副溶血性弧菌检验规范操作程序副溶血性弧菌检验规范操作程序1;. 概 况概 况o副溶血性弧菌于副溶血性弧菌于1950年从日年从日o本一次迸本一次迸发性食物中毒中分性食物中毒中分别o发现该菌存在于近海的海水、菌存在于近海的海水、o海底堆海底堆积物和物和鱼类、、贝壳等海壳等海o产品中在37℃℃、、pH7.7、含、含o氯化化钠3～～4%的的环境中生境中生长最最o好主要引起食物中毒，尤以好主要引起食物中毒，尤以o日本、日本、东南南亚、美国及我国台、美国及我国台o北地域多北地域多见，也是我国大，也是我国大陆沿沿o海地域食物中毒中最常海地域食物中毒中最常见的一的一o种病原菌种病原菌2 3 4 范 围范 围o本规范规定了食品中副溶血性弧菌〔本规范规定了食品中副溶血性弧菌〔Vibrio parahaemolyticus〕的检验方法〕的检验方法o本规范适用于水产品及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验，其他食品可参照运用本规范适用于水产品及食物中毒样品中副溶血性弧菌的检验，其他食品可参照运用5 食品种类食品种类o动物性水产品：动物性水产品：o 鲜冻水产品〔定性检测〕：新颖水产品和冷冻水产品； 鲜冻水产品〔定性检测〕：新颖水产品和冷冻水产品；o 生食水产品〔定性、定量检测〕：新颖的、冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳 生食水产品〔定性、定量检测〕：新颖的、冷藏、冷冻的海水或淡水鱼类、甲壳类、贝壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以直接食用的。
类、贝壳类和软体动物等，未经腌制、加热，可以直接食用的 6 设备和资料设备和资料除微生物除微生物实验室常室常规灭菌及培育菌及培育设备外，其他外，其他设备和和资料如下：料如下：• 恒温培育箱：恒温培育箱：36 ℃℃±1℃℃• 冰箱：冰箱：2 ℃℃～～5 ℃℃• 均均质器及无菌均器及无菌均质袋、均袋、均质杯或杯或灭菌乳菌乳钵• 天平：天平： 感量感量0.1 g• 无菌无菌试管：管：18 mm×180mm、、15 mm×100 mm• 无菌吸管：无菌吸管：1 mL〔具〔具0.01 mL刻度〕、刻度〕、10 mL〔具〔具0.1 mL刻度〕或微量移液器及刻度〕或微量移液器及吸吸头• 无菌无菌锥形瓶：形瓶：500 mL、、250 mL• 无菌培育皿：直径无菌培育皿：直径90mm• VITEK全自全自动微生物微生物鉴定系定系统[1]• 灭菌手菌手术剪、剪、镊子7 样品制备样品制备• 非冷冻样品采集后应立刻置7℃～10℃冰箱保管，尽能够及早检验； 冷冻样品应在45 ℃以下不超越15 min或在2℃～5℃不超越18 h解冻； 假设样品需求冷冻储存，应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液〔液体样品应加双料〕，引荐储存温度为-70 ℃以下。
8 样品制备样品制备鱼类和头足鱼类和头足类动物取表类动物取表面组织、肠面组织、肠或鳃贝类或鳃贝类取全部内容取全部内容物，包括贝物，包括贝肉和体液；肉和体液；9 10 11 12 样品制备样品制备甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃13 14 样品制备样品制备o如为带壳贝类或如为带壳贝类或o甲壳类，那么应先在甲壳类，那么应先在o符合生活饮用水卫符合生活饮用水卫o生规范的流水中洗生规范的流水中洗o刷外壳并甩干外表刷外壳并甩干外表o水分，然后以无菌水分，然后以无菌o操作翻开外壳，按操作翻开外壳，按o上述要求取相应部上述要求取相应部o分15 样品制备样品制备 以无菌操作取检样 以无菌操作取检样25 g〔〔mL〕，参与〕，参与3％氯化钠碱性蛋白胨水％氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋，用旋转刀片式均质器以转刀片式均质器以8 000 r/min均质均质1 min，或拍击式均质器拍击，或拍击式均质器拍击2 min，制备，制备成成1:10的均匀稀释液如无均质器，那么将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在的均匀稀释液如无均质器，那么将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL的灭菌容器内，加的灭菌容器内，加225 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。
％氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡16 增菌增菌o定性定性检测o将上述将上述1:10稀稀释液于液于36 ℃℃±1 ℃℃培育培育8 h～～18 h17 增菌增菌o定量定量检测o用用灭菌吸管汲取菌吸管汲取1:10稀稀释液液1 mL，注入含有，注入含有9 mL 3％％氯化化钠碱性蛋白碱性蛋白胨水的水的试管内，振管内，振摇试管混匀，制管混匀，制备1:100的稀的稀释液o另取另取1 mL灭菌吸管，按上条操作依次制菌吸管，按上条操作依次制备10倍倍递增稀增稀释液，每液，每递增稀增稀释一次，一次，换用用1支支1mL灭菌吸管o根据食品根据食品卫生生规范要求或范要求或对检样污染情况的估染情况的估计，，选择三个延三个延续的适宜稀的适宜稀释度，每度，每个稀个稀释度接种度接种3支含有支含有9 mL 3％％氯化化钠碱性蛋白碱性蛋白胨水的水的试管，每管接种管，每管接种1 mL置置36 ℃℃±1 ℃℃恒温箱内，培育恒温箱内，培育8 h～～18 h18 分别分别o在一切在一切显示生示生长的的试管或增菌液中用接种管或增菌液中用接种环沾取一沾取一环，于，于TCBS平板或科平板或科玛嘉弧菌嘉弧菌显色培育基平板上划色培育基平板上划线分分别。
