同缘亲缘关系：多同缘DNA。（2）能进行转化的细胞必须是感受态的。能进行转化的细胞必须是感受态的。2）与感受态的出现有关的因素与感受态的出现有关的因素受该菌遗传性、菌令、生理状态和培养条件等影响。受该菌遗传性、菌令、生理状态和培养条件等影响。一一般般出出现现在在生生长长的的指指数数期期后后期期，有有的的出出现现在在指指数数期期末末和和稳稳定定期期；在在具具有有感感受受态态的

52、的微微生生物物中中，感感受受态态细细胞胞所所占占比比例例和和维维持持时时间间也也不不同同；外外界界环环境境因因子子如如环环腺腺苷苷酸酸（cAMP）及及Ca2+等等对对感感受受态态也也有有重重要要影影响响（环环腺腺苷苷酸可提高酸可提高1000倍、倍、Ca2+能促使细胞进入感受态能促使细胞进入感受态）。）。3）感感受受态态因因子子：是是受受体体细细胞胞表表面面上上的的调调节节感感受受态态的的一一类类特特异异蛋蛋白白（胞胞外外蛋蛋白白），能能使使转转化化因因子子结结合合在在受受体体细细胞表面。胞表面。包包 括括 3种种 主主 要要 成成 分分 ， 即即 ： 膜膜 相相 关关 DNA结结 合合 蛋蛋

53、白白（membraneassociatedDNAbindingprotein）,细细胞胞壁自溶素（壁自溶素（autolysin）和几种核酸酶。和几种核酸酶。不同微生物中，转化因子的形式不同。不同微生物中，转化因子的形式不同。 自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，实验自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，实验室里通过提取获得。室里通过提取获得。双链有转化能力，单链没有。双链有转化能力，单链没有。4. 4. 转化因子转化因子（transformingprinciple） 来自供体菌的来自供体菌的DNA片段或质粒。片段或质粒。转化因子的本质是离体的转化因子的本质是离体的DNA片段。通常为片段。通常为1

54、5kb左右的片段，质粒左右的片段，质粒DNA也可。也可。 每个受体细胞表面约有每个受体细胞表面约有3080个转化因子结合点，个转化因子结合点，当转化因子结合到受体表面结合点上时当转化因子结合到受体表面结合点上时，DNA一一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组，有受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组，有人发现人发现DNA也可通过双链形式进入受体细胞形成也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。双倍体的转化子。5 5、转化过程、转化过程转化过程被研究得较深入的是转化过程被研究得较深入的是G+细菌肺

55、炎链球菌细菌肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）。 转化转化过程过程6 6、转化的特点转化的特点 不需两个细胞直接接触，供体不需两个细胞直接接触，供体DNADNA提取出来，注提取出来，注入受体即可。入受体即可。6.转染（转染（transfection）指用提纯的病毒核酸（指用提纯的病毒核酸（DNA或或RNA）去感染其宿主细去感染其宿主细胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。胞或其原生质体，可增殖出一群正常病毒后代的现象。作为转染的病毒核酸，决不是作为供体基因的功能，作为转染的病毒核酸，决不是作为供体基因的功能，被感染的宿主也决不是能形成转化子的受体菌。被感染的

56、宿主也决不是能形成转化子的受体菌。转导的种类转导的种类 通过缺陷噬菌体（通过缺陷噬菌体（defective phagedefective phage）的媒介，把供体的媒介，把供体细胞的小片段细胞的小片段DNADNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。 由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子（transductanttransductant）。）。 作为媒介的缺陷噬菌体可分为：完全缺陷噬菌体、作为媒介的缺陷噬菌体可分为：

57、完全缺陷噬菌体、部分缺陷噬菌体。部分缺陷噬菌体。( (二二) )转导转导(transduction)(transduction) 普遍转导普遍转导（通过完全缺陷噬菌体）通过完全缺陷噬菌体）局限转导（通过部分缺陷噬菌体）局限转导（通过部分缺陷噬菌体）需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触 1 1完全缺陷噬菌体与普遍转导完全缺陷噬菌体与普遍转导 （1 1） 完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体 感染宿主的噬菌体待成熟与进行包装之际，极少感染宿主的噬菌体待成熟与进行包装之际，极少数噬菌体（约数噬菌体（约1010-6-61010-8-8个）的衣壳将与其头部个）的衣壳将与其

58、头部DNADNA相似的一小段供体菌相似的一小段供体菌DNADNA片段误包入其中，因此形片段误包入其中，因此形成了完全不含噬菌体本身成了完全不含噬菌体本身DNADNA的假噬菌体的假噬菌体完全完全缺陷噬菌体（转导颗粒，缺陷噬菌体（转导颗粒，transducingtransducing particleparticle）。）。（2）普遍转导（普遍转导（generalizedtransduction） 通过极少数完全缺陷噬菌体感染受体菌时，把供通过极少数完全缺陷噬菌体感染受体菌时，把供体菌体菌DNADNA片段导入受体细胞内，而将供体菌的遗传性片段导入受体细胞内，而将供体菌的遗传性状传递给受体菌的现象，

59、称为普通转导。状传递给受体菌的现象，称为普通转导。 一般用温和噬菌体作为普通转导的媒介。一般用温和噬菌体作为普通转导的媒介。 普通转导又可分为以下两种：普通转导又可分为以下两种：完全普遍转导完全普遍转导 、 流产普遍转导流产普遍转导 1）完全普遍转导完全普遍转导（简称普遍转导、完全转导（简称普遍转导、完全转导completetransduction） 由完全噬菌体导入的供体由完全噬菌体导入的供体dsDNAdsDNA片段可与受体细胞片段可与受体细胞核染色体组上的同缘区段配对，再通过双交换而整核染色体组上的同缘区段配对，再通过双交换而整合到受体菌染色体组上，使受体菌成为一个遗传性合到受体菌染色体组

60、上，使受体菌成为一个遗传性状稳定的转导子。状稳定的转导子。 外源外源dsDNA片段经双交换形成一稳定转导子示意图片段经双交换形成一稳定转导子示意图转导模型转导模型由由P22噬菌体引起的完全普遍转导噬菌体引起的完全普遍转导 以以Salmonell tyhimutium为例，用野生型菌株作供体菌，为例，用野生型菌株作供体菌，营养缺陷型突变株作受体菌，营养缺陷型突变株作受体菌，P22噬菌体作转导媒介：噬菌体作转导媒介： 2 2） 流产普遍转导（流产转导）流产普遍转导（流产转导） 经转导而获得了供体菌经转导而获得了供体菌DNADNA片段的受体菌，如果外片段的受体菌，如果外源源DNADNA在其内即不进行

61、交换、整合和复制，也不迅在其内即不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，只进行转录、转译和表达的现象。速消失，只进行转录、转译和表达的现象。2.部分缺陷噬菌体与局限转导部分缺陷噬菌体与局限转导通通过过部部分分缺缺陷陷噬噬菌菌体体的的媒媒介介把把供供体体菌菌的的少少数数特特定定基基因因携携带带到到受受体体菌菌中中，并并与与受受体体菌菌基基因因整整合合、重重组组，形形成成转转导导子子的的现象。现象。（1）部分缺陷噬菌体部分缺陷噬菌体 前前噬噬菌菌体体脱脱离离溶溶原原菌菌的的核核基基因因组组时时，将将其其插插入入位位点点两两侧侧之之一一的的少少数数宿宿主主基基因因连连接接到到噬噬菌菌体体的的DNA上上

62、（而而噬噬菌菌体体也也将将相相应应的的一一段段DNA遗遗留留在在宿宿主主的的核核染染色色体体组组上上），通通过过衣衣壳壳的的误误包包就形成了一种特殊的噬菌体就形成了一种特殊的噬菌体部分缺陷噬菌体。部分缺陷噬菌体。（2）局限转导局限转导 由部分缺陷噬菌体转导的基因总是限于临近前噬菌体两由部分缺陷噬菌体转导的基因总是限于临近前噬菌体两侧的宿主基因，因此称为局限转导或限制性转导。侧的宿主基因，因此称为局限转导或限制性转导。根据转导子出现的频率高低可以分为两类：根据转导子出现的频率高低可以分为两类：低频转导，低频转导，高频转导高频转导 3、溶源转变（溶源转变（lysogeniclysogenic co