一支一支试管划管划线一一块平板于36 ℃℃±1 ℃℃培育培育18 h～～24 h19 运用运用TCBS琼脂划线不可密集琼脂划线不可密集20 分别分别o典型的副溶血性弧菌在典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈现为圆的、半透明的、外表光滑的绿色菌落，用上呈现为圆的、半透明的、外表光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2 mm～～3 mm从培育箱取出从培育箱取出TCBS平板后，应尽快〔不超越平板后，应尽快〔不超越1 h〕挑取菌落或标志要挑取的菌落典型的副溶血性弧〕挑取菌落或标志要挑取的菌落典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色培育基上呈现为圆的、半透明的、外表光滑的粉紫色菌落，直菌在科玛嘉弧菌显色培育基上呈现为圆的、半透明的、外表光滑的粉紫色菌落，直径径2 mm～～3 mm21 TCBS琼脂上面的副溶血性弧菌22 四种显色培育基四种显色培育基23 纯培育纯培育挑取挑取3个或个或以上的可疑以上的可疑菌落，划菌落，划线3％％氯化化钠胰蛋白胰蛋白胨大大豆豆琼脂平板，脂平板，36 ℃℃±1 ℃℃培育培育18 h～～24 h24 初步鉴定初步鉴定o氧化酶实验：挑选纯培育的单个菌落进展氧化酶实验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。
氧化酶实验：挑选纯培育的单个菌落进展氧化酶实验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性25 初步鉴定初步鉴定o涂片镜检：将可疑菌落涂片，进展革兰氏染色，镜检察看形状副溶血性弧菌为革兰涂片镜检：将可疑菌落涂片，进展革兰氏染色，镜检察看形状副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形状，无芽胞，有鞭毛氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形状，无芽胞，有鞭毛26 初步鉴定初步鉴定o挑取挑取纯培育的培育的单个可疑菌落，个可疑菌落，转种种3％％氯化化钠三糖三糖铁琼脂斜面并穿刺底脂斜面并穿刺底层，，36℃℃±1℃℃培育培育24h察看察看结果副溶血性弧菌在果副溶血性弧菌在3％％氯化化钠三糖三糖铁琼脂中的反响脂中的反响为底底层变黄不黄不变黑，无气泡，斜面黑，无气泡，斜面颜色不色不变或或红色加深，有色加深，有动力27 TSA＋＋TTC可以方便察看副溶血性弧菌动力可以方便察看副溶血性弧菌动力28 初步鉴定初步鉴定o嗜嗜盐性性实验：挑取：挑取纯培培o养的养的单个可疑菌落，分个可疑菌落，分别o接种于不同接种于不同氯化化钠浓度的度的o胰胰胨水中，水中，36℃℃±1℃℃培培o养养24h，察看液体混，察看液体混浊情情o况副溶血性弧菌在无况。
副溶血性弧菌在无氯o化化钠和和10％％氯化化钠的胰的胰胨o水中不生水中不生长或微弱生或微弱生长，，o在在7％％氯化化钠的胰的胰胨水中水中o生生长旺盛29 确定鉴定确定鉴定o生化生化实验：分：分别接种含接种含3％％氯化化钠o的甘露醇、的甘露醇、赖氨酸、氨酸、MR-VP培育基，培育基，o36℃℃±1℃℃培育培育24h～～48h后察看后察看结o果隔夜培育物果隔夜培育物进展展ONPG实验30 MR-VP实验实验31 ONPG实验实验32 确定鉴定确定鉴定oAPI20E生化鉴定试剂盒或生化鉴定试剂盒或VITEK：刮取：刮取3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，运用单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，运用API20E生化鉴定试剂生化鉴定试剂盒或盒或VITEK鉴定33 生化特性生化特性o分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖分解葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖oH2S﹙－－﹚、、V-P﹙－－﹚、动力〔＋〕动力〔＋〕o甘露醇〔＋〕、赖氨酸〔＋〕、甘露醇〔＋〕、赖氨酸〔＋〕、ONPG〔－〕34 35 36 报 告报 告o当检出的可疑菌落生化学性状符合表当检出的可疑菌落生化学性状符合表1要求时，可以报告检出副溶血性弧菌。
假设要求时，可以报告检出副溶血性弧菌假设进展定量检测，根据证明为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查进展定量检测，根据证明为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告检索表，报告g〔〔mL〕副溶血性弧菌的〕副溶血性弧菌的MPN值37 可 选 项可 选 项o血清型分型：血清型分型：O抗原，抗原，K抗原抗原o神奈川实验：是在我妻氏琼脂上测试能否存在特定溶血素该实验阳性结果与副溶神奈川实验：是在我妻氏琼脂上测试能否存在特定溶血素该实验阳性结果与副溶血性弧菌分别株的致病性显著相关血性弧菌分别株的致病性显著相关38 39 。