63、nversion conversion）一个与转导相似又不同的现象一个与转导相似又不同的现象温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。（获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子）获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子）溶源转变与转导的不同：溶源转变与转导的不同：a）不携带任何供体菌的基因；不携带任何供体菌的基因；b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；C）获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失获得的性状

64、可随噬菌体的消失而同时消失. ( (三三) )接合接合(conjugation)供体菌（供体菌（F+）通过性菌毛与受通过性菌毛与受体菌（体菌（F）直接接触，把直接接触，把F质粒质粒或其携带的不同长度的核基因或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，并使其获组片段传递给后者，并使其获得若干新遗传性状的现象。得若干新遗传性状的现象。通过接合而获得新遗传性状的通过接合而获得新遗传性状的受体细胞叫接合子。受体细胞叫接合子。大肠杆菌的接合大肠杆菌的接合能进行接合的微生物种类：能进行接合的微生物种类：主要在细菌和放线菌中进行主要在细菌和放线菌中进行.细菌中，尤其细菌中，尤其G菌较为普遍。接合还可发生在不

65、同属的一菌较为普遍。接合还可发生在不同属的一些菌种间。些菌种间。 F因子为附加体质粒因子为附加体质粒既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上到染色体上F F因子的四种存在方式因子的四种存在方式a）F菌株，菌株，不含不含F因子，没有性菌毛，但可以通过因子，没有性菌毛，但可以通过接接合作用接收合作用接收F因子而变成雄性菌株（因子而变成雄性菌株（F+）；）；b）F+菌株，菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。因子独立存在，细胞表面有性菌毛。c）Hfr菌株，菌株，F因子插入到染色体因子插入到染色体DNA上，细胞表面有上，细胞表面有

66、性菌毛性菌毛。d）F菌株，菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因不正常切割而脱离染因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，因子，特称为特称为F因子。因子。细胞表面同样有性菌毛。细胞表面同样有性菌毛。雄性菌株雄性菌株 Hfr菌株菌株 F菌株菌株菌株菌株（雌株）（雌株）4种种因子的因子的相互关系相互关系 F+菌株菌株三者根本区别三者根本区别在于在于DNADNA转移的方式不同转移的方式不同 转化：供体菌转化：供体菌DNADNA片断直接进入受体细胞。片断直接进入受体细胞。接合：供体菌接合：供体菌DNADNA进入受体菌通过性菌毛。

67、进入受体菌通过性菌毛。转导：供体菌转导：供体菌DNADNA片断通过媒介噬菌体携带进入片断通过媒介噬菌体携带进入 受体菌。受体菌。 ( (四四) )原生质体融合原生质体融合1.原生质体融合原生质体融合通通过过人人为为的的方方法法，使使遗遗传传性性状状不不同同的的两两个个细细胞胞的的原原生生质质体体进进行行融融合合，借借以以获获得得具具有有双双亲亲遗遗传传性性状状的的稳稳定定重重组组子子的的过过程程，称称为为原原生生质质体体融融合合。所所获获得得的的重重组子叫融合子。组子叫融合子。2.能进行原生质体融合的生物种类能进行原生质体融合的生物种类原核生物和各种真核微生物和高等植物细胞。原核生物和各种真核

68、微生物和高等植物细胞。3.主要操作步骤主要操作步骤 （1）选选择亲本细胞置于等渗溶液中；选选择亲本细胞置于等渗溶液中；（2）用适当的脱壁酶除去细胞壁；用适当的脱壁酶除去细胞壁；（3）将原生质体离心聚集，加入促融合剂将原生质体离心聚集，加入促融合剂PEG（聚乙二醇）；聚乙二醇）；（4）用等渗溶液稀释；用等渗溶液稀释；（5）涂在能促细胞壁再生和进行细胞分裂的基本培养基上；涂在能促细胞壁再生和进行细胞分裂的基本培养基上；（6）用用影影印印平平板板法法将将形形成成的的菌菌落落接接种种到到各各种种选选择择性性培培养养基基平平板板上上，检验其是否为稳定的重组子；检验其是否为稳定的重组子；（7）测定其有关生

69、物学性状和生产性能。测定其有关生物学性状和生产性能。原原生生质质体体融融合合的的操操作作示示意意图图二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组主要方式：主要方式：有性杂交有性杂交准性杂交准性杂交原生质体融合（略）原生质体融合（略）转化（略）转化（略）真核微生物基因重组在有性繁殖过程中发生，真核微生物基因重组在有性繁殖过程中发生，当合子减数分裂时，两染色体发生交换。当合子减数分裂时，两染色体发生交换。（一）有性杂交（一）有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。体重组，并产生新遗传型后代的过程。 凡是能产生有性孢子的

70、酵母菌或霉菌，原凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。有性杂交方法进行育种。酵母菌的有性杂交育种酵母菌的有性杂交育种（一）酵母菌的（一）酵母菌的生活史生活史（二）酵母菌有性杂交技术（二）酵母菌有性杂交技术酵母菌有性杂交程序一般为酵母菌有性杂交程序一般为：亲本的单倍化亲本的单倍化有性杂交有性杂交杂交后代的检出杂交后代的检出筛选优良性状个体筛选优良性状个体S. Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞的比较的双倍体和单倍体细胞的比较项项 目目双倍体双倍体 单倍体单倍体细细 胞胞大，椭圆形大，椭圆形

71、小，球形小，球形菌菌 落落大，形态均一大，形态均一小，形态变化较多小，形态变化较多液体培养液体培养繁殖快，细胞较分散繁殖快，细胞较分散繁殖较慢，细胞常聚集成团繁殖较慢，细胞常聚集成团在产孢子培养基上在产孢子培养基上 形成子囊及子囊孢子形成子囊及子囊孢子不形成子囊不形成子囊定义和意义：定义和意义：类类似似于于有有性性生生殖殖但但更更原原始始的的生生殖殖方方式式，是是通通过过同同一一物物种种两两个个不不同同菌菌株株的的体体细细胞胞发发生生融融合合，不不经经过过减减数数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。为半知菌育种提供了一个重要手段。为半知菌育种提供了一个重

72、要手段。存在范围：存在范围：常见于一些真菌尤其是半知菌中常见于一些真菌尤其是半知菌中（二）准性生殖（二）准性生殖（parasexualhybridization）准性准性生殖的过程：生殖的过程：菌菌丝联结异核体形成（异核体形成（质配）配）核配形成核配形成杂合二倍体合二倍体体体细胞交胞交换和和单倍体倍体化化。准性生殖与有性生殖的比较准性生殖与有性生殖的比较 项项 目目 准性生殖准性生殖 有性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞参与接合的亲本细胞 形态相同的形态相同的 形态或生理上有形态或生理上有 体细胞体细胞 分化的性细胞分化的性细胞独立生活的异核体阶段独立生活的异核体阶段 有有 无无接合后双倍体细胞

73、形态接合后双倍体细胞形态 与单倍体与单倍体 与单倍体与单倍体 基本相同基本相同 明显不同明显不同双倍体变单倍体双倍体变单倍体的途径的途径 通过有丝分裂通过有丝分裂 通过减数分裂通过减数分裂接合发生的几率接合发生的几率 偶然发现，偶然发现， 正常出现，正常出现， 几率低几率低 几率高几率高准性杂交：准性杂交：选择亲本：选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本;强强制制异异合合：将将两两菌菌亲亲株株的的分分生生孢孢子子（106107）混混合合涂涂平平板板，并并做做各各单单亲亲本本对对照照，平平板板上上长长出出的的菌菌落落是是异异核核体体或或杂杂合合二二

74、倍体倍体;移单菌落：移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入纯化菌落，并将纯化后的菌落移入斜面斜面;验验稳稳定定性性：在在夹夹层层平平板板上上培培养养后后，再再倒倒上上一一层层+，再再培培养养后后若若出出现现大大量量新新菌菌落落，说说明明是是不不稳稳定定的的异异核核体体，反反之之是是杂杂合合二倍体二倍体;促促进进变变异异：用用诱诱变变剂剂进进行行处处理理，以以促促进进染染色色体体发发生生交交换换、染染色色体体在在子子细细胞胞分分配配不不均均、染染色色体体缺缺失失或或畸畸变变、点点突突变变等等，使使分离后的子代提高增加新性状的可能分离后的子代提高增加新性状的可能;筛选：筛选：通过一系列生产性壮的

75、测定。通过一系列生产性壮的测定。Penicillum urticae 的准性杂交步骤的准性杂交步骤第四节第四节基因工程基因工程 一、一、基因工程（遗传工程）基因工程（遗传工程）是是一一种种人人们们利利用用分分子子生生物物学学的的理理论论和和技技术术，自自觉觉设设计计、操操纵纵、改改造造和和重重建建细细胞胞的的遗遗传传核核心心基基因因组组，从从而而使使生生物物体体的的遗遗传传性性状状发发生生定定向向变变异异，以以最最大大限限度满足人类活动的需要的体外度满足人类活动的需要的体外DNA重组技术。重组技术。二、二、基基因因工工程程的的基基本本操操作作1、目的基因的取得、目的基因的取得2、优良载体的选择

76、、优良载体的选择3、目的基因与载体、目的基因与载体 DNA的体外重组的体外重组4、重组载体导入受体、重组载体导入受体 细胞细胞5、重组受体细胞的、重组受体细胞的 筛选和鉴定筛选和鉴定6、“工程菌工程菌”或或“工程工程 细胞细胞”的大规模培养的大规模培养三、三、基因工程的应用基因工程的应用1、在生产多肽类药物、疫苗中的应用、在生产多肽类药物、疫苗中的应用2、改造传统发酵菌种、改造传统发酵菌种3、动、植物特性的基因工程改良、动、植物特性的基因工程改良4、基因工程在环境保护中的应用、基因工程在环境保护中的应用一、菌种的衰退与复壮一、菌种的衰退与复壮二、菌种保藏二、菌种保藏第五节第五节 菌种的衰退、复

77、壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素：a a）变异变异b b）污染污染c c）死亡死亡一、菌种的衰退与复壮一、菌种的衰退与复壮1 1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。获得具有原有典型性状的菌种。2 2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选日常

78、的菌种维护工作中不断筛选“正变正变”个体。个体。大量群体中的自发突变大量群体中的自发突变（二）菌种的复壮（二）菌种的复壮a a）纯种分离纯种分离b b）通过寄主体进行复壮通过寄主体进行复壮（一）菌种衰退的特点（一）菌种衰退的特点（三）防止衰退的措施（三）防止衰退的措施1 1）减少传代次数减少传代次数2 2）创造良好的培养条件）创造良好的培养条件3 3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行 检查检查4 4）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法菌种菌种是一个国家所拥有的重要生物资源。是一个国家所拥有的重要生物资源。 菌种保藏菌种保藏是一项重要

79、的微生物学基础工作。是一项重要的微生物学基础工作。菌种保藏机构的任务是在广泛收集实验室和生产菌菌种保藏机构的任务是在广泛收集实验室和生产菌种、菌株种、菌株（包括病毒株甚至动、植物细胞株和质粒等）（包括病毒株甚至动、植物细胞株和质粒等）的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 为此，在国际上一些工业较发达的国家中都设有相为此，在国际上一些工业较发达的国家中都设有相应的菌种保藏机构。例如：应的菌种保藏机构。例如：中国微生物菌种保藏委员会（中国微生物菌种保藏委员会（CCCCMC

80、CCCM）美国典型菌种保藏中心（美国典型菌种保藏中心（ATCCATCC） 二、菌种保藏二、菌种保藏菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异: :( (原理原理) )首先首先要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次其次还要创造一个适合其长期休眠的环境条件，还要创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。护剂或酸度中和剂等。 在一定时间内使菌种不死、不变、不乱

81、在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：基本方法：生活态生活态休眠态休眠态培养基传代培养培养基传代培养寄主传代培养寄主传代培养冷冻冷冻干燥干燥斜面、平板斜面、平板液氮、低温冰箱液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥沙土管、冷冻真空干燥由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使

82、用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。致菌种的丧失。在我国，菌种保藏一般用以下方法进行：在我国，菌种保藏一般用以下方法进行： 固体培养基斜面上定期移植法（固体培养基斜面上定期移植法（44下保藏）；下保藏）； 石蜡油封藏法（室温下保藏）；石蜡油封藏法（室温下保藏）； 冷冻干燥保藏法（冷冻干燥保藏法（1010下保藏）；下保藏）； 砂土法保藏；砂土法保藏； 液体超低温

83、保藏法液体超低温保藏法 此外，对丝状真菌则另加麦麸皮法保藏等。此外，对丝状真菌则另加麦麸皮法保藏等。 在国际著名的美国在国际著名的美国ATCCATCC（American Type American Type Culture CollectionCulture Collection）中，目前已改为仅采用两）中，目前已改为仅采用两种最有效的方法，即保藏期一般达种最有效的方法，即保藏期一般达5 51515年的冷冻年的冷冻干燥保藏法和保藏期一般达干燥保藏法和保藏期一般达2020年以上的液氮保藏年以上的液氮保藏法，以达到最大限度地减少传代次数和避免菌种法，以达到最大限度地减少传代次数和避免菌种衰退的目的

84、。衰退的目的。 复习思考题：复习思考题：1、5、6、9、13、14、15、16、17、20、22、23、26、28。青霉素浓缩法培养基培养基( (含青霉素含青霉素) ) 接入敏感菌液接入敏感菌液 （含抗性突变株）（含抗性突变株）涂布涂布抗青霉素菌落抗青霉素菌落培养培养+A+B+C-D- 维甲缺陷型A-B-C+D+ 苏赖缺陷型接 合 及 其 发 现A+B+C+D+通通过过细细胞胞间间的的直直接接接接触触能能进进行行大大段段的的转转移移的的过过程程，叫叫接接合合异核体：异核体：同一菌同一菌丝有不同有不同遗传性状的核在同一性状的核在同一细胞胞质中生中生长。同核体：同核体：同一菌同一菌丝中只有一种核。

85、中只有一种核。异核体的特点：异核体的特点：1）具有感受性的两种菌）具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体；才可形成异核体；2）具有野生型性状，可在基本培养基上生）具有野生型性状，可在基本培养基上生长；（基因互（基因互补功能）功能）3）大多数异核体的分生）大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基子不能在基本培养基上生上生长；如能生；如能生长，则为异核体、或异核体、或为杂合合二倍体（重二倍体（重组子）。子）。（一）经典转化实验（一）经典转化实验（transformation）：）：F.Griffith研究对象：研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）（肺炎双球菌）SII

86、I型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性体细胞交换和单倍体化体细胞交换和单倍体化 杂合体合体细胞中有极少数胞中有极少数细胞核在胞核在进行有行有丝分裂的分裂的过程中，能程中，能发生体生体细胞染色体胞染色体间的交的交换、分离（、分离（单倍倍体化）而体化）而产生具有新性状的生具有新性状的单倍体倍体杂合子、双倍体及合子、双倍体及非整倍体。非整倍体。ABA+B（同核体）（同核体）（异核体）（异核体）AABBABAABB（杂合二倍体）合二倍体）单倍体倍体杂合子合子v1928年，年，Gri

87、ffith进行了以下几组实验：进行了以下几组实验：v（1）动物实验）动物实验对小鼠注射活对小鼠注射活RII菌或死菌或死SIII菌菌 小鼠存小鼠存活活v对小鼠注射活对小鼠注射活SIII菌菌小鼠死亡小鼠死亡v对小鼠注射活对小鼠注射活RII菌和热死菌和热死SIII菌菌 小鼠死小鼠死亡亡抽取心血抽取心血v 分离分离 活的活的SIII菌菌Griffith转化试验示意转化试验示意混合培养混合培养RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌SIII型热死菌型热死菌RII型活菌型活菌SIII型活菌型活菌健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死病死病死病死（2）细菌培养实验）细菌培养实验（

88、3）S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验以上实验说明：加热杀死的以上实验说明：加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型型细胞。细胞。热死热死SIII菌菌不生长不生长活活RII菌菌长出长出RII菌菌热死热死SIII菌菌长出大量长出大量RII菌和菌和106SIII菌菌活活R菌菌+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液长出大量长出大量R菌和少量菌和少量S菌菌+活活RII菌菌平皿培养平皿培养v加加S菌菌DNAv

89、加加S菌菌DNA及及DNA酶以外酶以外的酶的酶v加加S菌的菌的DNA和和DNA酶酶v加加S菌的菌的RNAv加加S菌的蛋白质菌的蛋白质v加加S菌的荚膜多糖菌的荚膜多糖活活R菌菌长出长出S菌菌只有只有R菌菌1944年年O.T.Avery、C.M.MacLeod和和M。McCarty从从热热死死S型型S.pneumoniae中中提提纯纯了了可可能能作作为为转转化化因因子子的的各各种种成成分分，并在离体条件下进行了转化试验：并在离体条件下进行了转化试验：只只有有S型型细细菌菌的的DNA才才能能将将S. pneumoniae的的R型型转转化化为为S型型。且且DNA纯纯度度越越高高，转转化化效效率率也也越

90、越高高。说说明明S型型菌菌株株转转移给移给R型菌株的，是遗传因子。型菌株的，是遗传因子。（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验vA. D. Hershey和和M. Chase， 1952年年（1）含）含32PDNA的一组：放射性的一组：放射性85%在沉淀中在沉淀中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含15%放射性放射性沉淀中含沉淀中含85%放射性放射性沉淀中含沉淀中含25%放射性放射性以以32S标标记记蛋蛋白白质质外外壳壳做做噬噬菌菌体体感感染染实

91、实验验v（2）含）含35S-蛋白质的一组：放射性蛋白质的一组：放射性75%在在上清液中上清液中10分钟后分钟后用捣碎器用捣碎器使空壳脱离使空壳脱离吸附吸附离心离心沉淀细胞进一步培沉淀细胞进一步培养后，可产生大量养后，可产生大量完整的子代噬菌体完整的子代噬菌体上清液中含上清液中含75%放射性放射性（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验v为了证明核酸是遗传物质，为了证明核酸是遗传物质，H.FraenkelConrat（1956）用含）用含RNA的烟草花叶病毒（的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。进行了著名的植物病毒重建实验。v将将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将

92、其蛋在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与白质外壳与RNA核心相分离。分离后的核心相分离。分离后的RNA在没有在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。选选用用TMV和和霍霍氏氏车车前前花花叶叶病病毒毒（HRV），分分别别拆拆分分取取得得各各自自的的RNA和和蛋蛋白白质质，将将两两种种RNA分分别别与与对对方方的的蛋蛋白白质质外外壳重建形成两种杂合病毒：壳重建形成两种杂合病毒： （1）RNA（TMV）蛋白质蛋白质（HRV）（2）RNA（HRV）蛋白质蛋白质（TMV）v用两种杂合病毒感染寄主：用两种杂合病毒感染寄主：（1）表现）表现TMV的典型症状病的典型症状病分离到正常分离到正常TMV粒子粒子（2）表现）表现HRV的典型症状病分的典型症状病分离到正常离到正常HRV粒子。粒子。v上述结果说明，在上述结果说明，在RNA病毒中，病毒中，遗传的物质基础也是核酸。遗传的物质基础也是核酸。MTVHRVHRVMTV